All-Trans Retinoik Asit (Atra) ve 1Α,25-Dihidroksivitamin D3 (Vitamin D3) ile Uyarılan Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinin T Hücre Yanıtları Üzerine Etkisi

ATRA and D3 are the active metabolites of vitamin A and D, respectively. In this study, HL-60 myeloid leukemia cells were progressed through different maturation stages with ATRA, D3, LPS, and IFN-γ. For the determination of monocytic and/or granulocytic differentiation and theirfunctional differences, cell surface markers, cell morphology, cellular density, proliferation, and capacities of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) production were assessed. The aim of the study was to determine the expression of co-stimulatory and co-inhibitory molecules expressed by AML cells and their effects on T cell proliferation. Upon treatment with ATRA the promyelocytic/myeloblastic control HL-60 cells gained metamyelocytic morphology whereas promonocyte-like cells were abundant with D3 stimulation. CD11b and CD11c expression was significantly increased with ATRA stimulation; in addition to those markers CD14 was also induced with D3. These markers, especially CD11b, was associated with high cellular density. There was an inverse correlation between CD11b levels and cell proliferation. No prominent response to LPS was observed with these cells however stimulation with IFN-γ increased co-inhibitory B7-H1 and B7-DC, and decreased co-stimulatory B7-H2 molecules' expression. In addition, CD11b+ cells were identified to be the sub-population carrying CD86, B7-H1, and B7-DC molecules. In all differentiation groups, IFN-γ induced the expression of CD14 and HLA-DR, and especially of TLR4 in ATRA-stimulated HL-60 cells. In the co-cultures with T cells, the immune stimulatory capacity of CD11b+ HL-60 cells that were proceeded through different myeloid maturation/differentiation stages with ATRA or D3 was sustained. On the other hand, when CD11b+ cells (especially that of the D3-stimulated group) were developed in the presence of IFN-γ, CD4+ or CD8+ T cell stimulation were limited and/or suppressed.ATRA ve D3, sırasıyla, A ve D vitaminlerinin en aktif metabolitleridir. Bu çalışmada ATRA, D3, LPS ve IFN-γ ajanlarından faydalanılarak HL-60 miyeloid lösemi hücreleri farklı olgunlaşma basamaklarına ilerletildi. Monositik ve/veya granülositik serileri veya fonksiyonel farklarının ayırt edilmesini sağlayan yüzey belirteçleri, hücre morfolojisi, hücresel yoğunluk, çoğalma, reaktif oksijen türleri (ROS) ve nitrik oksit (NO) üretme kapasiteleri değerlendirildi. Farklı olgunlaşma aşamalarında bulunan AML hücrelerinin sahip oldukları ko-stimülatör ve ko-inhibitör moleküllerin düzeyleri ve T hücrelerin proliferasyon yanıtları üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlandı. Promiyelositik/miyeloblastik kontrol HL-60 hücrelerinin ATRA ile uyarımı sonrasında metamiyelositik morfolojinin baskın olduğu görüldü. D3 uyarımı ile bu hücrelerde promonosit-benzeri karakterler gözlendi. ATRA, CD11b ve CD11c; D3 ise bu belirteçlere ek olarak CD14+ hücre oranlarını belirgin düzeyde artırdı. Bu belirteçlerin, özellikle CD11b düzeyi hücresel yoğunluk artışı ile ilişkilendirildi. CD11b ekspresyon düzeyi ile hücre