Επιδράσεις μεταλλαγών της αιμοσφαιρίνης στην πρωτεόσταση ερυθροκυττάρων κατά τη γήρανση

Τα ερυθροκύτταρα κατά την αποθήκευση τους υφίστανται μία σειρά αλλοιωτικών αλλαγών που αφορούν βιοχημικά και μορφολογικά τους χαρακτηριστικά και αναφέρονται με τον όρο αποθηκευτική βλάβη. Η διατήρηση της λειτουργικότητας του κυττάρου και η διασφάλιση της ακεραιότητας της μεμβράνης του προϋποθέτει την ενεργοποίηση μίας σειράς προστατευτικών μηχανισμών, που έγκεινται στην εξουδετέρωση των ROS, την επιδιόρθωση ή καταστροφή αλλοιωμένων μορίων (π.χ. οξειδωμένες πρωτεΐνες) ή τέλος την «θυσία» αυτών, μέσω κυστιδιοποίησης. Το 20S πρωτεάσωμα, ένα κεντρικό πρωτεολυτικό σύμπλοκο εξοπλισμένο με ενεργότητες κασπάσης, θρυψίνης και χυμοθρυψίνης, το οποίο έχει βρεθεί σε περίπου 20πλάσια αφθονία από το 26S πρωτεάσωμα στα ερυθροκύτταρα, αποτελεί μέρος των μηχανισμών καταστροφής πρωτεϊνών που έχουν υποστεί βλάβη σε αυτά. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η διερεύνηση της λειτουργίας και της τοπολογίας του πρωτεασώματος στα ερυθροκύτταρα δύο ομάδων αιμοδοτών, η πρώτη αποτελούμενη από 9 ετερόζυγους φορείς β-θαλασσαιμίας και η δεύτερη από 10 αιμοδότες μάρτυρες. Μελετήθηκαν τόσο δείγματα φρέσκου αίματος όσο και αποθηκευμένων ερυθροκυττάρων σε CPD-SAGM σε εβδομαδιαία βάση μέχρι το τέλος της αποθήκευσης. Σε αυτά μετρήθηκαν τα επίπεδα και τριών πρωτεασωμικών ενεργοτήτων σε δείγματα κυτοσολίων και μεμβρανών και τα επίπεδα των ενδογενών και επαγόμενων επιπέδων ROS με φθορισμομετρία. Επιπλέον, εκτελέσθηκε ανοσοαποτύπωση κατά Western για την εύρεση πρωτεϊνών σχετιζόμενων με στρες στις μεμβράνες των ερυθροκυττάρων των αιμοδοτών και μέτρηση των επιπέδων των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών στη μεμβράνη με τη μέθοδο Oxyblot. Τέλος, πραγματοποιήθηκε εστιασμένη στο πρωτεάσωμα ανάλυση και σύγκριση δικτύων συσχετίσεων μεμβρανικών και κυστιδιακών παραμέτρων των δύο ομάδων στο τέλος της αποθήκευσης. Κατόπιν ανάλυσης των δεδομένων, παρατηρήθηκε στο σύνολο των αιμοδοτών μία χωροεξαρτώμενη αλλαγή στα επίπεδα των πρωτεασωμικών ενεργοτήτων. Συγκεκριμένα, σημειώθηκε πτώση αυτών στα δείγματα των κυτοσολίων και αύξηση στα δείγματα των μεμβρανών, που μαρτυρά μία μετατόπιση του συμπλόκου προς τη μεμβράνη κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Ακόμη, η ομάδα των ετερόζυγων παρουσίασε υψηλότερες, στατιστικά σημαντικές τιμές ενεργοτήτων χυμοθρυψίνης και κασπάσης στη μεμβράνη στο δεύτερο μισό της αποθήκευσης έναντι των μαρτύρων. Παράλληλα, οι ετερόζυγοι εμφάνισαν υψηλές τιμές συσχέτισης των ενεργοτήτων με τα επαγόμενα από οξειδωτικούς παράγοντες επίπεδα ROS στο μέσο και το τέλος της αποθήκευσης. Οι ενδείξεις για αυξημένη και αποτελεσματική λειτουργία του πρωτεασώματος στην ομάδα αυτή ενισχύονται περαιτέρω από το γεγονός ότι τα επίπεδα καρβονυλίωσης πρωτεϊνών στις μεμβράνες των ετερόζυγων ήταν σημαντικά χαμηλότερα από αυτά των μαρτύρων. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποστηρίζουν την πρόταση πως τα ερυθροκύτταρα των ετερόζυγων φορέων β-θαλασσαιμίας είναι πιο αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση της αποθηκευτικής βλάβης χάρη στην ήπια οξειδωτική πίεση που δέχονται in vivo. Τέλος, το κομμάτι της εργασίας που αφορούσε τη σύγκριση δικτύων και το πώς κυρίως πρωτεασωμικές παράμετροι της μεμβράνης επηρεάζουν το φαινότυπο των κυστιδίων ανέδειξε διαφορές στο πλήθος και το είδος των διασυνδέσεων. Οι ετερόζυγοι παρουσίασαν αφενός περισσότερες συσχετίσεις και αφετέρου διαφοροποιημένο πρότυπο πυρήνωσης αυτών. Στην ομάδα των μαρτύρων οι περισσότερες διασυνδέσεις αφορούσαν σκελετικά και σχετικά με G-πρωτεΐνες χαρακτηριστικά, ενώ στους ετερόζυγους αφορούσαν διαφορετικές παραμέτρους