Brucella abortus senses the intracellular environment through the BvrR/Bvrs two-component system, which allows B. abortus to adapt to its replicative nich

Brucella abortus is a facultative extracellular-intracellular pathogen belonging to a group of Alphaproteobacteria that establishes close interactions with animal cells. This bacterium enters host cells in a membrane-bound compartment, avoiding the lysosomal route and reaching the endoplasmic reticulum through the action of the type IV secretion system, VirB. In this work, we demonstrate that the BvrR/BvrS two-component system senses the intracellular environment to mount the transcriptional response required for intracellular life adaptation. By combining a method to purify intracellularly extracted bacteria with a strategy that allows direct determination of BvrR phosphorylation, we showed that upon entrance to host cells, the regulatory protein BvrR was activated (BvrR-P) by phosphorylation at aspartate 58. This activation takes place in response to intracellular cues found in early compartments, such as low pH and nutrient deprivation. Furthermore, BvrR activation was followed by an increase in the expression of VjbR and VirB. The in vitro activation of this BvrR-P/VjbR/VirB virulence circuit rescued B. abortus from the inhibition of intracellular replication induced by bafilomycin treatment of cells, demonstrating the relevance of this mechanism for intracellular bacterial survival and replication. All together, our results indicate that B. abortus senses the transition from the extracellular to the intracellular milieu through BvrR/BvrS, allowing the bacterium to transit safely to its replicative niche. These results serve as a working model for understanding the role of this family of two-component systems in the adaptation to intracellular life of AlphaproteobacteriaBrucella abortus es un patógeno facultativo extracelular-intracelular perteneciente a un grupo de alfaproteobacterias que establece estrechas interacciones con las células animales. Esta bacteria entra en las células huéspedes en un compartimento unido a la membrana, evitando la ruta lisosómica y llegando al retículo endoplásmico por la acción del sistema de secreción de tipo IV, VirB. En este trabajo, demostramos que el sistema de dos componentes BvrR/BvrS detecta el entorno intracelular para montar la respuesta transcripcional necesaria para la adaptación de la vida intracelular. Combinando un método para purificar las bacterias extraídas intracelularmente con una estrategia que permite la determinación directa de la fosforilación de BvrR, demostramos que al entrar en las células huéspedes, la proteína reguladora BvrR fue activada (BvrR-P) por la fosforilación en el aspartato 58. Esta activación tiene lugar en respuesta a las señales intracelulares encontradas en los primeros compartimentos, como el bajo pH y la privación de nutrientes. Además, a la activación de BvrR le siguió un aumento de la expresión de VjbR y VirB. La activación in vitro de este circuito de virulencia BvrR-P/VjbR/VirB rescató a B. abortus de la inhibición de la replicación intracelular inducida por el tratamiento de las células con bafilomicina, lo que demuestra la importancia de este mecanismo para la supervivencia y la replicación de las bacterias intracelulares. En conjunto, nuestros resultados indican que B. abortus percibe la transición del medio extracelular al intracelular a través de BvrR/BvrS, permitiendo a la bacteria transitar con seguridad a su nicho de replicación. Estos resultados sirven como modelo de trabajo para comprender el papel de esta familia de sistemas de dos componentes en la adaptación a la vida intracelular de las alfaproteobacterias.Universidad Nacional, Costa RicaEscuela de Medicina Veterinari

Senses the Intracellular Environment through the BvrR/BvrS Two-Component System, Which Allows To Adapt to Its Replicative Niche

Brucella abortus is a facultative extracellular-intracellular pathogen belonging to a group of Alphaproteobacteria that establishes close interactions with animal cells. This bacterium enters host cells in a membrane-bound compartment, avoiding the lysosomal route and reaching the endoplasmic reticulum through the action of the type IV secretion system, VirB. In this work, we demonstrate that the BvrR/BvrS two-component system senses the intracellular environment to mount the transcriptional response required for intracellular life adaptation. By combining a method to purify intracellularly extracted bacteria with a strategy that allows direct determination of BvrR phosphorylation, we showed that upon entrance to host cells, the regulatory protein BvrR was activated (BvrR-P) by phosphorylation at aspartate 58. This activation takes place in response to intracellular cues found in early compartments, such as low pH and nutrient deprivation. Furthermore, BvrR activation was followed by an increase in the expression of VjbR and VirB. The in vitro activation of this BvrR-P/VjbR/VirB virulence circuit rescued B. abortus from the inhibition of intracellular replication induced by bafilomycin treatment of cells, demonstrating the relevance of this mechanism for intracellular bacterial survival and replication. All together, our results indicate that B. abortus senses the transition from the extracellular to the intracellular milieu through BvrR/BvrS, allowing the bacterium to transit safely to its replicative niche. These results serve as a working model for understanding the role of this family of two-component systems in the adaptation to intracellular life of Alphaproteobacteria.Universidad de Costa Rica/[803-B3-761]/UCR/Costa RicaUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias de la Salud::Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET

Senses the Intracellular Environment through the BvrR/BvrS Two-Component System, Which Allows To Adapt to Its Replicative Niche

