DEVELOPMENT AND VALIDATION OF LC-MS/MS METHOD FOR ESTIMATION OF UROCARB IN HUMAN PLASMA

Objective: The present study was aimed to develop a rapid, specific and sensitive method based on LC-MS/MS method was developed for the determination of urocarb using etomidate as an internal standard. Methods: Chromatography was achieved on Discovery C18, 50 × 2.1 mm, 5 μm column. Samples were chromatographed in a gradient mode (eluent A (acetonitrile-water–formic acid, 5: 95: 0.1 v/v), eluent B (acetonitrile–formic acid, 100: 0.1 v/v)). The initial content of the eluent B of 8%, which increases linearly to 1.0 min to 100%, is maintained up to 1.5 min and returned to the original 8% to 1.51 min. The mobile phase was delivered at a flow rate of 0.400 ml/min into the mass spectrometer ESI chamber. The sample volume was 4 μl. Results: The total chromatographic run time was 2.0 min and the elution of urocarb and IS (etomidate) occurred at ~1.53 and 1.67 min, respectively. A linear response function was established at 1-100 ng/ml for urocarb and etomidate in human plasma. The % mean recovery for urocarb in LQC, MQC and HQC was 104.1 %, 100.0 % and 97.4 %. The lowest concentration with the RSD<20% was taken as LLOQ and was found to be 1.03 ng/ml for urocarb. The within-run coefficients of variation ranged between 0.271 % and 0.478 % for urocarb. The within-run percentages of nominal concentrations ranged between 99.12 % and 100.21 % for urocarb. The between-run coefficients of variation ranged between 0.388 % and 0.601 % for urocarb. The between-run percentages of nominal concentrations ranged between 98.78 % and 101.11 % for urocarb. Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible, rapid and high-throughput LC-MS/MS assay was developed and validated to quantify urocarb in human plasma as per the regulatory guidelines. Due to the sensitivity of the developed method, it can be applied to the monitoring of plasma levels in the analysis of drug in preclinical and clinical pharmacokinetic studies. All the parameters and results were found within the acceptance limit as given in the validation protocol

LC-MS/MS METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION FOR THE DETERMINATION OF CARDIAZOL IN HUMAN PLASMA

Objective: The main purpose of this study was to develop a simple, precise, rapid and accurate method for the quantification of cardiazol in human plasma. Methods: Chromatography was achieved on Discovery C18, 50 × 2.1 mm, 5 μm column. Samples were chromatographed in a gradient mode (eluent A (acetonitrile-water–formic acid, 5: 95: 0.1 v/v), eluent B (acetonitrile–formic acid, 100: 0.1 v/v)). The initial content of the eluent B of 8%, which increases linearly to 1.0 min to 100%, is maintained up to 1.5 min and returned to the original 8% to 1.51 min. The mobile phase was delivered at a flow rate of 0.400 ml/min into the mass spectrometer ESI chamber. The sample volume was 300 μl. Results: The total chromatographic run time was 2.5 min and the elution of cardiazol and IS (difenoconazole) occurred at ~2.15 and 1.98 min, respectively. A linear response function was established at 1-100 ng/ml for cardiazol and difenoconazole in human plasma. The % mean recovery for cardiazol in LQC, MQC and HQC was 102.8 %, 100.3 % and 95.9 %. The lowest concentration with the RSD<20% was taken as LLOQ and was found to be 1.10 ng/ml for cardiazol. The % accuracy of LLOQ samples prepared with the different biological matrix lots was found 109.7 %, which were found within the range of 80.00-120.00 % for the seven different plasma lots. % CV for LLOQ samples was observed as 11.9 %, which are within 20.00% of the acceptance criteria. The within-run coefficients of variation ranged between 0.311 % and 0.601 % for cardiazol. The within-run percentages of nominal concentrations ranged between 99.80 % and 100.41 % for cardiazol. The between-run coefficients of variation ranged between 0.332 % and 0.615 % for cardiazol. The between-run percentages of nominal concentrations ranged between 98.18 % and 101.21 % for cardiazol. Conclusion: A rapid method was developed for simultaneous determination of cardiazol in human plasma. The method was strictly validated according to the ICH guidelines. Acquired results demonstrate that the proposed strategy can be effortlessly and advantageously applied for routine examination of cardiazol in human plasma