G-πρωτεϊνών και σκελετικών στοιχείων, αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς αλλά και ορισμένες βασικές αιματολογικές παραμέτρους. Το γεγονός αυτό μαρτυρά πως το πρωτεάσωμα στους 73 δεύτερους κατέχει έναν κεντρικότερο ρόλο όσον αφορά στη διαδικασία διαλογής πρωτεϊνών κατά την κυστιδιοποίηση.During storage in the cold, the erythrocytes undergo a series of defects and alterations pertinent to their biochemical and morphological characteristics that are collectively referred to as “storage lesion”. The safe-keeping of RBC functionality and membrane homeostasis require the activation of protective mechanisms that neutralize ROS, repair or destroy affected molecules (i.e. oxidized proteins) or "sacrifice" these molecules via vesiculation. The 20S proteasome, a supermolecular proteolytic complex, which is equipped with caspase-like, chymothrypsin-like and thrypsin-like activities and has been reported in a 20fold abundance compared to the 26S proteasome in erythrocytes, plays an important role in the disposal of oxidized and misfolded proteins. The aim of this Bachelor Thesis is the study of the proteasome's function and topology in the erythrocytes of two groups of blood donors, one that consisted of heterozygotes for β-thalassaemia (n=9) and one of controls (n=10). Samples used for assays included both fresh blood and CPD-SAGM units of RBCs, tested on a weekly basis. Proteasomal activities in cytosol and membrane fractions, along with intrinsic and induced ROS levels were measured by fluorescence assays, while immunoblotting and Oxyblot analyses were performed in order to assess differences in the levels of specific stress-related proteins in the RBC membranes. Lastly, a network analysis focused on proteasome components was performed for membrane and vesicle parameters in both groups at the end of the storage period. After analyzing the collected measurements, an overall fraction-dependent change in all three proteasomal activities was observed; namely a decrease in cytosol samples and an increase in membrane samples that suggest a transfer to the latter during storage. Moreover, the erythrocytes of heterozygotes exhibited significantly higher levels of caspase-like and chymothrypsin-like activities in middle and late storage compared to controls. They also exhibited high values of the R2 correlation coefficient between proteasomal activities and ROS levels, induced or otherwise, during the second half of storage, contrary to controls. The proteasome's higher efficiency in this group was further corroborated by the fact that the Protein Carbonylation Index's values in the heterozygotes' membranes during the same period were significantly lower than those of controls. These findings support the hypothesis that erythrocytes from heterozygotes for β-thalassaemia cope better with oxidative stress during storage, thanks to the low, sustained oxidative pressure they experience in vivo. Finally, the part of this thesis that concerns the networks of membrane and vesicle parameters revealed that heterozygotes exhibit more correlations and a different pattern of hub-formation compared to controls. In the control network, most correlations were noted between proteasomal subunits and skeletal or G-protein-related parameters, while, in the heterozygotes' network, most correlations were observed between the proteasome and a number of anti-oxidant and different skeletal and G-protein-related components, along with some hematological parameters. These differences suggest that the role of the proteasome in the process of protein sorting for vesiculation might be of higher importance for this group