Brucella abortus is a facultative extracellular-intracellular pathogen belonging to a group of Alphaproteobacteria that establishes close interactions with animal cells. This bacterium enters host cells in a membrane-bound compartment, avoiding the lysosomal route and reaching the endoplasmic reticulum through the action of the type IV secretion system, VirB. In this work, we demonstrate that the BvrR/BvrS two-component system senses the intracellular environment to mount the transcriptional response required for intracellular life adaptation. By combining a method to purify intracellularly extracted bacteria with a strategy that allows direct determination of BvrR phosphorylation, we showed that upon entrance to host cells, the regulatory protein BvrR was activated (BvrR-P) by phosphorylation at aspartate 58. This activation takes place in response to intracellular cues found in early compartments, such as low pH and nutrient deprivation. Furthermore, BvrR activation was followed by an increase in the expression of VjbR and VirB. The in vitro activation of this BvrR-P/VjbR/VirB virulence circuit rescued B. abortus from the inhibition of intracellular replication induced by bafilomycin treatment of cells, demonstrating the relevance of this mechanism for intracellular bacterial survival and replication. All together, our results indicate that B. abortus senses the transition from the extracellular to the intracellular milieu through BvrR/BvrS, allowing the bacterium to transit safely to its replicative niche. These results serve as a working model for understanding the role of this family of two-component systems in the adaptation to intracellular life of Alphaproteobacteria.Universidad de Costa Rica/[803-B3-761]/UCR/Costa RicaUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias de la Salud::Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET

Phenotypes controlled by the Brucella abortus two component system BvrR/BvrS are differentially impacted by BvrR phosphorylation

Brucella abortus is a zoonotic pathogen whose virulence depends on its ability to survive intracellularly at the endoplasmic reticulum derived compartment. The two-component system BvrR/BvrS (BvrRS) is essential for intracellular survival due to the transcriptional control of the type IV secretion system VirB and its transcriptional regulator VjbR. It is a master regulator of several traits including membrane homeostasis by controlling gene expression of membrane components, such as Omp25. BvrR phosphorylation is related to DNA binding at target regions, thereby repressing or activating gene transcription. To understand the role of BvrR phosphorylation we generated dominant positive and negative versions of this response regulator, mimicking phosphorylated and non-phosphorylated BvrR states and, in addition to the wild-type version, these variants were introduced in a BvrR negative background. We then characterized BvrRS-controlled phenotypes and assessed the expression of proteins regulated by the system. We found two regulatory patterns exerted by BvrR. The first pattern was represented by resistance to polymyxin and expression of Omp25 (membrane conformation) which were restored to normal levels by the dominant positive and the wild-type version, but not the dominant negative BvrR. The second pattern was represented by intracellular survival and expression of VjbR and VirB (virulence) which were, again, complemented by the wild-type and the dominant positive variants of BvrR but were also significantly restored by complementation with the dominant negative BvrR. These results indicate a differential transcriptional response of the genes controlled to the phosphorylation status of BvrR and suggest that unphosphorylated BvrR binds and impacts the expression of a subset of genes. We confirmed this hypothesis by showing that the dominant negative BvrR did not interact with the omp25 promoter whereas it could interact with vjbR promoter. Furthermore, a global transcriptional analysis revealed that a subset of genes responds to the presence of the dominant negative BvrR. Thus, BvrR possesses diverse strategies to exert transcriptional control on the genes it regulates and, consequently, impacting on the phenotypes controlled by this response regulator.Brucella abortus es un patógeno zoonótico cuya virulencia depende de su capacidad para sobrevivir intracelularmente en el compartimento derivado del retículo endoplásmico. El sistema de dos componentes BvrR/BvrS (BvrRS) es esencial para la supervivencia intracelular debido al control transcripcional del sistema de secreción de tipo IV VirB y su regulador transcripcional VjbR. Es un regulador maestro de varios rasgos, incluida la homeostasis de la membrana mediante el control de la expresión génica de componentes de la membrana, como Omp25. La fosforilación de BvrR está relacionada con la unión al ADN en regiones diana, reprimiendo o activando así la transcripción génica. Para comprender el papel de la fosforilación de BvrR, generamos versiones dominantes positivas y negativas de este regulador de respuesta, imitando estados fosforilados y no fosforilados de BvrR y, además de la versión de tipo salvaje, estas variantes se introdujeron en un fondo negativo de BvrR. A continuación, caracterizamos los fenotipos controlados por BvrRS y evaluamos la expresión de las proteínas reguladas por el sistema. Encontramos dos patrones reguladores ejercidos por BvrR. El primer patrón estaba representado por la resistencia a la polimixina y la expresión de Omp25 (conformación de la membrana), que fueron restauradas a niveles normales por la versión dominante positiva y la versión de tipo salvaje, pero no por la BvrR dominante negativa. El segundo patrón estaba representado por la supervivencia intracelular y la expresión de VjbR y VirB (virulencia) que, de nuevo, se complementaban con las variantes de tipo salvaje y dominante positivo del BvrR, pero que también se restablecían significativamente mediante la complementación con el BvrR dominante negativo. Estos resultados indican una respuesta transcripcional diferencial de los genes controlados al estado de fosforilación del BvrR y sugieren que el BvrR no fosforilado se une e impacta en la expresión de un subconjunto de genes. Confirmamos esta hipótesis demostrando que el BvrR dominante negativo no interactuaba con el promotor de omp25, mientras que sí podía hacerlo con el promotor de vjbR. Además, un análisis transcripcional global reveló que un subconjunto de genes responde a la presencia del BvrR dominante negativo. Así pues, el BvrR posee diversas estrategias para ejercer control transcripcional sobre los genes que regula y, en consecuencia, incidir en los fenotipos controlados por este regulador de respuesta.Universidad Nacional, Costa RicaEscuela de Medicina Veterinari

