STED imaging performance estimation by means of Fourier transform analysis

Due to relatively high powers used in STED, biological samples may be affected by the illumination in the process of image acquisition. Similarly, the performance of the system may be limited by the sample itself. Optimization of the STED parameters taking into account the sample itself is therefore a complex task as there is no clear methodology that can determine the image improvement in an objective and quantitative manner. In this work, a method based on Fourier transform formalism is presented to analyze the performance of a STED system. The spatial frequency distribution of pairs of confocal and STED images are compared to obtain an objective parameter, the Azimuth Averaged Spectral Content Spread (AASCS), that is related to the performance of the system in which the sample is also considered. The method has been first tested on samples of beads, and then applied to cell samples labeled with multiple fluorescent dyes. The results show that a single parameter, the AASCS, can be used to determine the optimal settings for STED image acquisition in an objective way, only by using the information provided by the images from the sample themselves. The AASCS also helps minimize the depletion power, for better preservation of the samples.Peer ReviewedPostprint (published version

Analyse der Zellsortierung und Zellbewegung von Dictyostelium discoideum mittels konfokaler 4DMikroskopie

Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden für die in vivo Beobachtung dynamischer Prozesse in der Amöbe Dictyostelium discoideum verwendet. Um diese Vorgänge sichtbar zu machen, wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter von Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von 4D-Mikroskopie und Mehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und die intrazelluläre Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und analysiert werden. Es wurde eine Methode entwickelt, spektral unterschiedliche GFP-Varianten im Konfokalmikroskop simultan zu detektieren und verläßlich zu trennen. Aufgrund der Anregungswellenlänge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs zur Erfassung beider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur schonenden Beobachtung lebender Zellen auch über längere Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen darüber hinaus die Verwendung dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer 4D-Messung. In D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen) während der Migration und der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter für spezifische Genexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich der Spitze in den Prespore-Bereich zurück. Dieses Zurückfallen in der zentralen Längsachse läßt sich durch die Organisation der Spitzenregion durch cAMP-Spiralwellen mit einem Zentrum in der Längsachse erklären. Prestalk-Zellen gelangen über diesen Weg aus der Spitze in den Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich sind ehemalige Prestalk-Zellen gemeinsam mit den Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs maßgeblich beteiligt. Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort rotierende Zentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien einzelner Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch cAMPSignale. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es innerhalb dieser Zellen Gruppen gibt, die zu unterschiedlichen Zeiten in neue Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen Spitzen wieder im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem Prespore-Bereich kommen, während pst0-Zellen im gesamten Prestalk-Bereich zu finden sind. Artspezifische Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten wurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Sortierung von D. discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den Aggregationsströmen anfängt und im Mound abgeschlossen wird. Die Trennung erfolgt über Unterschiede in der Zelladhäsion. Erheblich beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang durch die gerichtete chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei den sich in den Zellströmen schneller bewegenden D. mucoroides-Zellen zu einer Anreicherung im Moundzentrum führt. Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam für die artspezifische Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In Mischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht die Aussortierung über die Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe für die Chemotaxis, so daß die Arten getrennt aggregieren. Es konnte gezeigt werden, daß diese getrennte Aggregation sehr spezifisch ist und es dennoch zu einer Interaktion zwischen D. discoideum und fortgeschrittenen Polysphondylium-Aggregaten kommt, da in Polysphondylium in späten Aggregationsphasen cAMP für die interzelluläre Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird von Polysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert. Severin ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das F-Aktin-Filamente fragmentiert und an das (+)-Ende des entstehenden Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurde die intrazelluläre Lokalisierung dieses Proteins in vivo während einer Vielzahl zellulärer Aktivitäten untersucht. Severin ist in den aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex angereichert. Obwohl die Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen Phasen der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von Severin in allen Stadien primär von der Bildung neuer Zellfortsätze trennbar. Die Anreicherung von Severin ist hingegen mit der Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Fortsätze assoziiert. Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen auf das Zytoskelett einzelner Zellen in Aggregationsströmen ausführlich dargestellt

Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based subcellular visualization of pathogen-induced host receptor signaling