Розробка методик кількісного визначення субстанції кардіазол з використанням високоефективної рідинної хроматографії

The aim. Development of methods of quantitative determination of Cardiazol substance using high-performance liquid chromatography.Materials and methods. The method of high-performance liquid chromato-graphy (HPLC) was to determine of quantitative determination of Cardiazol substance ([3-Allil-4-(41-methoxyphenyl)-3H-thiazole-2-ylidene]-(32-trifluoro-methylphenyl)amine hydrobromide) using Shimadzu Nexera X2 LC -30AD (Shimad-zu, Japan). The acetonitrile of the HPLC grade (Sigma-Aldrich GmbH, Switzerland) was used in the work and other chemicals and solvents were of analytical grade. The test substance was diluted in acetonitrile at a final concentration of 400 μg/ml.Results and discussion. The method of quantitative determination of Cardiazol substance with the help of highly effective liquid chromatography is developed. The developed conditions of testing are selected experimentally. The following optimal conditions for the chromatographic distribution were found: column C8 (250 *4.6 mm; speed of the mobile phase 1 ml/min; thermostat temperature of the column 35 ° C; detecting wavelength 300 nm; holding time of the test compound is 13.9 min. Suitability of determination methods.The following optimal conditions for chromatographic separation were revealed: a C8 column (250*4.6 mm, a mobile phase speed of 1 ml/min, a column thermostat temperature of 35 °C, a detection wavelength of 300 nm. Under the proposed conditions, the retention time of the tested component is 13.9 minutes. The performance of the column was determined for its main indicators, such as the theoretical number of plates (over 65000) and the coefficient of symmetry (about 1.00). The method of quantitative determination was tested in accordance with the recommendations of the Ukrainian and European Pharmacopoeia. The proposed method meets all requirements. The method has been tested for the effects of various factors such as flow rate, the composition of the mobile phase and the temperature of the column thermostat. It is established that the influence of these factors is insignificant and does not affect the results obtained by this method.Conclusions. An analytical method for quantitative determination of Сardiazole substance with cardioprotective action has been developed on the basis of the high-performance liquid chromatography method. The conditions for chromatographic analysis (HPLC) were standardized. Requirements for the test "Checking the suitability of the chromatographic system" were established. The statistical processing of the results of the experiment shows that the relative uncertainty of the average result was within the permissible limits. The developed method for the determination of Сardiazole will be used for further study of substance as a component of various dosage formsЦель. Разработка методики количественного определения субстанции Кардиазол с использованием високоэффективной жидкостной хроматографииМатериалы и методы. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили анализ субстанции Кардиазол ([3-аллил-4 (41-метоксифенил)-3Н-тиазол-2-илиден] – (32-трифторметилфенил)амина гидро-бромид), используя систему ShimadzuNexeraX2 LC-30AD (Shimadzu, Япония). В работе использовались ацетонитрил класса HPLC (Sigma-Aldrich GmbH, Швейцария), другие химические вещества и растворители аналитического класса. Исследуемую субстанцию Кардиазол растворяли в ацетонитриле с конечной концентрацией 400 мкг/мл.Результаты и обсуждение. Выявлены следующие оптимальные условия хроматографического разделения: колонка C8 (250*4,6 мм, скорость подвижной фазы 1 мл/мин, температура термостата колонки 35 °С, длина волны детектирования 300 нм, время удерживания исследуемого соединения составляет 13,9 мин. Производительность колонки была определена для ее основных показателей, таких как количество теоретическихтарелок (более 65000) и коэффициент симметрии (около 1,00). Методика была валидирована согласно рекомендациям ГФУ. Методика была апробирована на воздействие различных факторов, таких как скорость потока, состав подвижной фазы и температура термостата колонки. Установлено, что влияние этих факторов является незначительным и не влияет на результаты, полученные по этой методике.Выводы. На основе метода высокоэффективной жидкостной хроматографии разработана аналитическая методика количественного определения субстанции кардиопротекторного действия Кардиазола. Стандартизированы условия проведения хроматографического анализа (ВЭЖХ). Установлены требования к тесту «Проверка пригодности хроматографической системы». Статистическая обработка результатов эксперимента показывает, что относительная неопределенность среднего результата находится в допустимых пределах. Разработанная методика будет использована для дальнейшего исследования субстанции как компонента различных лекарственных формМета. Розробка методики кількісного визначення субстанції Кардіазол з використанням високоефективної рідинної хроматографії.Матеріали і методи. Методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) проводили кількісне визначення субстанції Кардіазол ([3-алліл-4-(41-метоксифеніл)-3Н-тіазол-2-іліден]-(32-трифлуорометилфеніл)аміну гідробромід), використовуючи систему ShimadzuNexeraX2 LC-30AD (Shimadzu, Японія). В роботі використовувалися ацетонітрил класу HPLC (Sigma-AldrichGmbH, Швейцарія), інші хімічні речовини та розчинники були аналітичного сорту. Досліджувану субстанцію Кардіазол розчиняли в ацетонітрилі з кінцевою концентрацією 400 мкг/мл.Результати і обговорення. Виявлені наступні оптимальні умови хроматографічного розподілу: колонка C8 (250*4,6 мм; швидкість рухомої фази 1 мл /хв; температура термостату колонки 35 ºС; довжина хвилі детектування 300 нм, час утримування досліджуваної сполуки становить 13,9 хв. Продуктивність колонки була визначена для її основних показників, таких як кількість теоретичних тарілок(більше 65000) і коефіцієнт симетрії (близько 1,00). Методика була валідована згідно з рекомендаціями ДФУ. Методику було апробовано на вплив різних факторів, таких як, швидкість потоку, склад рухомої фази та температура термостату колонки. Встановлено, що вплив цих факторів є незначущим та не впливає на результати, отримані за цією методикою.Висновки. На основі методу високоефективної рідинної хроматографії розроблено аналітичну методику кількісного визначення субстанцiї кардіопротекторної дії Кардіазолу. Стандартизовано умови проведення хроматографічного аналізу (ВЕРХ). Встановлено вимоги до тесту «Перевірка придатності хроматографічної системи». Статистична обробка результатів експерименту свідчить, що відносна невизначеність середнього результату знаходиться у допустимих межах. Розроблена методика буде використана для подальшого дослідження речовини як компонента різних лікарських фор