Προσδιορισμός κανναβιδιόλης, Δ9-τετραϋδροκανναβινόλης και του όξινου μεταβολίτη της σε βιολογικά υλικά ασθενών που λαμβάνουν προϊόντα κανναβιδιόλης

Η κάνναβη αποτελεί το πιο συχνό παράνομο ναρκωτικό που χρησιμοποιείται και εμπορεύεται παγκοσμίως. Το βασικό συστατικό της κάνναβης στο οποίο οφείλονται οι ψυχοδραστικές ιδιότητες της είναι η Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC), ενώ πολύ σημαντική ένωση του φυτού αποτελεί επίσης η κανναβιδιόλη (CBD). Η CBD δεν έχει ψυχότροπες δράσεις, ενώ παρουσιάζει ευεργετική δράση σε διάφορες διαταραχές του ΚΝΣ. Γι’ αυτό το λόγο, τα τελευταία χρόνια, παρατηρείται αύξηση στην χρήση προϊόντων κανναβιδιόλης για την ανακούφιση του πόνου, τη βελτίωση του ύπνου και τη μείωση του άγχους, ενώ έχουν ήδη εγκριθεί δύο σκευάσματα για τη διαχείριση επιληπτικών κρίσεων και των συμπτωμάτων της σκλήρυνσης κατά πλάκας. Αν και οι συγκεντρώσεις της Δ9-THC που βρίσκονται στα προϊόντα αυτά είναι χαμηλές, είναι γνωστό πως η Δ9-THC και κυρίως οι μεταβολίτες της συσσωρεύονται στον οργανισμό. Η Δ9-THC βιομετατρέπεται στον ανθρώπινο οργανισμό κυρίως στον ανενεργό μεταβολίτη της, την 11-νορ-9-καρβοξυ-Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (11-nor-COOH-Δ9-THC), και η ανίχνευση της Δ9-THC και του μεταβολίτη της στα βιολογικά υλικά αποτελεί δείκτη χρήσης κάνναβης κατά τη διερεύνηση υποθέσεων δικαστικού ενδιαφέροντος. Εγείρεται, το ερώτημα αν η λήψη σκευασμάτων κανναβιδιόλης από ασθενείς μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την ανίχνευση αυτών των ουσιών στα βιολογικά τους υλικά και συνεπώς την παρερμηνεία των αποτελεσμάτων των τοξικολογικών αναλύσεων, δεδομένου μάλιστα της μηδενικής ανοχής του ελληνικού νόμου ως προς τη χρήση παράνομης κάνναβης αλλά και την οδήγηση υπό την επήρεια καννάβεως. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της CBD και η διερεύνηση ανίχνευσης της Δ9-THC και του μεταβολίτη της, 11-nor-COOH-Δ9-THC στο πλάσμα και στα ούρα ατόμων που λαμβάνουν προϊόντα κανναβιδιόλης. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε αναλυτική μέθοδος με τη χρήση της τεχνικής της αέριοχρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (GC-MS) και μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε σε βιολογικά υλικά ασθενών που λαμβάνουν προϊόντα κανναβιδιόλης. Η κατεργασία των δειγμάτων πλάσματος περιελάμβανε, αρχικά, καταβύθιση των πρωτεϊνών του πλάσματος με ακετονιτρίλιο, στη συνέχεια, απομόνωση των υπό μελέτη ουσιών από το πλάσμα μέσω εκχύλισης στερεάς φάσης, χρησιμοποιώντας στήλες Bond Elut LRC Certify II και τέλος, παραγωγοποίηση με BSTFA με 1% TMCS. Κατά την επικύρωση της παραπάνω μεθόδου, η οποία έλαβε χώρα σύμφωνα με τις διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες ελέχθησαν τα παρακάτω χαρακτηριστικά ποιότητας της μεθόδου: εκλεκτικότητα, ειδικότητα, γραμμικότητα, κατώτατα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, επαναληψιμότητα, ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, ορθότητα εντός και διά των ημερών και ανάκτηση. 10 Στη συνέχεια, η μέθοδος δοκιμάστηκε και επαληθεύτηκε για τον προσδιορισμό των ουσιών αυτών και στα ούρα. Η αναπτυχθείσα μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά βιολογικά δείγματα ατόμων που έλαβαν προϊόν κανναβιδιόλης. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προκύπτει το συμπέρασμα πως μπορεί να υπάρξει παρερμηνεία στην αξιολόγηση των θετικών αποτελεσμάτων μιας τοξικολογικής εξέτασης για το 11-nor-COOH-Δ9-THC στο πλάσμα και τα ούρα, καθώς και για την Δ9-THC στο αίμα μετά τη λήψη σκευασμάτων κανναβιδιόλης. Η Δ9-THC είναι πιθανό να βρεθεί αν και σε χαμηλές συγκεντρώσεις στο πλάσμα. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το ότι ο μεταβολίτης της Δ9-THC, 11-nor-COOH-Δ9-THC, ανιχνεύεται και στα ούρα και στο πλάσμα των ατόμων που έλαβαν μέρος στην μελέτη εγείρουν ερωτήματα και προβληματισμούς δικαστικής φύσεως ως προς την ερμηνεία των απαντήσεων των τοξικολογικών εξετάσεων και αυτό διότι τόσο η Δ9-THC όσο και ο μεταβολίτης της αποτελούν δείκτες της παράνομης χρήσης κάνναβης. Για το λόγο αυτό υπάρχει έντονη ανάγκη αναζήτησης νέων δεικτών στα βιολογικά υλικά που αναλύονται στο πλαίσιο διερεύνησης υποθέσεων δικαστικού και κλινικού ενδιαφέροντος για τον διαχωρισμό των ασθενών που λαμβάνουν κάποιο σκεύασμα κανναβιδιόλης από τους χρήστες παράνομης.Cannabis is the most common illicit drug used and marketed worldwide. The main constituent of cannabis is Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), which is responsible for the psychoactive properties of cannabis, while a very important compound of the plant is also cannabidiol (CBD). CBD has no psychotropic effects, while it has a beneficial effect on various CNS disorders. For this reason, in recent years, there has been an increase in the consumption of cannabidiol products for pain relief, improvement of sleep and stress reduction, while two CBD formulations have already been approved for the management of seizures and symptoms of multiple sclerosis. Although the concentrations of Δ9-THC found in these products are low, it is well known that Δ9-THC and mainly its metabolites accumulate in the body. Δ9-THC is biotransformed in the human body mainly to its inactive metabolite, 11-nor-9-carboxy-Δ9-tetrahydrocannabinol (11-nor-COOH-Δ9-THC), and the detection of Δ9-THC and its metabolite in biological materials is an indicator of cannabis use during the investigation of forensic and clinical cases. A question arises whether the intake of cannabidiol by patients can result in the detection of Δ9-THC and 11-nor-COOH-Δ9-THC in their biological samples leading to the misinterpretation of the results of toxicological analysis, taking into consideration the zero tolerance of Greek law regarding the use of illegal cannabis and driving under the influence of cannabis. The aim of this study was the determination of CBD and the detection of Δ9-THC and its metabolite, 11-nor-COOH-Δ9-THC in the plasma and urine of individuals who receive cannabidiol products. For this reason, an analytical method for their determination was developed and validated using the technique of gas chromatography in combination with mass spectrometry (GC-MS). In addition, the method was applied to the biological samples of patients who receive cannabidiol products. The process of plasma samples first involved precipitation of plasma proteins using acetonitrile, then isolation of the substances from the plasma by solid phase extraction using Bond Elut LRC Certify II columns and finally derivatization with BSTFA with 1% TMCS. During the validation of the method, which was performed according to the international guidelines, the following quality characteristics of the method were tested: selectivity, specificity, linearity, limits of detection and quantification, intra- and inter-day accuracy and precision and finally recovery. The method was then tested and verified for the determination of the substances in the urine. The developed method was applied to real biological samples of individuals receiving cannabidiol product. The results showed that there may be misinterpretation in the evaluation 12 of positive results of a toxicological analysis for 11-nor-COOH-Δ9-THC in plasma and urine, as well as for Δ9-THC in plasma after receiving cannabidiol products. Δ9-THC is likely to be found in plasma although in low concentrations. This fact, combined with the fact that the metabolite of Δ9-THC, 11-nor-COOH-Δ9-THC, is detected in both urine and plasma of the subjects of this study, raises questions and concerns of a judicial nature regarding the interpretation of the results of a toxicological analysis, as both Δ9-THC and its metabolite are indicators of cannabis use. For this reason it is essential to look for new markers in biological materials that are analyzed during the toxicological investigation of cases of forensic and clinical interest in order to distinguish patients receiving a cannabidiol product from illegal users of cannabis