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Bacteria-triggered signaling events in infected host cells are key elements in shaping the host response to pathogens. Within the eukaryotic cell, signaling complexes are spatially organized. However, the investigation of protein-protein interactions triggered by bacterial infection in the cellular context is technically challenging. Here, we provide a methodological approach to exploit fluorescence resonance energy transfer (FRET) to visualize pathogen-initiated signaling events in human cells.</p> <p>Results</p> <p>Live-cell microscopy revealed the transient recruitment of the Src family tyrosine kinase Hck upon bacterial engagement of the receptor carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 (CEACAM3). In cells expressing a CEACAM3 variant lacking the cytoplasmic domain, the Src homology 2 (SH2) domain of Hck (Hck-SH2) was not recruited, even though bacteria still bound to the receptor. FRET measurements on the basis of whole cell lysates revealed intimate binding between Hck-SH2 (using enhanced yellow fluorescent protein (YPet)-Hck-SH2) and the tyrosine-phosphorylated enhanced cyan fluorescent protein-labeled cytoplasmic domain of wild-type CEACAM3 (CEACAM3 WT-CyPet) and a flow cytometry-based FRET approach verified this association in intact cells. Using confocal microscopy and acceptor photobleaching, FRET between Hck-SH2 and CEACAM3 was localized to the sites of bacteria-host cell contact.</p> <p>Conclusion</p> <p>These data demonstrate not only the intimate binding of the SH2 domain of Hck to the tyrosine-phosphorylated cytoplasmic domain of CEACAM3 in intact cells, but furthermore, FRET measurements allow the subcellular localization of this process during bacterial infection. FRET-based assays are valuable tools to resolve bacteria-induced protein-protein interactions in the context of the intact host cell.</p

Dzyaloshinskii-Moriya interaction and chiral magnetism in 3dd-5dd zig-zag chains: Tight-binding model and ab initio calculations

We investigate the chiral magnetic order in free-standing planar 3$d$-5$d$ bi-atomic metallic chains (3$d$: Fe, Co; 5$d$: Ir, Pt, Au) using first-principles calculations based on density functional theory. We found that the antisymmetric exchange interaction, commonly known as Dzyaloshinskii-Moriya interaction (DMI), contributes significantly to the energetics of the magnetic structure. We used the full-potential linearized augmented plane wave method and performed self-consistent calculations of homogeneous spin spirals, calculating the DMI by treating the effect of spin-orbit interaction (SOI) in the basis of the spin-spiral states in first-order perturbation theory. To gain insight into the DMI results of our ab initio calculations, we develop a minimal tight-binding model of three atoms and 4 orbitals that contains all essential features: the spin-canting between the magnetic $3d$ atoms, the spin-orbit interaction at the $5d$ atoms, and the structure inversion asymmetry facilitated by the triangular geometry. We found that spin-canting can lead to spin-orbit active eigenstates that split in energy due to the spin-orbit interaction at the $5d$ atom. We show that, the sign and strength of the hybridization, the bonding or antibonding character between $d$-orbitals of the magnetic and non-magnetic sites, the bandwidth and the energy difference between states occupied and unoccupied states of different spin projection determine the sign and strength of the DMI. The key features observed in the trimer model are also found in the first-principles results.Comment: 19 page

Clinical presentation of a traumatic cervical spine disc rupture in alpine sports: a case report

Isolated non-skeletal injuries of the cervical spine are rare and frequently missed. Different evaluation algorithms for C-spine injuries, such as the Canadian C-spine Rule have been proposed, however with strong emphasis on excluding osseous lesions. Discoligamentary injuries may be masked by unique clinical situations presenting to the emergency physician. We report on the case of a 28-year-old patient being admitted to our emergency department after a snowboarding accident, with an assumed hyperflexion injury of the cervical spine. During the initial clinical encounter the only clinical finding the patient demonstrated, was a burning sensation in the palms bilaterally. No neck pain could be elicited and the patient was not intoxicated and did not have distracting injuries. Since the patient described a fall prevention attempt with both arms, a peripheral nerve contusion was considered as a differential diagnosis. However, a high level of suspicion and the use of sophisticated imaging (MRI and CT) of the cervical spine, ultimately led to the diagnosis of a traumatic disc rupture at the C5/6 level. The patient was subsequently treated with a ventral microdiscectomy with cage interposition and ventral plate stabilization at the C5/C6 level and could be discharged home with clearly improving symptoms and without further complications

