Directed Evolution of an Fe(II)-Dependent Halogenase for Asymmetric C(sp3)-H Chlorination

Within this thesis, the chlorinase Wi-WelO15 from Westiella intricata UH strain HT-29-1 was explored for its evolvability towards non-natural substrates and its biocatalytic applicability. Organohalogens play an important role as pharmaceuticals and agricultural chemicals or synthetic intermediates. However selective aliphatic chlorination under mild and non-hazardous conditions at complex molecules is still a formidable challenge in chemical and enzymatic catalysis. A new class of aliphatic halogenases, which carries a great potential as useful biocatalysts for late stage chlorination, was discovered in 2014. The enzyme class belongs to a big superfamily of non-heme iron oxygenases. A previously found subclass of aliphatic halogenases are dependent on an acyl-carrier protein, in contrast to that, the new subclass is able chlorinate freestanding substrates. Synthetic methods, available to chemists, can be imagined as a toolbox which is used to create molecules of interest. If this class of halogenases can be engineered to chlorinate selectively non-natural substrates and can be produced and used under convenient conditions in the lab, they can be added to the synthesis toolbox enabling late-stage chlorination at complex molecules. Within this thesis, Wi-welO15 and Hw-welO15 (from Hapalosiphon welwitschii UH IC-52-3) were amplified from genomic DNA, and inserted into a high copy plasmid, resulting in great amounts of 60-80 mg enzyme/L expression culture by heterologous expression in E. coli. Purification of the halogenase was achieved by immobilized metal affinity chromatography and if necessary, also size exclusion chromatography. Crystallization of the starting variant Wi-0 for directed evolution was achieved and a structure of the enzyme could be solved by molecular replacement. To test the evolvability of the halogenases towards non-natural substrates, a lead molecule was chosen that contains a ketone instead of the naturally occurring isonitrile functionality, which was not converted by both halogenases, with initial reaction conditions. First random mutagenesis of Hw-WelO15, based on a model created by SwissModel, was pursued while no structural information was available. After we solved the structure of Wi-0, directed evolution via semi-rational and rational mutagenesis was applied to evolve the halogenase in 4 generations to accept the chosen lead molecule. A panel of chlorinases was tested as lysates as well as isolated enzymes. Hereby the best variants revealed up to 87% product formation under optimized conditions while <1% product formation was present with Wi-0. Modifications at the lead structure were partially accepted and in total five non-natural substrates were chlorinated with >99.9% regio- and diastereoselectivity and chemoselectivities of up to 96-99%. In addition, transformation of a range of seven substrates were transformed into complex mixtures of novel products. Hydroxylation by aliphatic halogenases is described, if non-native substrates are used. One variant found in the directed evolution already has a decreased chlorination selectivity and produces 32% hydroxylated side product. With the goal to increase the hydroxylation selectivity, several variants were created. Because these catalysts completely lost their activity, instead the monooxygenase P450BM3 was used to produce four new, oxygenated products of the lead structure. Our discovered halogenases from different states of the engineering process were characterized for their kinetic properties, revealing that the best variant Wi-12 has a 93-fold improvement in comparison to Wi-2, which has the lowest measurable kcat/Km . The two variants with highest product formation each have their own kinetic profile. While Wi-11 is most active with a kcat of 0.64 min-1, Wi-12 has the lowest Km of 20 μM for the lead substrate. Furthermore, the stability of the halogenases was examined and stabilized variants proposed by the PROSS server created. As read out, melting temperatures were determined revealing a high thermal stability for the wild types with Tm of 62 °C for Hw-WelO15 and 54 °C for Wi- WelO15. Created variants generally showed an improve in thermal stability and combination of stability with activity improving mutations resulted in a melting temperature of 61 °C for Wi-5P3. Incubation of purified enzymes in buffer at different temperatures with subsequent SDS-PAGE analysis showed that after incubation at 65 °C for 4 h, still soluble enzyme of the stabilized variants remains. Activity assays at increased temperatures or solvent ratios, showed a residual activity of 90% at 45 °C with Wi-5P3 and 85% residual activity in the presence of 5% ethanol