Розробка методик кількісного визначення субстанції кардіазол з використанням високоефективної рідинної хроматографії

The aim. Development of methods of quantitative determination of Cardiazol substance using high-performance liquid chromatography.Materials and methods. The method of high-performance liquid chromato-graphy (HPLC) was to determine of quantitative determination of Cardiazol substance ([3-Allil-4-(41-methoxyphenyl)-3H-thiazole-2-ylidene]-(32-trifluoro-methylphenyl)amine hydrobromide) using Shimadzu Nexera X2 LC -30AD (Shimad-zu, Japan). The acetonitrile of the HPLC grade (Sigma-Aldrich GmbH, Switzerland) was used in the work and other chemicals and solvents were of analytical grade. The test substance was diluted in acetonitrile at a final concentration of 400 μg/ml.Results and discussion. The method of quantitative determination of Cardiazol substance with the help of highly effective liquid chromatography is developed. The developed conditions of testing are selected experimentally. The following optimal conditions for the chromatographic distribution were found: column C8 (250 *4.6 mm; speed of the mobile phase 1 ml/min; thermostat temperature of the column 35 ° C; detecting wavelength 300 nm; holding time of the test compound is 13.9 min. Suitability of determination methods.The following optimal conditions for chromatographic separation were revealed: a C8 column (250*4.6 mm, a mobile phase speed of 1 ml/min, a column thermostat temperature of 35 °C, a detection wavelength of 300 nm. Under the proposed conditions, the retention time of the tested component is 13.9 minutes. The performance of the column was determined for its main indicators, such as the theoretical number of plates (over 65000) and the coefficient of symmetry (about 1.00). The method of quantitative determination was tested in accordance with the recommendations of the Ukrainian and European Pharmacopoeia. The proposed method meets all requirements. The method has been tested for the effects of various factors such as flow rate, the composition of the mobile phase and the temperature of the column thermostat. It is established that the influence of these factors is insignificant and does not affect the results obtained by this method.Conclusions. An analytical method for quantitative determination of Сardiazole substance with cardioprotective action has been developed on the basis of the high-performance liquid chromatography method. The conditions for chromatographic analysis (HPLC) were standardized. Requirements for the test "Checking the suitability of the chromatographic system" were established. The statistical processing of the results of the experiment shows that the relative uncertainty of the average result was within the permissible limits. The developed method for the determination of Сardiazole will be used for further study of substance as a component of various dosage formsЦель. Разработка методики количественного определения субстанции Кардиазол с использованием високоэффективной жидкостной хроматографииМатериалы и методы. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили анализ субстанции Кардиазол ([3-аллил-4 (41-метоксифенил)-3Н-тиазол-2-илиден] – (32-трифторметилфенил)амина гидро-бромид), используя систему ShimadzuNexeraX2 LC-30AD (Shimadzu, Япония). В работе использовались ацетонитрил класса HPLC (Sigma-Aldrich GmbH, Швейцария), другие химические вещества и растворители аналитического класса. Исследуемую субстанцию Кардиазол растворяли в ацетонитриле с конечной концентрацией 400 мкг/мл.