Towards vitamin biofortification in maize through multigene engineering

El component principal del meu programa de investigació ha estat un anàlisi detallat, a nivell molecular i bioquímic de plantes de blat de moro que provenien de creuaments amb parentals de fons genètics diferents. Els parentals van ser millorats genèticament amb transgens que codificaven per a las rutes metabòliques dels carotenoids, cetocarotenoids i vitamina E. Vaig iniciar la meva recerca introduint una mini-ruta metabòlica carotenogènica en línies pures de blat de moro de color groc que contenien perfiles variats de carotenoids. El resultat va ser l’obtenció d’una col•lecció de blats de moro híbrids amb unes concentracions de carotenoids més elevades que els parentals originaris. Les anàlisis transcriptòmiques i metabòliques dels nous híbrids van mostrar limitacions en passos específics de les ramificacions ε i β de la ruta dels carotenoids. La conclusió més important va esser que aquestes plantes podrien contribuir cap una ràpida i efectiva producció d’híbrids amb un contingut divers i elevat de carotenoids. En un altre assaig de transformació vaig co-introduir els gens PDS1, HPT1, VTE3 i VTE4 d’Arabidopsis thaliana amb la intenció de recrear la ruta metabòlica de la vitamina E. Per a aprofundir en l’impacte específic de l’acumulació i interacció de la vitamina E amb la ruta metabòlica dels carotenoids, vaig introduir la mini-ruta metabòlica de la vitamina E en una línia de blat de moro transgènica que ja expressava Zmpsy1 i PacrtI. També vaig generar una nova línia de blat de moro (línia ZWB) co-expressant dos β-carotè cetolases (sBcrtW i sCbkt) i una β-carotè hidroxilasa (sBcrtZ). Aquesta línia només va acumular astaxantina, demostrant una conversió total dels carotenoids de la línia salvatge (utilitzada per a la transformació en aquest experiment) a cetocarotenoids. La introgressió de la ruta metabòlica dels cetocarotenoids de ZWB a una línia salvatge amb elevat contingut de β-carotè, va produir híbrids que, a més d’acumular astaxantina, també acumulessin altres carotenoids i cetocarotenoids intermediaris. Amb aquest treballs he demostrat que l’elecció d’un fons genètic que contingui una ruta metabòlica parcial influencia significativament la conversió dels carotenoids a molècules de passos posteriors en la ruta metabòlica, incloent l’astaxantina. Finalment vaig regenerar i analitzar línies de blat de moro que acumulaven pABA i pterina, precursors involucrats en la biosíntesis de folat. Els nivells d’aquest precursors en les línies obtingudes no van ser suficients per incrementar el contingut de folat en blat de moro. Vaig concloure que calia un pas addicional o alternatiu en la ruta metabòlica i/o en el metabolisme per assolir una acumulació significativa de folat en blat de moro.El componente principal de mi programa de investigación ha sido un análisis detallado, a nivel molécular y bioquímico de plantas de maíz provenientes de cruces con parentales con fondos genéticos diferentes. Los parentales estaban mejorados genéticamente con transgenes que codificaban para las rutas metabólicas de los carotenoides, cetocarotenoides y vitamina E. Inicié mi investigación introduciendo una mini-ruta metabólica carotenogénica en diferentes líneas puras de maíz amarillo que contenían diferentes perfiles de carotenoides. El resultado de este experimento fue la obtención de una colección de maíces híbridos con elevadas cantidades de carotenoides, al compararlos con sus parentales correspondientes. Los análisis transcriptómicos y metabólicos de los nuevos maíces híbridos nos mostraron limitaciones en pasos específicos de las ramificaciones ε y β de la ruta de los carotenoides. La conclusión más importante fue que las plantas que generadas pueden contribuir hacia una rápida y efectiva producción de híbridos con elevado y diverso contenido de carotenoides. Hice un segundo experimento de transformación de maíz donde co-introduje los genes PDS1, HPT1, VTE3 y VTE4 provenientes de Arabidopsis thaliana con la intención de recrear la ruta metabólica de la vitamina E. Para profundizar en el impacto específico de la acumulación e interacción