Die städtebaulichen Planungen zu Wolgast im Spannungsfeld zwischen Engagement und Auftrag

Wissenschaftliches Kolloquium vom 18. bis 21. Juni 1992 in Weimar an der Hochschule für Architektur und Bauwesen zum Thema: ‚Architektur und Macht

Влияние машиностроительных производств на окружающую среду

В данной работе приведены данные по выбросам опасных веществ в окружающую среду машиностроительными производствами. Проведён анализ влияния различных факторов, сопутствующих деятельности машиностроительных предприятий в России, на окружающую среду. Дана сравнительная характеристика выбросов в зависимости от вида машиностроительного производства.This paper presents data on emissions of hazardous substances into the environment from engineering industry; The analysis of the impact of various factors that are related to the activities of engineering enterprises in Russia on the environment. Comparative characterization of emissions depends on the form of machine-building production

Bodenschutz und Bodenbewusstsein: Aktivitäten in den Bundesländern (und beim Bund)

Die Förderung des Bodenbewusstseins ist eine seit langem anerkannte zentrale Aufgabe des Bodenschutzes. So ist die „Sensibilisierung“ für Bodenthemen eine der Säulen der Europäischen Bodenschutzstrategie. Eine vom ständigen Ausschuss „Bodenschutz Vorsorge“ (BOVA) der Bund/Länder-arbeitsgemeinschaft Boden¬schutz (LABO) zusammengestellte Übersicht von Aktivitäten zeigt, dass diese Aufgabe auch seitens der zuständigen Behörden in den Bundesländern zunehmend wahr genommen wird

Spray combustion diagnostics with tracer-based laser-induced fluorescence imaging

Um die Vorgänge bei der Verbrennung in modernen Motorentypen, wie z.B dem direkteinspritzenden Benzinmotor, besser verstehen und optimieren zu können, haben sich in den letzten Jahren berührungsfreie, laserbasierte Diagnostik-Methoden als besonders vielseitig und hilfreich erwiesen. Die meisten Motorenentwickler benutzen heutzutage bei ihrer Arbeit optische Messtechniken. Um jedoch sicherzustellen, dass diese Methoden genaue und zuverlässige Ergebnisse liefern, ist es nötig, sie genau zu überprüfen und zu charakterisieren. In dieser Arbeit werden eine Reihe von optischen Diagnostiktechniken für die Sprayanalyse, die auf dem Prinzip der laserinduzierten Fluoreszenz (LIF) von Tracern basieren, auf ihre Anwendbarkeit und ihre Grenzen hin untersucht. Die Methoden wurden dazu auf unterschiedliche Spraysysteme angewendet: Von der Anwendung in einzelnen Tropfen über Modelsprays bis hin zu Kraftstoffsprays in Versuchsmotoren. Tracer-LIF basiert auf fluoreszierenden Substanzen, die dem Kraftstoff in geringen Mengen beigemischt werden. Deren Fluoreszenzeigenschaften werden dazu verwendet, lokale Größen wie Tropfentemperatur, -größe oder -geschwindigkeit mit hoher Zeitauflösung zu messen. Aus diesen Größen können wichtige Schlüsse über Wärmeund Stofftransportprozesse, die bei der Sprayverbrennung ablaufen, gezogen werden. Jedoch müssen die Eigenschaften der Tracer dazu sehr genau bekannt sein, um verwendbare und vergleichbare Ergebnisse zu garantieren. In dieser Arbeit wurden Tracer im Hinblick auf ihre Verdampfungseigenschaften und die Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenzeigenschaften charakterisiert. Außerdem wurden die Farbstoffe Atto 680, Rhodamin 800 und Rhodamin B auf ihre Anwendbarkeit als Tracer in realen Kraftstoffen untersucht. Gepulste Lasersysteme und hochauflösende CCD oder CMOS-Kameras erlauben die detaillierte und zeitlich wie räumlich hochaufgelöste Untersuchung der Sprayentstehung, -verdampfung und -verbrennung mit Hilfe von Tracer-LIF. Durch Verwendung der sogenannten Laser-Lichtschnitt-Methode können die Signale in zweidimensionalen Schnittebenen simultan erfasst werden. Die Anwendung der zuvor charakterisierten Tracer auf eine Modell-Sayflammen erlaubte durch Vergleich mit den Ergebnissen neuer numerischer Spraymodelle, welche die Flammenchemie über einen Flameletansatz berücksichtigen, neue Einblicke ich diese Vorgänge. Um die Verdampfung eines einzelnen Tropfens zu untersuchen, wurde darüber hinaus eine elektrodynamische Falle konstruiert und aufgebaut, die geladene Tropfen in einem Hochfrequenzfeld über längere Zeit festhalten kann. Die Heizung der Tropfen erfolgte durch einen CO2-Laser. Der Vergleich mit einem neuen Tropfenverdampfungsmodell, das diese Bedingungen berücksichtigt, lieferte vielversprechende Ergebnisse In einem Versuchsmotor mit Benzin-Direkteinspritzung konnte außerdem die Wechselwirkung zwischen Kraftstoffspray und Zündkerze, die Beeinflussung des Zündfunkens, sowie die Auswirkungen von Schwankungen im Spraywinkel während der Einspritzung untersucht werden, was Aufschlüsse über die möglichen Ursachen von Fehlzündungen und unvollständiger Verbrennung lieferte. Laserinduzierte Exciplex- Fluoreszenz lieferte, zur weiteren Untersuchung dieses Sachverhalts, quantitative Informationen über die räumliche Verteilung des zündfähigen Gemischs bei verschiedenen Benzininjektoren unter variierenden Bedingungen

