Pitx2 cholinergic interneurons are the source of C bouton synapses on brainstem motor neurons

IR and LZ were funded by the European Union, Seventh Framework Programme (FP7/2007–2013), by the European Union and Greek National Funds through the operational program “Education and Lifelong Learning” of the National Strategic Reference Framework, funding program: ARISTEIA II, and by Fondation Santé.Cholinergic neuromodulation has been described throughout the brain and has been implicated in various functions including attention, food intake and response to stress. Cholinergic modulation is also thought to be important for regulating motor systems, as revealed by studies of large cholinergic synapses on spinal motor neurons, called C boutons, which seem to control motor neuron excitability in a task-dependent manner. C boutons on spinal motor neurons stem from spinal interneurons that express the transcription factor Pitx2. C boutons have also been identified on the motor neurons of specific cranial nuclei. However, the source and roles of cranial C boutons are less clear. Previous studies suggest that they originate from Pitx2+ and Pitx2− neurons, in contrast to spinal cord C boutons that originate solely from Pitx2 neurons. Here, we address this controversy using mouse genetics, and demonstrate that brainstem C boutons are Pitx2+ derived. We also identify new Pitx2 populations and map the cholinergic Pitx2 neurons of the mouse brain. Taken together, our data present important new information about the anatomical organization of cholinergic systems which impact motor systems of the brainstem. These findings will enable further analyses of the specific roles of cholinergic modulation in motor control.Publisher PDFPeer reviewe

Peptidergic modulation of motor neuron output via CART signaling at C bouton synapses

Funding: This work was supported by the General Secretariat for Research and Technology (ARISTEIA II 4257, L.Z.), Fondation SANTE (L.Z.), a Marie Curie Re-Integration Grant (268323, L.Z.), the Hellenic Foundation for Research and Innovation (spinMNALS, 4013, L.Z.) and by a St. Andrews Restarting Research Fund (S.A.S. and G.B.M.). S.A.S. was funded by a Royal Society Newton International Fellowship (NIF/R1/180091) and a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Postdoctoral Fellowship (NSERC-PDF-517295-2018) and M.M. by the National Scholarship Foundation (IKY).The intensity of muscle contraction, and therefore movement vigour, needs to be adaptable to enable complex motor behaviors. This can be achieved by adjusting the properties of motor neurons, which form the final common pathway for all motor output from the central nervous system. Here we identify novel roles for a neuropeptide, Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript (CART), in the control of movement vigour. We reveal distinct, but parallel mechanisms by which CART and acetylcholine, both released at C bouton synapses on motor neurons, selectively amplify the output of subtypes of motor neurons that are recruited during intense movement. We find that mice with broad genetic deletion of CART or selective elimination of acetylcholine from C boutons exhibit deficits in behavioral tasks that require higher levels of motor output. Overall, these data uncover novel spinal modulatory mechanisms that control movement vigour to support movements that require a high degree of muscle force.Publisher PDFPeer reviewe

Tectal-derived interneurons contribute to phasic and tonic inhibition in the visual thalamus

The release of GABA from local interneurons in the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN-INs) provides inhibitory control during visual processing within the thalamus. It is commonly assumed that this important class of interneurons originates from within the thalamic complex, but we now show that during early postnatal development Sox14/Otx2-expressing precursor cells migrate from the dorsal midbrain to generate dLGN-INs. The unexpected extra-diencephalic origin of dLGN-INs sets them apart from GABAergic neurons of the reticular thalamic nucleus. Using optogenetics we show that at increased firing rates tectal-derived dLGN-INs generate a powerful form of tonic inhibition that regulates the gain of thalamic relay neurons through recruitment of extrasynaptic high-affinity GABA(A) receptors. Therefore, by revising the conventional view of thalamic interneuron ontogeny we demonstrate how a previously unappreciated mesencephalic population controls thalamic relay neuron excitability.Peer reviewe

Το μεταθετό στοιχείο Minos:Ανάπτυξη συστημάτων για λειτουργική γενωμική ανάλυση στον άνθρωπο και στον ποντικό