de vitamina E con la ruta metabólica de los carotenoides, introduje la mini-ruta metabólica de la vitamina E en una línea de maíz transgénica que ya expresaba Zmpsy1 y PacrtI. También generé una nueva línea de maíz (línea ZWB) co-expresando dos β-caroteno cetolasas (sBcrtW and sCbkt) y una β-caroteno hidroxilasa (sBcrtZ). Esta línea acumuló astaxantina como único carotenoide, demostrando una total conversión de los carotenoides de la línea salvaje utilizada para la transformación en este experimento a este cetocarotenoide. La introgresión a una línea salvaje con alto contenidos de β-caroteno de la ruta metabólica de los cetocarotenoides proveniente de ZWB, resultó en híbridos que además de acumular astaxantina, también acumulaban otros carotenoides y cetocarotenoides intermediarios. Mi trabajo demuestra que la elección de un fondo genético que contenga una ruta metabólica parcial influye significativamente en la conversión de los carotenoides a moléculas de pasos posteriores en la ruta metabolica, incluyendo astaxantina, en los híbridos. Finalmente regenere y analice líneas de maíz que acumulaban pABA y pterina, precursores involucrados en la biosíntesis de folato. Los niveles de estos precursores en las líneas transgénicas que regeneré no fueron suficientes para el incremento de folato en maíz. Mi conclusión fue que se requiere de un paso adicional o alternativo en la ruta metabólica y/o en el metabolismo para alcanzar una acumulación significativa de folato en maíz.The major component of my research program focused on an in depth molecular and biochemical analysis of maize plants from different genetic backgrounds containing metabolic pathways introgressed from parents engineered with different transgenes representing the carotenoid, ketocarotenoid and vitamin E pathways. In the first instance I introgressed a carotenogenic mini-pathway into different yellow maize inbred lines having diverse carotenoid profiles. These experiments resulted in hybrids with higher amounts of carotenoids compared to their corresponding parents. Targeted transcriptomic and metabolite analysis revealed bottlenecks in sequential steps in the ε- and β-branches of the carotenoid pathway in the newly created hybrids. I discuss my results in terms of how plants I have generated might contribute towards a rapid and effective production of maize hybrids with high and diverse carotenoid content. I generated transgenic maize plants co-expressing Arabidopsis thaliana PDS1, HPT1, VTE3 and VTE4 genes in order to recreate the vitamin E biosynthetic pathway in maize. I then used a stacking strategy to introgress the vitamin E mini-pathway into a second transgenic maize line expressing Zmpsy1 and PacrtI in an attempt to determine the specific impact on metabolite accumulation and interaction of the vitamin E and the carotenoid biosynthetic pathways. I also generated a novel maize line (ZWB line) co-expressing two β-carotene ketolases (sBcrtW and sCbkt) and a β-carotene hydroxylase (sBcrtZ). This line accumulated astaxanthin as the only carotenoid, demonstrating total conversion of the carotenoid precursor pool in the wild type line used for the transformation experiment to this ketocarotenoid. Introgression of the ketocarotenoid biosynthetic pathway from ZWB into transgenic maize lines engineered previously with different carotenogenic genes and a wild type line accumulating high levels of β-carotene, resulted in hybrids which not only accumulated astaxanthin, but also other intermediate carotenoids and ketocarotenoids. My work demonstrates that choice of an appropriate genetic background containing a partial carotenoid pathway influences significantly carotenoid conversion to downstream molecules, including astaxanthin, in hybrids. I have also recovered and analyzed maize lines accumulating pABA and pterin, precursors involved in folate biosynthesis. The levels of these precursors in the transgenic lines I generated were not sufficient to enhance folate content in maize. I concluded that additional or alternative steps in the pathway and/or metabolism need to be engineered to achieve substantial folate accumulation in maize