ESR2 Drives Mesenchymal-to-Epithelial Transition in Triple-Negative Breast Cancer and Tumorigenesis In Vivo

Estrogen receptors (ERs) have pivotal roles in the development and progression of triple-negative breast cancer (TNBC). Interactions among cancer cells and tumor microenvironment are orchestrated by the extracellular matrix that is rapidly emerging as prominent contributor of fundamental processes of breast cancer progression. Early studies have correlated ER beta expression in tumor sites with a more aggressive clinical outcome, however ER beta exact role in the progression of TNBC remains to be elucidated. Herein, we introduce the functional role of ER beta suppression following isolation of monoclonal cell populations of MDA-MB-231 breast cancer cells transfected with shRNA against human ESR2 that permanently resulted in 90% reduction of ER beta mRNA and protein levels. Further, we demonstrate that clone selection results in strongly reduced levels of the aggressive functional properties of MDA-MB-231 cells, by transforming their morphological characteristics, eliminating the mesenchymal-like traits of triple-negative breast cancer cells. Monoclonal populations of shER beta MDA-MB-231 cells undergo universal matrix reorganization and pass on a mesenchymal-to-epithelial transition state. These striking changes are encompassed by the total prevention of tumorigenesis in vivo following ER beta maximum suppression and isolation of monoclonal cell populations in TNBC cells. We propose that these novel findings highlight the promising role of ER beta targeting in future pharmaceutical approaches for managing the metastatic dynamics of TNBC breast cancer