The Drosophila hydei transposable element Minos belongs to the mariner-Tc1 superfamily of transposons, members of which are found in diverse eukaryotic organisms. Many members of the superfamily can transpose in organisms evolutionarily distant to the host they were originally isolated from. The only requirements for transposition appear to be the presence of active transposase and intact inverted repeats. In this thesis, the ability of the Minos element to transpose in somatic cells and in the germ line of the mouse (Mus musculus) from one chromosomal position to a new one is demonstrated. This establishes a valuable tool towards functional genomic analysis in the mouse. Furthermore, mouse lines carrying an inducible transposase production system were created. It has previously been demonstrated that the transposable element Minos is a valuable tool for saturating insertional mutagenesis of the genome of HeLa cells. For insertional saturation of cell lines that do not take up DNA efficiently, a large number of transfections would be required. To circumvent this problem, the Minos system was combined with a virus which enters mammalian cells but does not replicate in them (AcNPV, baculovirus). Chimeric Minos-AcNPV vectors were established. Use of these vectors increased the number of clones carrying transposon insertions in various mammalian cell lines, opening the way for functional genomic experiments in many cell types.Το μεταθετό στοιχείο Minos της Drosophila hydei υπάγεται στην υπεροικογένεια μεταθετών στοιχείων mariner-Tc1, μέλη της οποίας απαντώνται σε διάφορους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Πολλά από τα μέλη της υπεροικογένειας έχουν την ικανότητα να μετατίθενται σε ξενιστές εξελικτικά απομακρυσμένους από αυτόν στον οποίο αναγνωρίστηκαν. Η μοναδική προϋπόθεση της μετάθεσης φαίνεται να είναι η ύπαρξη ενεργής τρανσποζάσης και άρτιων κατοπτρικά αντεστραμμένων άκρων. Στην παρούσα διατριβή αποδεικνύεται η ικανότητα του μεταθετού στοιχείου Minos να μετατίθεται από χρωμοσωμικές θέσεις σε νέες χρωμοσωμικές θέσεις, σε σωματικά κύτταρα και σε κύτταρα της γαμετικής σειράς ποντικού (Mus musculus). Η ικανότητά του αυτή το καθιστά πολύτιμο εργαλείο σε πειράματα λειτουργικής γενωμικής ανάλυσης στον ποντικό και προς αυτή την κατεύθυνση, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακές σειρές ποντικών, οι οποίες φέρουν επαγόμενο σύστημα παραγωγής τρανσποζάσης. Το μεταθετό στοιχείο Minos έχει αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο σε πειράματα κορεσμού του γενώματος με ενθέσεις στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά HeLa. Ο κορεσμός με ενθέσεις του γενώματος κυτταρικών σειρών που δε διαμολύνονται με υψηλή συχνότητα απαιτεί μεγάλο αριθμό πειραμάτων διαμόλυνσης. Για αυτό το λόγο το Minos συνδυάστηκε με ιό που εισέρχεται σε κύτταρα θηλαστικών αλλά δεν πολλαπλασιάζεται σε αυτά (AcNPV, baculovirus) και δημιουργήθηκαν χιμαιρικοί φορείς Minos-AcNPV. Οι χιμαιρικοί φορείς αυξάνουν κατά πολύ τον αριθμό των κλώνων που φέρουν ενθέσεις του μεταθετού στοιχείου σε κυτταρικές σειρές από θηλαστικά, ανοίγοντας το δρόμο για την πραγματοποίηση πειραμάτων λειτουργικής γενωμικής σε διάφορους τύπους κυττάρων

The transposable element Minos: development of functional genomic analysis systems in man and mouse

The Drosophila hydei transposable element Minos belongs to the mariner-Tc1 superfamily of transposons, members of which are found in diverse eukaryotic organisms. Many members of the superfamily can transpose in organisms evolutionarily distant to the host they were originally isolated from. The only requirements for transposition appear to be the presence of active transposase and intact inverted repeats. In this thesis, the ability of the Minos element to transpose in somatic cells and in the germ line of the mouse (Mus musculus) from one chromosomal position to a new one is demonstrated. This establishes a valuable tool towards functional genomic analysis in the mouse. Furthermore, mouse lines carrying an inducible transposase production system were created. It has previously been demonstrated that the transposable element Minos is a valuable tool for saturating insertional mutagenesis of the genome of HeLa cells. For insertional saturation of cell lines that do not take up DNA efficiently, a large number of transfections would be required. To circumvent this problem, the Minos system was combined with a virus which enters mammalian cells but does not replicate in them (AcNPV, baculovirus). Chimeric Minos-AcNPV vectors were established. Use of these vectors increased the number of clones carrying transposon insertions in various mammalian cell lines, opening the way for functional genomic experiments in many cell types.Το μεταθετό στοιχείο Minos της Drosophila hydei υπάγεται στην υπεροικογένεια μεταθετών στοιχείων mariner-Tc1, μέλη της οποίας απαντώνται σε διάφορους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Πολλά από τα μέλη της υπεροικογένειας έχουν την ικανότητα να μετατίθενται σε ξενιστές εξελικτικά απομακρυσμένους από αυτόν στον οποίο αναγνωρίστηκαν. Η μοναδική προϋπόθεση της μετάθεσης φαίνεται να είναι η ύπαρξη ενεργής τρανσποζάσης και άρτιων κατοπτρικά αντεστραμμένων άκρων. Στην παρούσα διατριβή αποδεικνύεται η ικανότητα του μεταθετού στοιχείου Minos να μετατίθεται από χρωμοσωμικές θέσεις σε νέες χρωμοσωμικές θέσεις, σε σωματικά κύτταρα και σε κύτταρα της γαμετικής σειράς ποντικού (Mus musculus). Η ικανότητά του αυτή το καθιστά πολύτιμο εργαλείο σε πειράματα λειτουργικής γενωμικής ανάλυσης στον ποντικό και προς αυτή την κατεύθυνση, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακές σειρές ποντικών, οι οποίες φέρουν επαγόμενο σύστημα παραγωγής τρανσποζάσης. Το μεταθετό στοιχείο Minos έχει αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο σε πειράματα κορεσμού του γενώματος με ενθέσεις στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά HeLa. Ο κορεσμός με ενθέσεις του γενώματος κυτταρικών σειρών που δε διαμολύνονται με υψηλή συχνότητα απαιτεί μεγάλο αριθμό πειραμάτων διαμόλυνσης. Για αυτό το λόγο το Minos συνδυάστηκε με ιό που εισέρχεται σε κύτταρα θηλαστικών αλλά δεν πολλαπλασιάζεται σε αυτά (AcNPV, baculovirus) και δημιουργήθηκαν χιμαιρικοί φορείς Minos-AcNPV. Οι χιμαιρικοί φορείς αυξάνουν κατά πολύ τον αριθμό των κλώνων που φέρουν ενθέσεις του μεταθετού στοιχείου σε κυτταρικές σειρές από θηλαστικά, ανοίγοντας το δρόμο για την πραγματοποίηση πειραμάτων λειτουργικής γενωμικής σε διάφορους τύπους κυττάρων