Carotenoides en agroalimentación y salud

Los carotenoides son compuestos especiales; si bien es común referirse a ellos como pigmentos, lo cierto es que son compuestos de gran versatilidad e importancia en la naturaleza. Más específicamente, son de gran interés en agroalimentación y salud. Así, por ejemplo, son pigmentos naturales y por lo tanto tienen un importante papel en la elección de alimentos por parte de los consumidores. Asimismo, algunos de ellos son precursores de la vitamina A. Sin embargo, que cada vez exista más interés en los carotenoides en este contexto se debe en gran parte a muchos estudios de distinta naturaleza que indican que pueden proporcionar beneficios para la salud. Su interés en alimentación funcional es por lo tanto indudable. En este libro se refleja la experiencia en carotenoides de un gran número de profesionales de la región iberoamericana. En conjunto, se ofrece una visión general de la investigación sobre estos compuestos en agroalimentación y salud. Los autores son miembros de la red IBERCAROT (http://carotenoides.us.es), que tiene entre sus objetivos conformar una red estable y funcional de profesionales que aúnen esfuerzos en pos de identificar nuevas fuentes de carotenoides de interés nutricional, mejorar su producción y aumentar el valor de los productos que los contengan

Towards vitamin biofortification in maize through multigene engineering

El component principal del meu programa de investigació ha estat un anàlisi detallat, a nivell molecular i bioquímic de plantes de blat de moro que provenien de creuaments amb parentals de fons genètics diferents. Els parentals van ser millorats genèticament amb transgens que codificaven per a las rutes metabòliques dels carotenoids, cetocarotenoids i vitamina E. Vaig iniciar la meva recerca introduint una mini-ruta metabòlica carotenogènica en línies pures de blat de moro de color groc que contenien perfiles variats de carotenoids. El resultat va ser l’obtenció d’una col•lecció de blats de moro híbrids amb unes concentracions de carotenoids més elevades que els parentals originaris. Les anàlisis transcriptòmiques i metabòliques dels nous híbrids van mostrar limitacions en passos específics de les ramificacions ε i β de la ruta dels carotenoids. La conclusió més important va esser que aquestes plantes podrien contribuir cap una ràpida i efectiva producció d’híbrids amb un contingut divers i elevat de carotenoids. En un altre assaig de transformació vaig co-introduir els gens PDS1, HPT1, VTE3 i VTE4 d’Arabidopsis thaliana amb la intenció de recrear la ruta metabòlica de la vitamina E. Per a aprofundir en l’impacte específic de l’acumulació i interacció de la vitamina E amb la ruta metabòlica dels carotenoids, vaig introduir la mini-ruta metabòlica de la vitamina E en una línia de blat de moro transgènica que ja expressava Zmpsy1 i PacrtI. També vaig generar una nova línia de blat de moro (línia ZWB) co-expressant dos β-carotè cetolases (sBcrtW i sCbkt) i una β-carotè hidroxilasa (sBcrtZ). Aquesta línia només va acumular astaxantina, demostrant una conversió total dels carotenoids de la línia salvatge (utilitzada per a la transformació en aquest experiment) a cetocarotenoids. La introgressió de la ruta metabòlica dels cetocarotenoids de ZWB a una línia salvatge amb elevat contingut de β-carotè, va produir híbrids que, a més d’acumular astaxantina, també acumulessin altres carotenoids i cetocarotenoids intermediaris. Amb aquest treballs he demostrat que l’elecció d’un fons genètic que contingui una ruta metabòlica parcial influencia significativament la conversió dels carotenoids a molècules de passos posteriors en la ruta metabòlica, incloent l’astaxantina. Finalment vaig regenerar i analitzar línies de blat de moro que acumulaven pABA i pterina, precursors involucrats en la biosíntesis de folat. Els nivells d’aquest precursors en les línies obtingudes no van ser suficients per incrementar el contingut de folat en blat de moro. Vaig concloure que calia un pas addicional o alternatiu en la ruta metabòlica i/o en el metabolisme per assolir una acumulació significativa de folat en blat de moro.El componente principal de mi programa de investigación ha sido un análisis detallado, a nivel molécular y bioquímico de plantas de maíz provenientes de cruces con parentales con fondos genéticos diferentes. Los parentales estaban mejorados genéticamente con transgenes que codificaban para las rutas metabólicas de los carotenoides, cetocarotenoides y vitamina E. Inicié mi investigación introduciendo una mini-ruta metabólica carotenogénica en diferentes líneas puras de maíz amarillo que contenían diferentes perfiles de carotenoides. El resultado de este experimento fue la obtención de una colección de maíces híbridos con elevadas cantidades de carotenoides, al compararlos con sus