Результаты и обсуждение. Выявлены следующие оптимальные условия хроматографического разделения: колонка C8 (250*4,6 мм, скорость подвижной фазы 1 мл/мин, температура термостата колонки 35 °С, длина волны детектирования 300 нм, время удерживания исследуемого соединения составляет 13,9 мин. Производительность колонки была определена для ее основных показателей, таких как количество теоретическихтарелок (более 65000) и коэффициент симметрии (около 1,00). Методика была валидирована согласно рекомендациям ГФУ. Методика была апробирована на воздействие различных факторов, таких как скорость потока, состав подвижной фазы и температура термостата колонки. Установлено, что влияние этих факторов является незначительным и не влияет на результаты, полученные по этой методике.Выводы. На основе метода высокоэффективной жидкостной хроматографии разработана аналитическая методика количественного определения субстанции кардиопротекторного действия Кардиазола. Стандартизированы условия проведения хроматографического анализа (ВЭЖХ). Установлены требования к тесту «Проверка пригодности хроматографической системы». Статистическая обработка результатов эксперимента показывает, что относительная неопределенность среднего результата находится в допустимых пределах. Разработанная методика будет использована для дальнейшего исследования субстанции как компонента различных лекарственных формМета. Розробка методики кількісного визначення субстанції Кардіазол з використанням високоефективної рідинної хроматографії.Матеріали і методи. Методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) проводили кількісне визначення субстанції Кардіазол ([3-алліл-4-(41-метоксифеніл)-3Н-тіазол-2-іліден]-(32-трифлуорометилфеніл)аміну гідробромід), використовуючи систему ShimadzuNexeraX2 LC-30AD (Shimadzu, Японія). В роботі використовувалися ацетонітрил класу HPLC (Sigma-AldrichGmbH, Швейцарія), інші хімічні речовини та розчинники були аналітичного сорту. Досліджувану субстанцію Кардіазол розчиняли в ацетонітрилі з кінцевою концентрацією 400 мкг/мл.Результати і обговорення. Виявлені наступні оптимальні умови хроматографічного розподілу: колонка C8 (250*4,6 мм; швидкість рухомої фази 1 мл /хв; температура термостату колонки 35 ºС; довжина хвилі детектування 300 нм, час утримування досліджуваної сполуки становить 13,9 хв. Продуктивність колонки була визначена для її основних показників, таких як кількість теоретичних тарілок(більше 65000) і коефіцієнт симетрії (близько 1,00). Методика була валідована згідно з рекомендаціями ДФУ. Методику було апробовано на вплив різних факторів, таких як, швидкість потоку, склад рухомої фази та температура термостату колонки. Встановлено, що вплив цих факторів є незначущим та не впливає на результати, отримані за цією методикою.Висновки. На основі методу високоефективної рідинної хроматографії розроблено аналітичну методику кількісного визначення субстанцiї кардіопротекторної дії Кардіазолу. Стандартизовано умови проведення хроматографічного аналізу (ВЕРХ). Встановлено вимоги до тесту «Перевірка придатності хроматографічної системи». Статистична обробка результатів експерименту свідчить, що відносна невизначеність середнього результату знаходиться у допустимих межах. Розроблена методика буде використана для подальшого дослідження речовини як компонента різних лікарських фор

