Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8+ and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo

Objective: Therapeutically targeting lymphocyte adhesion is of increasing relevance in IBD. Yet, central aspects of the action of anti-adhesion compounds are incompletely understood. We investigated the role of αEβ7 and α4β7 integrins and their blockade by vedolizumab and etrolizumab for trafficking of IBD T lymphocytes in an in vivo model of homing to and retention in the inflamed gut. Design: We explored integrin expression in IBD patients by flow cytometry and immunohistochemistry, while regulation of integrins was studied in T cell cultures. The functional relevance of integrins was assessed by adhesion assays and a recently established humanized mouse model in DSS-treated immunodeficient mice. Results: High expression of αEβ7 was noted on CD8+ and CD4+ Th9 cells, while α4β7 was expressed on CD8+, Th2 and Th17 cells. TCR stimulation and TGF-β were key inducers of αEβ7 on human T cells, while butyric acid suppressed αEβ7. In comparison to α4β7 blockade via vedolizumab, blockade of β7 via etrolizumab surrogate antibody superiorly reduced colonic numbers of CD8+ and Th9 cells in vivo after 3 hours, while no difference was noted after 0.5 hours. AEβ7 expression was higher on CD8+ T cells from IBD patients under vedolizumab therapy. Conclusion: AEβ7 is of key relevance for gut trafficking of IBD CD8+ T cells and CD4+ Th9 cells in vivo and mainly retention might account for this effect. These findings indicate that blockade of αEβ7 in addition to α4β7 may be particularly effective in intestinal disorders with expansion of CD8+ and Th9 cells such as IBD

Nr4a1-dependent non-classical monocytes are important for macrophage-mediated wound healing in the large intestine

IntroductionMacrophages play an important role in intestinal wound healing. However, the trajectories from circulating monocytes to gut macrophages are incompletely understood.MethodsTaking advantage of mice depleted for non-classical monocytes due to deficiency for the transcription factor Nr4a1, we addressed the relevance of non-classical monocytes for large intestinal wound healing using flow cytometry, in vivo wound healing assays and immunofluorescence.ResultsWe show that wound healing in Nr4a1-deficient mice is substantially delayed and associated with reduced peri-lesional presence of macrophages with a wound healing phenotype.DiscussionOur data suggest that non-classical monocytes are biased towards wound healing macrophages. These insights might help to understand, how targeting monocyte recruitment to the intestine can be used to modulate intestinal macrophage functions

Case Report: IBD-like colitis following CAR T cell therapy for diffuse large B cell lymphoma

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy has become a new mainstay in the treatment of several hematologic malignancies, but the spectrum of associated complications is still incompletely defined. Here, we report the case of a 70-year-old female patient treated with tisagenlecleucel for diffuse large B cell lymphoma (DLBCL), who developed chronic diarrhea with characteristics of inflammatory bowel disease (IBD)-like colitis. CAR T cells were substantially enriched in the colon lamina propria and other diagnoses were ruled out. Thus, we conclude that IBD-like colitis in this patient was associated to CAR T cell therapy and needs to be considered as a rare potential complication

The α4β1 homing pathway is essential for ileal homing of Crohn's disease effector T cells in vivo

The precise mechanisms controlling homing of T effector (Teff) cells to the inflamed gut in Crohn’s disease (CD) are still unclear and clinical outcome data from inflammatory bowel disease (IBD) patients treated with the anti-α4β7 integrin antibody vedolizumab suggest differences between ulcerative colitis (UC) and CD. Methods: Expression of homing molecules was studied with flow cytometry and immunohistochemistry. Their functional role was investigated in in vitro adhesion assays and in a humanized mouse model of T cell homing to the inflamed gut in vivo. Results: Despite in vitro blockade of CD Teff adhesion to MAdCAM-1 and in contrast to previous oberservations in UC, anti-α4β7 treatment did not result in reduced Teff cell homing to the gut in vivo. However, the integrin α4β1 was expressed in higher levels on Teffs from CD patients compared with controls, while its expression in the peripheral blood declined and its expression in the intestine increased during the course of clinical vedolizumab treatment. Consistently, adhesion of CD Teffs to VCAM-1 was blocked by inhibition of α4 and α4β1 in vitro. Moreover, in vivo homing of CD Teffs to the inflamed ileum was reduced by inhibition of α4 and α4β1 integrins, but not α4β7 integrins. Conclusions: Our findings suggest that Teff cell homing to the ileum via the axis α4β1 – VCAM-1 is an essential and non-redundant pathway in CD in vivo possibly affecting efficacy of clinical treatment with anti-adhesion compounds

Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo

Objective: Gut homing of lymphocytes via adhesion molecules has recently emerged as new target for therapy in inflammatory bowel diseases. We aimed to analyze the in vivo homing of effector (Teff) and regulatory (Treg) T cells to the inflamed gut via α4β7 and GPR15. Design: We assessed the expression of homing receptors on T cells in peripheral blood and inflamed mucosa. We studied the migration pattern and homing of Teff and Treg cells to the inflamed gut using intravital confocal microscopy and FACS in a humanized mouse model in DSS-treated NSG (NOD.Cg-Prkdcscid-Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice. Results: Expression of GPR15 and α4β7 was significantly increased on Treg rather than Teff cells in peripheral blood of patients with ulcerative colitis (UC) as compared to Crohn´s disease and controls. In vivo analysis in a humanized mouse model showed augmented gut homing of UC Treg cells as compared to controls. Moreover, suppression of UC (but not control) Teff and Treg cell homing was noted upon treatment with the α4β7 antibody vedolizumab. In contrast, siRNA blockade of GPR15 had only effects on homing of Teff cells but did not affect Treg homing in UC. Clinical vedolizumab treatment was associated with marked expansion of UC Treg cells in peripheral blood. Conclusion: α4β7 rather than GPR15 is crucial for increased colonic homing of UC Treg cells in vivo, while both receptors control UC Teff homing. Vedolizumab treatment impairs homing of UC Treg cells leading to their accumulation in peripheral blood with subsequent suppression of systemic effector T cell expansion

Cellular Mechanisms of Etrolizumab Treatment in Inflammatory Bowel Disease

Background: Anti-integrin therapy is a new frontline strategy in the treatment of inflammatory bowel diseases (IBD). The anti-β7 integrin antibody etrolizumab is currently being investigated for safety and efficacy in Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) in several phase III trials. Mechanistically, etrolizumab is known to block β7 integrin ligand binding and reduces intestinal trafficking of β7-expressing cells. Etrolizumab blocks β7 integrin ligand binding and reduces β7-positive lymphocyte migration and retention in the inflamed gut mucosa, but the exact mechanisms by which this inhibition occurs are not fully understood.Methods: Cellular effects of etrolizumab or etrolizumab surrogate antibody (etrolizumab-s) were investigated in cell culture models and analyzed by flow cytometry, fluorescence microscopy, ImageStream®, stimulated emission depletion (STED) microscopy and functional dynamic in vitro adhesion assays. Moreover, effects on α4β7 integrin were compared with the pharmacodynamically similar antibody vedolizumab.Results: As demonstrated by several different approaches, etrolizumab and etrolizumab-s treatment led to internalization of β7 integrin. This resulted in impaired dynamic adhesion to MAdCAM-1. Internalized β7 integrin localized in endosomes and re-expression of β7 was dependent on de novo protein synthesis. In vitro etrolizumab treatment did not lead to cellular activation or cytokine secretion and did not induce cytotoxicity. Internalization of α4β7 integrin was increased with etrolizumab compared with vedolizumab.Discussion: Our data suggest that etrolizumab does not elicit secondary effector functions on the single cell level. Integrin internalization may be an important mechanism of action of etrolizumab, which might explain some but not all immunological effects observed with etrolizumab