parentales correspondientes. Los análisis transcriptómicos y metabólicos de los nuevos maíces híbridos nos mostraron limitaciones en pasos específicos de las ramificaciones ε y β de la ruta de los carotenoides. La conclusión más importante fue que las plantas que generadas pueden contribuir hacia una rápida y efectiva producción de híbridos con elevado y diverso contenido de carotenoides. Hice un segundo experimento de transformación de maíz donde co-introduje los genes PDS1, HPT1, VTE3 y VTE4 provenientes de Arabidopsis thaliana con la intención de recrear la ruta metabólica de la vitamina E. Para profundizar en el impacto específico de la acumulación e interacción de vitamina E con la ruta metabólica de los carotenoides, introduje la mini-ruta metabólica de la vitamina E en una línea de maíz transgénica que ya expresaba Zmpsy1 y PacrtI. También generé una nueva línea de maíz (línea ZWB) co-expresando dos β-caroteno cetolasas (sBcrtW and sCbkt) y una β-caroteno hidroxilasa (sBcrtZ). Esta línea acumuló astaxantina como único carotenoide, demostrando una total conversión de los carotenoides de la línea salvaje utilizada para la transformación en este experimento a este cetocarotenoide. La introgresión a una línea salvaje con alto contenidos de β-caroteno de la ruta metabólica de los cetocarotenoides proveniente de ZWB, resultó en híbridos que además de acumular astaxantina, también acumulaban otros carotenoides y cetocarotenoides intermediarios. Mi trabajo demuestra que la elección de un fondo genético que contenga una ruta metabólica parcial influye significativamente en la conversión de los carotenoides a moléculas de pasos posteriores en la ruta metabolica, incluyendo astaxantina, en los híbridos. Finalmente regenere y analice líneas de maíz que acumulaban pABA y pterina, precursores involucrados en la biosíntesis de folato. Los niveles de estos precursores en las líneas transgénicas que regeneré no fueron suficientes para el incremento de folato en maíz. Mi conclusión fue que se requiere de un paso adicional o alternativo en la ruta metabólica y/o en el metabolismo para alcanzar una acumulación significativa de folato en maíz.The major component of my research program focused on an in depth molecular and biochemical analysis of maize plants from different genetic backgrounds containing metabolic pathways introgressed from parents engineered with different transgenes representing the carotenoid, ketocarotenoid and vitamin E pathways. In the first instance I introgressed a carotenogenic mini-pathway into different yellow maize inbred lines having diverse carotenoid profiles. These experiments resulted in hybrids with higher amounts of carotenoids compared to their corresponding parents. Targeted transcriptomic and metabolite analysis revealed bottlenecks in sequential steps in the ε- and β-branches of the carotenoid pathway in the newly created hybrids. I discuss my results in terms of how plants I have generated might contribute towards a rapid and effective production of maize hybrids with high and diverse carotenoid content. I generated transgenic maize plants co-expressing Arabidopsis thaliana PDS1, HPT1, VTE3 and VTE4 genes in order to recreate the vitamin E biosynthetic pathway in maize. I then used a stacking strategy to introgress the vitamin E mini-pathway into a second transgenic maize line expressing Zmpsy1 and PacrtI in an attempt to determine the specific impact on metabolite accumulation and interaction of the vitamin E and the carotenoid biosynthetic pathways. I also generated a novel maize line (ZWB line) co-expressing two β-carotene ketolases (sBcrtW and sCbkt) and a β-carotene hydroxylase (sBcrtZ). This line accumulated astaxanthin as the only carotenoid, demonstrating total conversion of the carotenoid precursor pool in the wild type line used for the transformation experiment to this ketocarotenoid. Introgression of the ketocarotenoid biosynthetic pathway from ZWB into transgenic maize lines engineered previously with different carotenogenic genes and a wild type line accumulating high levels of β-carotene, resulted in hybrids which not only accumulated astaxanthin, but also other intermediate carotenoids and ketocarotenoids. My work demonstrates that choice of an appropriate genetic background containing a partial carotenoid pathway influences significantly carotenoid conversion to downstream molecules, including astaxanthin, in hybrids. I have also recovered and analyzed maize lines accumulating pABA and pterin, precursors involved in folate biosynthesis. The levels of these precursors in the transgenic lines I generated were not sufficient to enhance folate content in maize. I concluded that additional or alternative steps in the pathway and/or metabolism need to be engineered to achieve substantial folate accumulation in maize