çoğalması ters korelasyon göstermekteydi. Bu hücrelerde LPS'e karşı belirgin bir yanıt görülmezken, IFN-γ uyarımı B7-H1 ve B7-DC ko-inhibitör moleküllerinin ekspresyonunu artırdı, B7-H2 ko-aktivatör molekülünde düşüşe neden oldu. Ayrıca, CD11b+ hücrelerin CD86, B7-H1 ve B7-DC moleküllerini yaygın olarak taşıyan alt-popülasyon olduğu saptandı. IFN-γ, tüm HL-60 farklılaşma gruplarında CD14 ve HLA-DR; ATRA ile uyarılmış hücrelerde ise TLR4 artışına da neden oldu. T hücre ko-kültür deneylerinde ATRA veya D3 inkübasyonu ile miyeloid olgunlaşma/farklılaşma basamaklarına ilerletilen CD11b+ HL-60 hücrelerinin immün uyarıcılığının devam ettiği gösterildi. IFN-γ varlığında geliştirilen CD11b+ hücrelerinin (özellikle D3 ile uyarılan grubun) ise, CD8+ ve CD4+ T hücreleri sınırlı düzeyde uyardığı ve/veya baskılayabildiği belirlendi

Cxcl Kemokı̇n ÖncüL Dı̇zelerı̇nden Türevlenen Küçük Peptı̇t MoleküLlerı̇nin İmmün Düzenleyı̇cı̇ Etkı̇sinin Değerlendirmesı̇

Peptide structured small molecules function in the regulation of a variety of physiological processes and intercellular communication. In this study, precursor sequences of known 17 CXCL chemokine molecules were analyzed through a rationalistic and genuine algorithm. Small peptide molecules derived from these precursor sequences were determined and those (15 out of 17 molecules) which are appropriate for synthesis and in vitro testing were selected. The effects of these molecules on activation, proliferation and cytokine synthesis of immune cells in peripheral blood were assayed in the presence of various stimulants. Small peptide molecules derived from CXCL chemokine precursors (11 molecules) were determined with a potential to modulate immune responses. Three molecules (Pep8, Pep14, Pep17-2) determined to possess the highest impact were synthesized and labeled with fluorescein and data were gathered on their interaction with specific types of immune cells. In conclusion, our study was demonstrated that many peptide derivatives synthesized affect the immune responses in different aspects and various sensitivities. These small peptide molecules interacted with especially myeloid cells. These interaction capacities of small peptide molecules were considered to be candidates for targeting acute myeloid leukemia (AML) cells. The highest interaction between peptides and AML cell lines was observed between Pep14 and THP-1, which is a monocytic subgroup of AML cell lines. We observed that CD11bhigh cells more prone to uptake these peptides compared to CD11blow ones. These small peptides specific endocytosis mechanisms were evaluated and it was observed that they can use all endocytic pathways.TÜBİTAKİÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iii ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER ve KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xv TABLOLAR xx 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Doğal İmmünite Ve İnflamasyon 4 2.2. Miyeloid Hücre Gelişimi 8 2.3. Kemokinler 11 2.3.1. Kemotaksis 11 2.3.2. Kemokin Ailesi 13 2.4. İnflamasyon Ve CXCL Kemokinler 14 2.5. Kemokin Biyosentezi 18 2.5.1. Kemokinlerin Hücre İçi Taşınımı Ve Salımı 19 2.5.2. Kemokinlerin Post-Translasyonel Modifikasyon İle