Das Migrationsverhalten intestinaler Epithelzellen bei chronischer Entzündung: Einfluss und Interaktionen von K+-Kanälen und EGFr

Die Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist nach wie vor nur unzureichend verstanden. Als gesichert gilt jedoch, dass an ihrer Entstehung und Unterhaltung eine genetische Prädisposition verbunden mit einer Störung der epithelialen Permeabilität des Darmes und einer fehlregulierten Immunantwort auf translozierte – insbesondere bakterielle – Antigene beteiligt sind. Sowohl primär als auch sekundär können auch kleine, rein epitheliale Wunden zur gestörten epithelialen Barriere bei CED beitragen. Solche Epithelläsionen werden durch einen Restitution genannten Vorgang wieder geschlossen, der vorwiegend durch Migration von am Wundrand liegenden Zellen auf das Wundareal geprägt ist. Bei der Zellmigration handelt es sich um einen komplexen Prozess, im Laufe dessen sich die migrierende Zelle polarisiert und abwechselnd die Zellfront vorschiebt und den Zellschwanz nachzieht. Zahlreiche Regulationsmechanismen beeinflussen den Ablauf von Restitution bzw. Migration. Unter anderem sind daran auch Kaliumkanäle sowie vom epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFr) ausgehende Signalkaskaden beteiligt. Vorrangiges Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, in zwei Migrationsassays die Regulation der intestinalen epithelialen Restitution unter nicht entzündlichen sowie entzündlichen Bedingungen durch verschiedene Kaliumkanäle und durch epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) zu untersuchen. Des Weiteren wurde mittels Western Blot (WB)-Experimenten versucht, bestimmte intrazelluläre Signalkaskaden als Vermittler der gefundenen Effekte zu identifizieren. Schließlich wurde aus intestinalen Epithelzellen (IEC) von Patienten mit CED sowie von Kontrollpatienten mRNA isoliert und die Expression des Kaliumkanals KCa3.1 gemessen. Die intestinale Restitution bzw. Migration wurde anhand der aus der Ratte stammenden, nicht transformierten Zelllinie IEC 18 in scratch assays sowie Boyden-Kammer assays untersucht. In den scratch assays konnte eine Steigerung der Zellmigration durch Hemmung der kalziumabhängigen Kaliumkanäle KCa3.1 und KCa1.1 sowie eine Reduktion der Migration durch Aktivierung von KCa3.1 gezeigt werden. Die Hemmung anderer Kaliumkanäle zeigte keinen Effekt. Zusätzliche Zugabe von EGF konnte die KCa3.1- und KCa1.1-abhängig gesteigerte Wundheilung nicht weiter steigern. Entzündliche Bedingungen wurden durch 24-stündige Vorinkubation der Zellen mit IFN-γ simuliert. KCa3.1-Blockade führte unter diesen Umständen zu einer Reduktion der Restitution. Die Zugabe von EGF hob dies jedoch wieder auf und steigerte die KCa3.1-abhängige Migration auf Werte wie sie unter nicht entzündlichen Bedingungen gemessen wurden. Auch in Boyden Kammer-assays war unter nicht entzündlichen Bedingungen die Zellmigration durch KCa3.1-Hemmung gesteigert, während entzündliche Bedingungen zum gegenteiligen Effekt führten. Aufgrund dieser Daten ist eine gegensätzliche Regulation der intestinalen epithelialen Restitution unter nicht entzündlichen bzw. entzündlichen Bedingungen wahrscheinlich. Zudem kann eine Beteiligung EGFr-abhängiger Signalwege am Regulationsmechanismus vermutet werden. Mittels WB wurde die Phosphorylierung von PKB/Akt und ERK bis acht Stunden nach Verwundung in Abhängigkeit von Kaliumkanalmodulatoren und/oder EGF unter nicht entzündlichen und entzündlichen Bedingungen gemessen. Während die ERK-Phosphorylierung kaum verändert war und die Effekte auf die Restitution nicht erklärt, führte KCa3.1-Inhibition unter nicht