The Silencing of Carotenoid β-Hydroxylases by RNA Interference in Different Maize Genetic Backgrounds Increases the β-Carotene Content of the Endosperm

Maize (Zea mays L.) is a staple food in many parts of Africa, but the endosperm generally contains low levels of the pro-vitamin A carotenoid β-carotene, leading to vitamin A deficiency disease in populations relying on cereal-based diets. However, maize endosperm does accumulate high levels of other carotenoids, including zeaxanthin, which is derived from β-carotene via two hydroxylation reactions. Blocking these reactions could therefore improve the endosperm β-carotene content. Accordingly, we used RNA interference (RNAi) to silence the endogenous ZmBCH1 and ZmBCH2 genes, which encode two non-heme di-iron carotenoid β-hydroxylases. The genes were silenced in a range of maize genetic backgrounds by introgressing the RNAi cassette, allowing us to determine the impact of ZmBCH1/ZmBCH2 silencing in diverse hybrids. The β-carotene content of the endosperm increased substantially in all hybrids in which ZmBCH2 was silenced, regardless of whether or not ZmBCH1 was silenced simultaneously. However, the β-carotene content did not change significantly in C17 hybrids (M7 × C17 and M13 × C17) compared to C17 alone, because ZmBCH2 is already expressed at negligible levels in the C17 parent. Our data indicate that ZmBCH2 is primarily responsible for the conversion of β-carotene to zeaxanthin in maize endosperm

The silencing of carotenoid β-hydroxylases by RNA interference in different maize genetic backgrounds increases the β-carotene content of the endosperm

Maize (Zea mays L.) is a staple food in many parts of Africa, but the endosperm generally contains low levels of the pro-vitamin A carotenoid -carotene, leading to vitamin A deficiency disease in populations relying on cereal-based diets. However, maize endosperm does accumulate high levels of other carotenoids, including zeaxanthin, which is derived from -carotene via two hydroxylation reactions. Blocking these reactions could therefore improve the endosperm -carotene content. Accordingly, we used RNA interference (RNAi) to silence the endogenous ZmBCH1 and ZmBCH2 genes, which encode two non-heme di-iron carotenoid -hydroxylases. The genes were silenced in a range of maize genetic backgrounds by introgressing the RNAi cassette, allowing us to determine the impact of ZmBCH1/ZmBCH2 silencing in diverse hybrids. The -carotene content of the endosperm increased substantially in all hybrids in which ZmBCH2 was silenced, regardless of whether or not ZmBCH1 was silenced simultaneously. However, the -carotene content did not change significantly in C17 hybrids (M7 C17 and M13 C17) compared to C17 alone, because ZmBCH2 is already expressed at negligible levels in the C17 parent. Our data indicate that ZmBCH2 is primarily responsible for the conversion of -carotene to zeaxanthin in maize endosper