“Hit First, Hit Hard and Keep on Hitting”. Ildledelse i den britiske og tyske flåde under Første Verdenskrig

Artiklen giver den første tilgængelige beskrivelse af den tyske flådes ildledelsessystem under Første Verdenskrig. Den analyserer og vurderer den britiske og tyske flådes ildledelseserfaringer med fokus på Jyllandsslaget. Konklusionen er, at den altovervejende beskrivelse i engelsproget litteratur af det britiske ildledelsessystem som værende overlegent er uden grundlag og derfor misvisende. Det tyske ildledelsessystem besad - hovedsagelig på grund af væsentlig højere grad af systemintegration - en overlegen operationel kapacitet under de meget vanskelige sigtbarhedsforhold i Nordsøen

Landschaft erzählt Geschichte: ein Beispiel aus Hohnhorst im Landkreis Schaumburg in Niedersachsen.

Die Ortschaft Hohnhorst im Landkreis Schaumburg hat eine lange Geschichte. Dass Menschen hier schon lange leben und ihre Umwelt prägen, wurde durch den Fund eines eisenzeitlichen Urnengräberfeldes im Jahr 2011 noch einmal ins Bewusstsein gerufen. Von der 2500-jährigen Landschaftsgeschichte lässt sich heute in der Landschaft nicht viel auf den ersten Blick erkennen. Ziel dieser Arbeit war es, ein Konzept zur Vermittlung der Kulturlandschaftsgeschichte am eisenzeitlichen Gräberfeld in Hohnhorst zu entwickeln. Dazu wurde zunächst durch Experteninterviews, Vor-Ort-Besuchen, Literaturrecherchen und Archivbesuchen Wissen über die Landschaftsgeschichte Hohnhorsts gesammelt. Außerdem wurden Spuren dieser Landschaftsgeschichte gesucht, die sich noch heute dort finden lassen. Daraus wurde ein Vermittlungskonzept entwickelt, das ausgewählte Epochen und Themen beinhaltet und sich an eine interessierte Zielgruppe richtet. Eine dazu passende Vermittlungsmethode wurde ausgearbeitet. Teil dieser Arbeit waren auch Überlegungen zur Umsetzung und Finanzierung eines solchen Vermittlungskonzeptes. Im Laufe dieser Arbeit hat sich die Vermittlungsmethode über einen Audiorundgang als die geeignetste erwiesen. Der Audioguide kann bei einem Spaziergang auf einer festgelegten Route in und um Hohnhorst gehört werden. Zugängig ist dieser über die Plattform izi.Travel und somit kostenlos von allen über ein Smartphone hörbar. Der Audiorundgang beginnt mit der Epoche der Eisenzeit an der Fundstelle des eisenzeitlichen Urnengräberfeldes. Er verläuft in der Abfolge der Epochen bis zur heutigen Zeit durch und um Hohnhorst und endet schließlich wieder an der Anfangsstelle. Der 6,5 km lange Spaziergang dauert etwa ein bis zwei Stunden. Der Audioguide wurde wie ein Gespräch zwischen zwei Menschen aufgebaut, die durch die Landschaft laufen und sich über diese unterhalten. Wenn möglich, wurde sich auf eine Spur der Landschaftsgeschichte bezogen, die heute in der Landschaft sichtbar ist. Diese wurde benannt und sowohl Hintergrundwissen zu dieser Spur vermittelt als auch darauf verwiesen, wie es an der Stelle früher ausgesehen hätte. Die Audiotexte wurden an das Prinzip der Landschaftsinterpretation nach Ludwig angelehnt. Um die Menschen auf den Audiorundgang aufmerksam zu machen wurde eine Hinweistafel entwickelt, die am Anfang des Rundganges aufgestellt werden sollte.The village of Hohnhorst in the district of Schaumburg has a long