Cost-Utility study for operative methods in spinal surgery

AIM: The purpose of the present study is to evaluate the quality of life (QoL) of patients with spinal problems before and after surgery with the use of the EQ-5D-5L health status questionnaire. MATERIALS - METHODS: The research is based on primary data collection of 314 patients who completed the questionnaires at three different times: a) preoperatively; that is, after completion of conservative treatment which involved medication, physiotherapy, etc., b) ten days postoperatively and c) immediately after the first post-operative month. RESULTS: Out of the 314 patients, aged between 34 and 79 years (mean age 52±15,07) who participated in this study, 172 were males (54,8%) and 142 females (45,2%). 77,71% of the patients suffered from a herniated intervertebral disc and 22,29% from spondylolisthesis in the lumbar region. Total improvement of the quality of life (QoL) in our study was on average 0,59 QALYs at 10 days and 0,82 QALYs at 30 days. The total average direct cost of these surgical interventions amounted to 9341,86±4042,53 euro while the index of cost-utility for the sample population was estimated to be 15870,16 euro/ QALY at 10 days. This index decreased considerably to 11867,14 euro/ QALY at 30 days after the surgical intervention since the average benefit in QALYs increased and the QoL improved. CONCLUSIONS: The evaluation of the data of this study was highlighted the high degree of effectiveness of each surgery applied to treat the symptomatology of patients . All the statistical tests applied to the sample showed a very significant improvement of all variables used by the questionnaire for all intervals evaluated after surgery. Lastly, there has also been a very large improvement in the overall QoL of patients

Novel genetic risk variants for pediatric celiac disease

Background: Celiac disease is a complex chronic immune-mediated disorder of the small intestine. Today, the pathobiology of the disease is unclear, perplexing differential diagnosis, patient stratification, and decision-making in the clinic. Methods: Herein, we adopted a next-generation sequencing approach in a celiac disease trio of Greek descent to identify all genomic variants with the potential of celiac disease predisposition. Results: Analysis revealed six genomic variants of prime interest: SLC9A4 c.1919G gt A, KIAA1109 c.2933T gt C and c. 4268_4269delCCinsTA, HoxB6 c.668C gt A, HoxD12 c.418G gt A, and NCK2 c.745_746delAAinsG, from which NCK2 c.745_746delAAinsG is novel. Data validation in pediatric celiac disease patients of Greek (n=109) and Serbian (n=73) descent and their healthy counterparts (n=111 and n=32, respectively) indicated that HoxD12 c.418G gt A is more prevalent in celiac disease patients in the Serbian population (P lt 0.01), while NCK2 c.745_746delAAinsG is less prevalent in celiac disease patients rather than healthy individuals of Greek descent (P = 0. 03). SLC9A4 c.1919G gt A and KIAA1109 c.2933T gt C and c.4268_4269delCCinsTA were more abundant in patients; nevertheless, they failed to show statistical significance. Conclusions: The next-generation sequencing-based family genomics approach described herein may serve as a paradigm towards the identification of novel functional variants with the aim of understanding complex disease pathobiology

A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control

Reports of honey bee population decline has spurred many national efforts to understand the extent of the problem and to identify causative or associated factors. However, our collective understanding of the factors has been hampered by a lack of joined up trans-national effort. Moreover, the impacts of beekeeper knowledge and beekeeping management practices have often been overlooked, despite honey bees being a managed pollinator. Here, we established a standardised active monitoring network for 5 798 apiaries over two consecutive years to quantify honey bee colony mortality across 17 European countries. Our data demonstrate that overwinter losses ranged between 2% and 32%, and that high summer losses were likely to follow high winter losses. Multivariate Poisson regression models revealed that hobbyist beekeepers with small apiaries and little experience in beekeeping had double the winter mortality rate when compared to professional beekeepers. Furthermore, honey bees kept by professional beekeepers never showed signs of disease, unlike apiaries from hobbyist beekeepers that had symptoms of bacterial infection and heavy Varroa infestation. Our data highlight beekeeper background and apicultural practices as major drivers of honey bee colony losses. The benefits of conducting trans-national monitoring schemes and improving beekeeper training are discussed