Virulent Brucella nosferati infecting Desmodus rotundus has emerging potential due to the broad foraging range of its bat host for humans and wild and domestic animals

Desmodus rotundus, vampire bats, transmit dangerous infections, and brucellosis is a hazardous zoonotic disease, two adversities that coexist in the subtropical and tropical areas of the American continent. Here, we report a 47.89% Brucella infection prevalence in a colony of vampire bats inhabiting the tropical rainforest of Costa Rica. The bacterium induced placentitis and fetal death in bats. Wide-range phenotypic and genotypic characterization placed the Brucella organisms as a new pathogenic species named Brucella nosferati sp. nov., isolated from bat tissues, including the salivary glands, suggesting feeding behavior might favor transmission to their prey. Overall analyses placed B. nosferati as the etiological agent of a reported canine brucellosis case, demonstrating its potential for infecting other hosts. To assess the putative prey hosts, we analyzed the intestinal contents of 14 infected and 23 non-infected bats by proteomics. A total of 54,508 peptides sorted into 7,203 unique peptides corresponding to 1,521 proteins were identified. Twenty-three wildlife and domestic taxa, including humans, were foraged by B. nosferati-infected D. rotundus, suggesting contact of this bacterium with a broad range of hosts. Our approach is appropriate for detecting, in a single study, the prey preferences of vampire bats in a diverse area, demonstrating its suitability for control strategies where vampire bats thrive.Desmodus rotundus, los murciélagos vampiro, transmiten infecciones peligrosas, y la brucelosis es una peligrosa enfermedad zoonótica, dos adversidades que coexisten en las zonas subtropicales y tropicales del continente americano. Aquí se informa de una prevalencia de infección por Brucella del 47,89% en una colonia de murciélagos vampiro que habitan la selva tropical de Costa Rica. La bacteria indujo placentitis y muerte fetal en los murciélagos. Una amplia caracterización fenotípica y genotípica situó a los organismos de Brucella como una nueva especie patógena denominada Brucella nosferati sp. nov., aislada de tejidos de murciélagos, incluidas las glándulas salivales, lo que sugiere que el comportamiento alimentario podría favorecer la transmisión a sus presas. Los análisis globales situaron a B. nosferati como agente etiológico de un caso de brucelosis canina notificado, lo que demuestra su potencial para infectar a otros hospedadores. Para evaluar los posibles huéspedes presa, analizamos mediante proteómica el contenido intestinal de 14 murciélagos infectados y 23 no infectados. Se identificó un total de 54.508 péptidos clasificados en 7.203 péptidos únicos correspondientes a 1.521 proteínas. D. rotundus infectado con B. nosferati se alimentó de veintitrés taxones de fauna silvestre y doméstica, incluidos los humanos, lo que sugiere el contacto de esta bacteria con una amplia gama de hospedadores. Nuestro enfoque es apropiado para detectar, en un solo estudio, las preferencias de presa de los murciélagos vampiro en una zona diversa, lo que demuestra su idoneidad para las estrategias de control donde prosperan los murciélagos vampiro. IMPORTANCIA: El descubrimiento de que una elevada proporción de murciélagos vampiro en una zona tropical está infectada con Brucella nosferati patógena y que los murciélagos se alimentan de seres humanos y muchos animales salvajes y domésticos es relevante desde la perspectiva de la prevención de enfermedades emergentes. En efecto, los murciélagos que albergan B. nosferati en sus glándulas salivales pueden transmitir esta bacteria patógena a otros huéspedes. Este potencial no es trivial ya que, además de la patogenicidad demostrada, esta bacteria posee todo el arsenal virulento necesario de los organismos Brucella peligrosos, incluidos los que son zoonóticos para el ser humano. Nuestro trabajo ha sentado las bases para futuras acciones de vigilancia en los programas de control de la brucelosis en los que prosperan estos murciélagos infectados. Además, nuestra estrategia para identificar el área de alimentación de los murciélagos puede adaptarse para explorar los hábitos alimentarios de diversos animales, incluidos los artrópodos vectores de enfermedades infecciosas, y por tanto ser de interés para un público más amplio, además de los expertos en Brucella y murciélagos.Universidad Nacional, Costa RicaEscuela de Medicina Veterinari