history. The fact that people have lived here for a long time and shaped their environment was once again brought to mind by the discovery of an Iron Age urn burial ground in 2011. Not much of the 2500-year history of the landscape can be seen at first glance in the landscape today. The aim of this work was to develop a concept for communicating the cultural landscape history around the Iron Age cemetery in Hohnhorst. To this end, knowledge about the landscape history of Hohnhorst was collected through expert interviews, on-site visits, literature research and archive visits. In addition, traces of this landscape history were sought that can still be found there today. From this, a mediation concept was developed that includes selected epochs and topics and is aimed at an interested target group. A suitable mediation method was worked out. Part of this work was also to consider the implementation and financing of such an educational concept. In the course of this work, an audio tour proved to be the most suitable method. The audio guide can be listened to during a walk along a fixed route in and around Hohnhorst. It is accessible via the izi.Travel platform and can thus be heard free of charge by anyone with a smartphone. The audio tour begins with the Iron Age epoch at the site of the Iron Age urn burial ground. It runs through and around Hohnhorst in the sequence of epochs up to the present day and finally ends back at the starting point. The 6.5 km walk takes about one to two hours. The audio guide was set up like a conversation between two people walking through and talking about the landscape. Where possible, reference was made to a trace of landscape history that is visible in the landscape today. This trace was named and background knowledge about it was given as well as a reference to how it would have looked in the past. The concept of the audio texts were inspired on the principle of landscape interpretation according to Ludwig. To draw people's attention to the audio tour, a sign was developed to be placed at the beginning of the tour

Cross-border bank lending, risk aversion and the financial crisis

This study investigates the determinants of adjustments in the provision of cross-border loans by internationally active banks. For the period from 2002 to 2010, we look at quarterly transaction data (excluding valuation effects) on long-term loans issued by the largest 69 German banking groups to the private sector of 66 countries. We show that the parent bank's lending adjustment is based almost exclusively on supply-side determinants, in particular on bank-specific factors. However, foreign countries' demand and risk characteristics become more relevant when loans are distributed by banks' affiliates located abroad. Focusing on risk measures such as the parent bank's ratio of Tier I capital to risk-weighted assets, we find that rising risk aversion among banks curbed cross-border lending during the financial crisis, especially at a later stage following the collapse of Lehman Brothers. However, we find a threshold at around 11% of the Tier I capital ratio above which an increase in the ratio does not curb lending anymore. --cross-border lending,banks,financial crisis