4-Thiazolidinone derivative Les-3833 effectively inhibits viability of human melanoma cells through activating apoptotic mechanisms

Aim To evaluate cytotoxic action of 4-thiazolidinone derivative Les-3833 and study the mechanisms of its pro-apoptotic action toward human melanoma cells and human tumor cell lines of other tissue origin. Methods The effect of Les-3833 or doxorubicin on the viability of 9 cell lines was studied using MTT assay, while human melanoma cells of WM793 line were additionally examined using light and fluorescent microscopies for evaluating cytomorphological changes. The Western-blot and flow cytometric analyses were carried out to study signaling pathways of melanoma cell cycling and death. Results Les-3833 was the most efficient against melanoma cells. Its half maximal inhibitory concentration (IC50) was 0.22 μg/mL for WM793 cells and 0.3 μg/mL for SK-Mel- 28 melanoma cells. For human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 carcinoma cell lines IC50 was in between 2.5 to >5.0 μg/mL. Les-3833 was relatively not toxic (IC50 > 5 μg/mL) for human embryonic kidney HEK293 cells. Results of Annexin V/PI staining of melanoma cells and activation of caspase 3, PARP, MAPK, and EndoG protein suggest apoptosis in Les-3833-treated cells. Les- 3833 also induced ROS production in melanoma cells and their arrest in G0/G1 phase of cell cycle. Conclusion Novel 4-thiazolidinone derivative Les-3833 is effective against human melanoma cells in vitro, and such effect is tumor specific since it is much less pronounced in human carcinoma and leukemia cells. In melanoma cells Les-3833 induces apoptosis (morphological changes and increased pro-apoptotic proteins), ROS production, and arrest in G0/G1 phase of cell cycle

Synthesis and Anticancer Activity of New Thiopyrano[2,3-d]thiazoles Based on Cinnamic Acid Amides

Novel rel-(5R,6S,7S)-2-oxo-5-phenyl-7-aryl(hetaryl)-3,7-dihydro-2H-thiopyrano [2,3-d]thiazole-6-carboxylic acid amides were synthesized in a hetero-Diels-Alder reaction with a series of cinnamic acid amides. The synthesized compounds were tested for their anticancer activity in vitro in the standard National Cancer Institute 60 cancer cell line assay. Promising compounds 3e, 3g, and 3h with moderate antitumor activity were identified among the synthesized series

Synthesis and Biological Activity of New Thiopyrano[2,3-d]thiazoles Containing a Naphthoquinone Moiety

Novel 11-substituted 3,11-dihydro-2H-benzo[6,7]thiochromeno[2,3-d][1,3]-thiazole-2,5,10-triones 4a–i were synthesized in 75–90% yields via the hetero-Diels-Alder reaction of 5-arylidene-4-thioxo-2-thiazolidinones with 1,4-naphtho-quinone. The synthesized compounds were evaluated for their antineoplastic and antimycobacterial activities. A moderate selectivity against melanoma cancer cells (GI50 (UACC-257-melanoma) = 0.22 μM) was demonstrated for 4i, whereas derivatives 4a, 4c, 4g, and 4h showed promising antimycobacterial activity at a low toxicity level

Arylidene Pyruvic Acids Motif in the Synthesis of New 2<i>H</i>,5<i>H</i>-Chromeno[4′,3′:4,5]thiopyrano[2,3-<i>d</i>]thiazoles via Tandem Hetero-Diels–Alder-Hemiacetal Reaction

<div><p></p><p>We have developed a tandem hetero-Diels–Alder-hemiacetal reaction using arylidene pyruvic acids with 5-(<i>ortho</i>-hydroxybenzylidene)-substituted 4-thioxo-2-thiazolidinones, leading to 6-hydroxy-2-oxo-5-phenyl-3,5a,6,11b-tetrahydro-2<i>H</i>,5<i>H</i>-chromeno[4′,3′:4,5]thiopyrano[2,3-<i>d</i>][1,3]thiazole-6-carboxylic acids. The stereochemistry of cycloaddition was confirmed by NMR spectra and a single-crystal x-ray diffraction analysis.</p></div