Μελέτη της ενεργότητας του μεταθετού στοιχείου Minos σε κύτταρα θηλαστικών

Διατμηματικό, συνεργαζόμενα Τμήματα Βιολογίας και Ιατρικής. Here we report a study of the activity of Minos transposable element in the HeLa cells. Transfection experiments with two donor plasmids carrying different in size transposons (2 kb and 8.2 kb) were performed in order to determine the effect of the transposon size to the efficiency of the transposase-mediated integrations into the genome. The efficiency was found to drastically decrease when the 8.2 kb transposon was used. The ratio of transposase vs transposon that leads to the highest number of transposase-mediated integrations was also determined. Stably transformed clones were created such as remobilization of the transposon to be assayable, in order to assess the property of Minos to transpose to a new position in the genome.Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η ενεργότητα του μεταθετού στοιχείου Minos σε κύτταρα HeLa. Πραγματοποιήθηκαν διαμολύνσεις με δύο πλασμίδια δότες που έφεραν διαφορετικού μεγέθους μεταθέματα (2kb και 8.2kb), απουσία και παρουσία πηγής τρανσποζάσης, για να ελεγχθεί η επίδραση του μεγέθους του μεταθέματος στη συχνότητα των ενθέσεων (transposase mediated insertions). Bρέθηκε ότι με τη χρήση του μεγάλου μεταθέματος μειώνεται δραστικά η συχνότητα αυτή. Eπίσης ελέγχθηκε η αναλογία συγκέντρωσης πλασμιδίου δότη και βοηθού που οδηγεί σε μέγιστο αριθμό σταθερά μετασχηματισμένων μέσω τρανσποζάσης κλώνων. Tέλος δημιουργήθηκαν σταθερά μετασχηματισμένοι κλώνοι κυττάρων HeLa, με κατάλληλο μετάθεμα, έτσι ώστε στο μέλλον να ελεγχθεί η κινητοποίηση ενός Minos μεταθέματος μέσα στο γένωμα των κυττάρων αυτών

Synaptic mechanisms underlying modulation of locomotor-related motoneuron output by premotor cholinergic interneurons

Spinal motor networks are formed by diverse populations of interneurons that set the strength and rhythmicity of behaviors such as locomotion. A small cluster of cholinergic interneurons, expressing the transcription factor Pitx2, modulates the intensity of muscle activation via ‘C-bouton’ inputs to motoneurons. However, the synaptic mechanisms underlying this neuromodulation remain unclear. Here, we confirm in mice that Pitx2+ interneurons are active during fictive locomotion and that their chemogenetic inhibition reduces the amplitude of motor output. Furthermore, after genetic ablation of cholinergic Pitx2+ interneurons, M2 receptor-dependent regulation of the intensity of locomotor output is lost. Conversely, chemogenetic stimulation of Pitx2+ interneurons leads to activation of M2 receptors on motoneurons, regulation of Kv2.1 channels and greater motoneuron output due to an increase in the inter-spike afterhyperpolarization and a reduction in spike half-width. Our findings elucidate synaptic mechanisms by which cholinergic spinal interneurons modulate the final common pathway for motor output

Locomotor Rhythm Generation Linked to the Output of Spinal Shox2 Excitatory Interneurons

Locomotion is controlled by spinal networks that generate rhythm and coordinate left-right and flexor-extensor patterning. Defined populations of spinal interneurons have been linked to patterning circuits; however, neurons comprising the rhythm-generating kernel have remained elusive. Here, we identify an ipsilaterally projecting excitatory interneuron population, marked by the expression of Shox2 that overlaps partially with V2a interneurons. Optogenetic silencing or blocking synaptic output of Shox2 interneurons (INs) in transgenic mice perturbed rhythm without an effect on pattern generation, whereas ablation of the Shox2 IN subset coinciding with the V2a population was without effect. Most Shox2 INs are rhythmically active during locomotion and analysis of synaptic connectivity showed that Shox2 INs contact other Shox2 INs, commissural neurons, and motor neurons, with preference for flexor motor neurons. Our findings focus attention on a subset of Shox2 INs that appear to participate in the rhythm-generating kernel for spinal locomotion