Evaluation of the anticancer effect and mechanism of curcumin in glioblastoma

Glioblastoma is one of the deadliest tumors of the central nervous system, with an average patient survival of approximately 15 months after diagnosis. Current treatment options based on surgical resection followed by a combination of chemotherapy and radiotherapy do not significantly increase patient survival. For this reason, the need to find new safe, and effective anti-glioma agents is considered essential. In this context, many modern research efforts have turned to the study of plant extracts or molecules isolated from plants. Curcumin is a polyphenol isolated from the plant Curcuma longa and has shown significant anticancer properties in various types of neoplasms. In the present study, the antiglioma activity of curcumin and its underlying mechanism were investigated in 2 human glioblastoma cell lines in vitro, either as monotherapy or in combination with current therapeutic approaches, such as radiotherapy and chemotherapy with the approved alkylating agent temozolomide. For this purpose, the effect of curcumin on cell proliferation was evaluated by methyl-triazolyl-tetrazolium (MTT) cytotoxicity assay, Trypan Blue Exclusion Assay and Crystal Violet staining. In addition, its effect on cell cycle progression was investigated by flow cytometry, and the effect on the migratory ability of the cells by the scratch wound healing assay. Testing for synergism of curcumin and radiotherapy or curcumin and temozolomide was assessed by the Trypan Blue Exclusion Assay and CompuSyn software (based on the measurement of the Combination Index). The effect of curcumin on the expression of the pro-apoptotic protein Bcl2, as well as pro-caspase 3 was evaluated by Western blot immunoprinting. Finally, a toxicity test of curcumin was performed in a zebrafish model. Based on the results of the present thesis, curcumin significantly inhibited cell proliferation in both cell lines and induced dose-dependent cell cycle arrest in the G2/M phase. Curcumin also inhibited cell migration in both lines, reduced the levels of Bcl2 protein, as well as pro-caspase 3, indicating that its antiproliferative action is related to the induction of apoptosis. In addition, pretreatment of cells with increasing concentrations of curcumin before exposure to radiation reduced cell viability to a greater extent than monotherapy with curcumin or radiation (synergistic effect). Co-administration of curcumin and temozolomide also showed a synergistic effect in most tested combinations. Finally, in an in vivo zebrafish model, the mean lethal concentration (LC50) of curcumin was lower compared to its IC50 values against glioblastoma cells, suggesting that curcumin shows more selectivity towards cancer cells. Our results demonstrate that curcumin is a promising anti-glioma agent that can sensitize glioblastoma cells to both radiotherapy and chemotherapy.Το γλοιοβλάστωμα είναι ένας από τους πιο θανατηφόρους όγκους του κενρικού νευρικού συστήματος, με μέση επιβίωση των ασθενών περίπου 15 μήνες μετά τη διάγνωση. Οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές που βασίζονται στην χειρουργική εκτομή, ακολουθούμενη από συνδυασμό χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας δεν αυξάνουν σημαντικά την επιβίωση των ασθενών. Για το λόγο αυτό, η ανάγκη εύρεσης νέων ασφαλών και αποτελεσματικών αντιγλοιωματικών παραγόντων κρίνεται απαραίτητη. Στο πλαίσιο αυτό, πολλές σύγχρονες ερευνητικές προσπάθειες έχουν στραφεί στην μελέτη φυτικών εκχυλισμάτων ή μορίων που απομονώνονται από φυτά. Η κουρκουμίνη είναι μια πολυφαινόλη που απομονώνεται από το φυτό Curcuma longa και έχει επιδείξει σημαντικές αντικαρκινικές ιδιότητες σε διάφορους τύπους νεοπλασιών. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η αντιγλοιωματική δράση της κουρκουμίνης και ο μηχανισμός αυτής σε 2 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος in vitro, είτε ως μονοθεραπεία, είτε συνδυαστικά με τρέχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις, όπως είναι η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία με τον εγκεκριμένο για γλοιοβλάστωμα αλκυλιωτικό παράγοντα τεμοζολομίδη. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήθηκε η επίδραση της κουρκουμίνης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τη δοκιμασία κυτταροτοξικότητας μεθυλ-τριαζολυλ-τετραζολίου(ΜΤΤ), τη χρωστική μικροσκοπίου-Trypan Blue Exclusion Assay και τη χρώση μεκρυσταλλικό ιώδες (Crystal Violet). Επιπλέον, διερευνήθηκε η δράση της στον κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής και η επίδραση στην μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων με την τεχνική της προσωμοίωσης τραύματος δι’ αμυχής. Ο έλεγχος της ύπαρξης ή όχι συνέργειας μεταξή κουρκουμίνης και ακτινοθεραπείας ή κουρκουμίνης και τεμοζολομίδης αξιολογήθηκε με την τεχνική Trypan Blue και το λογισμικό CompuSyn (με χρήση του Δείκτη Συνδυασμού CI). Η επίδραση της κουρκουμίνης στην έκφραση της προαποπτωτικής πρωτείνης Bcl2, καθώς και της προ-κασπάσης 3 αξιολογήθηκε με ανοσοαποτύπωση κατά Western blot. Τέλος, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία τοξικότηταςτης κουρκουμίνης σε μοντέλο ιχθύος ζέβρα (zebrafish). Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, η κουρκουμίνη ανέστειλλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στις 2 κυτταρικές σειρές και προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2/M. Η κουρκουμίνη επίσης, ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων και στις δύο σειρές, μείωσε τα επίπεδα της πρωτείνης Bcl2, καθώς και της προ-κασπάσης 3, υποδεικνύοντας ότι η δράση της σχετίζεται με επαγωγή της απόπτωσης. Επιπλέον, η προκατεργασία των κυττάρων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις κουρκουμίνης πριν από την έκθεση σε ακτινοβολία μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε υψηλότερο βαθμό από τη μονοθεραπεία με κουρκουμίνη ή ακτινοβολία (συνεργική δράση). Η συγχορήγηση κουρκουμίνης και τεμοζολομίδης εμφάνισε επίσης συνεργική δράση στους περισσότερους συνδυασμούς. Τέλος, σε in vivo μοντέλο zebrafish, η μέση θανατηφόρος συγκέντρωση (LC50) της κουρκουμίνης ήταν χαμηλότερη από τις τιμές IC50 για τις 2 κυτταρικές σειρές, επομένως η κουρκουμίνη εμφανίζει μεγαλύτερη εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η κουρκουμίνη είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντιγλοιωματικός παράγοντας που μπορεί να ευαισθητοποίησει τα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος στη δράση της ακτινοθεραπείας και της χημειοθεραπεία