In Vivo Identification of Novel Regulators and Conserved Pathways of Phagocytosis in A. gambiae

SummaryAnopheles gambiae uses effective immune responses, including phagocytosis, to fight microbial infection. We have developed a semiquantitative phagocytosis test and used it in conjunction with dsRNA gene silencing to test the in vivo roles of 71 candidate genes in phagocytosis of Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Here, we show that inactivation of 26 genes changes the phagocytic activity by more than 45% and that two pathways similar to those that mediate apoptotic cell removal in Caenorhabditis elegans are used in A. gambiae for phagocytosis of microorganisms. Simultaneous inactivation of the identified regulators of phagocytosis and conserved components defining each signaling pathway permitted provisional assignment of the novel regulators to one or the other pathway. Pathway inactivation enhances at least three times the ability of E. coli and S. aureus to proliferate in the mosquito. Interestingly, mosquito survival is not compromised even if both pathways are perturbed simultaneously

Increased Osteoclastogenesis in Mice Lacking the Carcinoembryonic Antigen-Related Cell Adhesion Molecule 1

Alterations in bone remodeling are a major public health issue, as therapeutic options for widespread bone disorders such as osteoporosis and tumor-induced osteolysis are still limited. Therefore, a detailed understanding of the regulatory mechanism governing bone cell differentiation in health and disease are of utmost clinical importance. Here we report a novel function of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), a member of the immunoglobulin superfamily involved in inflammation and tumorigenesis, in the physiologic regulation of bone remodeling. Assessing the expression of all members of the murine Ceacam family in bone tissue and marrow, we found CEACAM1 and CEACAM10 to be differentially expressed in both bone-forming osteoblasts and bone-resorbing osteoclasts. While Ceacam10-deficient mice displayed no alteration in structural bone parameters, static histomorphometry demonstrated a reduced trabecular bone mass in mice lacking CEACAM1. Furthermore, cellular and dynamic histomorphometry revealed an increased osteoclast formation in Ceacam1-deficient mice, while osteoblast parameters and the bone formation rate remained unchanged. In line with these findings, we detected accelerated osteoclastogenesis in Ceacam1-deficient bone marrow cells, while osteoblast differentiation, as determined by mineralization and alkaline phosphatase assays, was not affected. Therefore, our results provide in vivo and in vitro evidence for a physiologic role of CEACAM1 in the regulation of osteoclastogenesis

Gegenüberstellung der Simulationsfunktionalitäten von Werkzeugen zur Geschäftsprozessmodellierung

Geschäftsprozesse beschreiben, über die Darstellung von Aktivitäten respektive Vorgängen, die Abläufe der Leistungserstellung in einer Unternehmung. Ziel bei der Planung ist es, die Prozesse so effizient und effektiv wie möglich zu gestalten, um mit möglichst wenig eingesetzten Ressourcen ein vordefiniertes Ziel zu erreichen. Effizienz und Effektivität der Prozesse sind dabei entscheidende Faktoren für die Wettbewerbsposition einer Unternehmung, da die realen Kosten der Leistungserstellung aus den Abläufen, die wiederum Ressourcen beanspruchen, resultieren. Um Geschäftsprozesse zu optimieren, können mathematisch - analytische Verfahren angewandt werden. Diese mathematischen Verfahren erlauben es, Geschäftsprozesse und -ketten als geschlossene Ausdrücke zu formulieren und optimal zu lösen. Die analytischen Verfahren scheitern allerdings, sobald die Geschäftsprozesse eine gewisse Komplexität aufweisen. Gemeint sind hochflexible Geschäftsprozesse, die sich dadurch auszeichnen, dass sie entweder nicht vollständig planbar sind, da prozessrelevante Bezugsgrößen unbekannt oder variabel sind, oder diese nicht losgelöst vom Anwendungskontext betrachtet werden können. Zusätzlich komplexitätssteigernd wirkt sich eine zeitliche Überlappung zwischen Planung und Ausführung des Prozesses aus. Um diese komplexen Geschäftsprozesse nachvollziehen und untersuchen zu können und somit einen Ansatz für die Optimierung zu schaffen, bietet sich hier eine Simulation dieser Prozesse an. Ein Simulationsmodell besteht aus einer möglichst realitätsnahen Nachbildung eines Ablaufs in einem Modell und dient der Entscheidungsunterstützung