entzündlichen, nicht aber unter entzündlichen Bedingungen zu einer nach zwei Stunden signifikant erhöhten Akt-Phosphorylierung. Zusätzliche Zugabe von EGF konnte den Wert unter nicht entzündlichen Bedingungen nicht weiter anheben, jedoch unter entzündlichen Bedingungen die Phosphorylierung signifikant steigern. Wie durch Gegenüberstellung der Akt-Phosphorylierung nach zwei Stunden mit dem Wachstumsverlauf in den scratch-assays sowie durch statistische Analysen gezeigt werden konnte, besteht bei KCa3.1-Hemmung über alle Konstellationen hinweg eine sehr starke und signifikante Korrelation zwischen der Akt-Phosphorylierung und der Zellmigration in den scratch-assays 60-240 Minuten nach Verwundung. In diesem Zeitraum werden auch die höchsten Wundschlussraten gemessen. Diese Daten legen nahe, dass tatsächlich EGFr-abhängige Signalwege an der Vermittlung der Effekte von KCa3.1-Inhibition auf die intestinale Zellmigration beteiligt sind und der PI3K-Signalweg mit Akt als zentraler Kinase hierbei eine Schlüsselrolle einnimmt. Aus OP-Resektaten und endoskopischen Biopsien von Patienten mit CED sowie von Kontrollpatienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) oder Sigmadivertikulitis (SD) wurde mRNA isoliert und im TaqMan® die Expression von KCa3.1 sowie Kv7.1 bestimmt. Sowohl bei Colitis ulcerosa (CU) als auch bei Morbus Crohn (MC) war die Expression von KCa3.1, nicht aber von Kv7.1 gegenüber beiden Kontrollgruppen gesteigert. Wurde für MC nach Proben aus makroskopisch entzündeter und makroskopisch nicht entzündeter Schleimhaut unterschieden, so ließ sich eine vermehrte Expression nur für entzündete Bereiche nachweisen. Im Hinblick auf die Wundheilung unter entzündlichen Bedingungen könnte dies Ausdruck einer kompensatorischen Mehrexpression des Kanals sein und unterstreicht, dass KCa3.1 und die Regulation der intestinalen Restitution durch diesen Kaliumkanal auch klinisch relevant sein können. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit also eine gegensätzliche Regulation der KCa3.1-abhängigen intestinalen epithelialen Wundheilung unter normalen und entzündlichen Bedingungen gezeigt werden, die vermutlich durch von EGFr ausgehende Signalkaskaden, namentlich PKB/Akt, vermittelt wird. Weitergehende Untersuchungen sind notwendig, um mithilfe dieser Erkenntnisse mögliche therapeutische Anwendungen zu entwickeln

Integrating Immunologic Signaling Networks: The JAK/STAT Pathway in Colitis and Colitis-Associated Cancer

Cytokines are believed to be crucial mediators of chronic intestinal inflammation in inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Many of these cytokines trigger cellular effects and functions through signaling via janus kinase (JAK) and signal transducer and activator of transcription (STAT) molecules. In this way, JAK/STAT signaling controls important events like cell differentiation, secretion of cytokines or proliferation and apoptosis in IBD in both adaptive and innate immune cells. Moreover, JAK/STAT signaling, especially via the IL-6/STAT3 axis, is believed to be involved in the transition of inflammatory lesions to tumors leading to colitis-associated cancer (CAC). In this review, we will introduce the main cellular players and cytokines that contribute to pathogenesis of IBD by JAK/STAT signaling, and will highlight the integrative function that JAK/STATs exert in this context as well as their divergent role in different cells and processes. Moreover, we will explain current concepts of the implication of JAK/STAT signaling in CAC and finally discuss present and future therapies for IBD that interfere with JAK/STAT signaling