Study of redox status in farm animals products

Οne οf the main challenges οf tοday's sοciety is the develοpment οf the livestοck sectοr by imprοving the cοnditiοns οf animal husbandry and ensuring the prοductiοn οf high quality prοducts. In recent years it has been οbserved that the intensive grοwth rates οf farm animals have led tο the emergence οf several pathοlοgical cοnditiοns in which οxidative stress is invοlved. It is therefοre understοοd that thrοugh the οverall well-being οf animals can increase their prοductivity, prοduct quality and therefοre imprοve their cοmmercial value and eliminate cοnsumer cοncerns abοut prοduct quality. In view οf all the abοve, the impοrtance οf investigating οxidative stress markers in the tissues and prοducts οf farm animals becοmes clear. In the present dissertatiοn the levels οf redοx status in the tissues οf 144 small ruminants (48 goats and 96 sheep) and 38 cattle as well as in the blοοd and milk οf 40 dοmestic dairy sheep were evaluated. Τhe sheep and gοats belοnged tο the fοllοwing three main grοups: dοmestic gοat breed, fat-tailed sheep (Chios breed) and thin-tailed sheep breed. Τhe cattle belοnged tο the Limοusin, Charοlaise and Simmental breeds, while the dοmestic dairy sheep belοng tο the Greek breed Karagοuniki, and tο the French breed Lacaune. Τhe analysis included variables οf develοpmental stage, breed and sex. Τissues used in the analysis include: blοοd, liver, diaphragm, quadriceps and psοas majοr. Τhe samples measured indicatοrs related tο antiοxidant capacity, οxidative damage tο lipids and prοteins, as well as the effect οn the antiοxidant system οf cell cultures. Αt the same time, a cοrrelatiοn analysis was perfοrmed in οrder tο investigate predictοrs οf antiοxidant capacity and quality οf meat in the blοοd οf the respective animals. Τhe results shοwed statistically significant changes in the different variables taken intο accοunt in the analysis, particularly demοnstrating the fragile redοx equilibrium at critical periοds οf farm animals such as weaning. In additiοn, the variable οf the breed seems tο play a decisive rοle in the levels οf redοx status οf the animals as evidenced by the predοminance in the antiοxidant prοfile οf Limοusin, fat-tailed sheep breed and Karagοuniki dairy breed.Based οn the abοve, it is emerged the need for investigating further the basic levels οf redοx status indicatοrs οf farm animals and their subsequent identificatiοn as a predictοr οf meat quality with new innοvative methοds. The research in this field will contribute, οn the οne hand, to increase the value οf meat and οn the οther hand to the welfare οf farm animals but will alsο be an incentive fοr the further develοpment οf the livestοck sectοr.Μια από τις βασικές προκλήσεις της σημερινής κοινωνίας είναι η ανάπτυξη του κτηνοτροφικού τομέα μέσω της βελτίωσης των συνθηκών εκτροφής των ζώων αλλά και της διασφάλισης παραγωγής προϊόντων υψηλής ποιότητας. Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί πως οι εντατικοί ρυθμοί ανάπτυξης των παραγωγικών ζώων έχουν οδηγήσει στην εμφάνιση αρκετών παθολογικών καταστάσεων στις οποίες εμπλέκεται το οξειδωτικό στρες. Εξάλλου, φαίνεται πως διαμέσου της βελτίωσης της ευζωίας των ζώων μπορεί να επιτευχθεί αύξηση στην παραγωγικότητα τους, στην ποιότητα των παραγόμενων προϊόντων και επομένως βελτίωση της εμπορικής τους αξίας αλλά και άμβλυνση των προβληματισμών που διακατέχουν τους καταναλωτές σχετικά με την ποιότητα των προϊόντων ζωικής προέλευσης. Στο πλαίσιο αυτό θα μπορούσε να συνεισφέρει η διερεύνηση διαφόρων δεικτών οξειδωτικού στρες στους ιστούς και τα προϊόντα των παραγωγικών ζώων. Για τον σκοπό αυτό, στην παρούσα διατριβή αξιολογήθηκαν τα επίπεδα οξειδοαναγωγικής κατάστασης στους ιστούς 144 μικρών μηρυκαστικών (48 αιγών και 96 προβάτων) και 38 βοοειδών καθώς και στο αίμα και γάλα 40 εγχώριων γαλακτοπαραγωγικών προβάτων. Τα μικρά μηρυκαστικά ανήκαν στις εξής τρεις κύριες ομάδες: εγχώρια φυλή αιγών, πλατύουρη φυλή προβάτων (Χίου), λεπτόουρη φυλή προβάτων. Τα βοοειδή ανήκαν στις φυλές Limοusin, Charοlaise και Simmental, ενώ τα εγχώρια γαλακτοπαραγωγικά πρόβατα ανήκαν σε μια αμιγώς ελληνική φυλή, την Καραγκούνικη, και στην γαλλική Lacaune. Στην ανάλυση συμπεριλήφθηκαν οι μεταβλητές: (α) στάδιο ανάπτυξης, (β) φυλή και (γ) φύλο. Στους ιστούς που αναλύθηκαν συγκαταλέχθηκαν οι εξής: αίμα, ήπαρ, ψοΐτης μυς, τετρακέφαλος μυς και διάφραγμα. Στα δείγματα μετρήθηκαν δείκτες που σχετίζονται με την αντιοξειδωτική ικανότητα, την οξειδωτική καταστροφή σε λιπίδια και πρωτεΐνες, καθώς και η επίδρασή τους στο αντιοξειδωτικό σύστημα κυτταροκαλλιεργειών. Ταυτόχρονα έγινε ανάλυση συσχέτισης προκειμένου να διερευνηθούν πιθανοί δείκτες πρόβλεψης της αντιοξειδωτικής ικανότητας στο αίμα και της ποιότητας του κρέατος των αντίστοιχων ζώων. Τα αποτελέσματα έδειξαν, στατιστικά σημαντικές μεταβολές στις διαφορετικές μεταβλητές που λήφθηκαν υπόψιν στην ανάλυση, καταδεικνύοντας ιδιαίτερα την ευαίσθητη οξειδοαναγωγική ισορροπία σε κρίσιμες περιόδους των παραγωγικών ζώων όπως είναι ο απογαλακτισμός. Επιπλέον η μεταβλητή ‘φυλή’ φαίνεται ότι διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στα επίπεδα οξειδοαναγωγικής κατάστασης των ζώων όπως φάνηκε στη φυλή Limousin, στην παχύ-ουρη φυλή προβάτων και στην Καραγκούνικη γαλακτοπαραγωγική φυλή αφού παρατηρήθηκε ενίσχυση του αντιοξειδωτικού προφίλ αυτών των φυλών. Με βάση τα παραπάνω, αναδεικνύεται η ανάγκη περαιτέρω διερεύνησης των βασικών επιπέδων των δεικτών οξειδοαναγωγικής κατάστασης των παραγωγικών ζώων και η επακόλουθη ταυτοποίηση τους ως δείκτης πρόβλεψης για την ποιότητα του κρέατος και του γάλακτος με νέες καινοτόμες μεθόδους. Η έρευνα σ’ αυτόν τον τομέα θα συμβάλλει αφενός στην αύξηση της προστιθέμενης αξίας του κρέατος και του γάλακτος και αφετέρου στην ευζωία των παραγωγικών ζώων, αλλά και θα αποτελέσει κίνητρο για την περαιτέρω ανάπτυξη του κτηνοτροφικού κλάδου

Radiosensitization and Radioprotection by Curcumin in Glioblastoma and Other Cancers

Radiation therapy plays an important role in almost every cancer treatment. However, radiation toxicity to normal tissues, mainly due to the generation of reactive free radicals, has limited the efficacy of radiotherapy in clinical practice. Curcumin has been reported to possess significant antitumor properties. Although curcumin can sensitize cancer cells to irradiation, healthy cells are much less sensitive to this effect, and thus, curcumin is thought to be a potent, yet safe anti-cancer agent. In this review, a summary of the role of curcumin as both a radiosensitizer and radioprotector has been presented, based on the most recent data from the experimental and clinical evaluation of curcumin in different cancer cell lines, animal models, and human patients