Biyoaktivite Kazanması 20 2.5.3. Alternatif Kesimler Sonucu Açığa Çıkan Küçük Peptit Moleküllerinin Biyoaktif Özellikleri 24 2.6. Küçük Peptitlerin Hücreler İle Etkileşimi 25 2.7.Endositoz 29 2.7.1. Klatrin-Aracılı Endositoz (Clathrin-Mediated Endocytosis) 30 2.7.2 Kaveol-Aracılı Endositoz (Caveolae-Mediated Endocytosis) 31 2.7.3 Makropinositoz 32 ix 2.7.4 Fagositoz 34 3. GEREÇ VE YÖNTEM 36 3.1. Çalışmada Kullanılan Malzemeler 36 3.2. Hazırlanan Tampon Ve Çözeltiler 37 3.3. Cxcl Kemokinlerine Ait Öncül Peptit Dizilerinin Belirlenmesinde Kullanılan Tasarım Algoritması 38 3.4. Küçük Peptit Moleküllerinin Sentezi Ve Çözülmesi 40 3.5. İnsan Periferik Kan Mononükleer (Pkm) ve Polimorfonükleer (Pmn) Hücre İzolasyonu 40 3.6. Lökosit Alt-Tiplerinin Saflaştırılması 41 3.6.1 Manyetik-Aktive Hücre Ayrımlaması (Magnetic-Activated Cell Sorting, Macs) 43 3.6.2 Floresan-Aktive Hücre Ayrımlaması (Fluorescence-Activated Cell Sorting, Facs) 43 3.7. Hücre Sayımı 44 3.8. Hücre Kültürü 45 3.9. Mtt Yöntemi İle Canlılık Analizleri 45 3.10. Pkm Hücrelerinin Uyarılması 46 3.11. Akım Sitometri Analizleri 47 3.12. Karboksi Floresan Süksinimidil Ester (Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester, Cfse) Boyama İle Hücre Çoğalma Analizi 49 3.13. Enzim İlintili İmmün Test (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Elısa) Deneyleri 50 3.15. Hücre Yüzey Floresan Işımasının Söndürülmesi (Quenching) 54 3.16. Endositoz İnhibitörlerinin Toksik Olmayan Dozlarının Belirlenmesi 54 3.17. Küçük Peptit Moleküllerinin Hücre İçine Alım Yollarının Belirlenmesi 55 3.18. Floresan Mikroskopi 56 3.19. İstatistiksel Analizler 56 4. BULGULAR 57 x 4.1. CXCL Kemokinlere Ait Öncül Peptit Dizilerinin İn Silico Analizler İle Tasarlanması 57 4.2. Belirlenen CXCL Öncül Dizilerinden Türevlenen Küçük Peptitlerin Periferik Kan Hücrelerinin Canlılığına Etkisi 69 4.3. CXCL Öncül Dizilerinden Türevlenen Küçük Peptit Moleküllerinin Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Aktivasyonuna Etkileri 73 4.4. CXCL Öncül Dizilerinden Türevlenen Küçük Peptit Moleküllerinin Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Çoğalması Üzerine Etkileri 80 4.5. CXCL Öncül Peptit Dizilerinden Türevlenen Küçük Moleküllerin Periferik Kan Mononükleer (PKM) Hücrelerinden Üretilen Salgılanan Sitokin Düzeyleri Üzerine Etkileri 83 4.6. Pep8, Pep14 Ve Pep17-2 Küçük Peptitlerinin İmmün Hücreler İle Etkileşimi 88 4.7. Pep8, Pep14 Ve Pep17-2 Küçük Peptitlerinin Lökositler İle Zaman Ve Sıcaklığa Bağlı Etkileşimi 4.8. Pep8, Pep14 Ve Pep17-2 Küçük Peptitlerinin Periferik Kan Lökositleri İle Etkileşiminin Floresan Mikroskopi Doğrulaması 4.9. Pep8, Pep14 Ve Pep17-2 Peptit Moleküllerinin Lösemi Hücre Hatları İle 93 97 Miyeloid Hücre Etkileşimi 100 4.10. Pep8, Pep14 Ve Pep17-2’nin Miyeloid Hücrelerle Etkileşim Kapasitesinin Hücrelerin Olgunluk Düzeyi İle İlişkisi. 116 4.11. Pep8, Pep14 Ve Pep17-2 Küçük Peptit Moleküllerinin Hücre İçine Alım Mekanizmalarının Araştırılması 117 5. TARTIŞMA 122 6. SONUÇ ve ÖNERİLER 140 7. KAYNAKLAR 143 8. EKLER EK-1: Tez Çalışması İle İlgili Etik Kurul İzinleri EK-2. Orjinallik Ekran Çıktısı EK-3. Dijital Makbuz 9.ÖZGEÇMİŞPeptit yapılı küçük moleküller pek çok fizyolojik sürecin düzenlenmesinde ve hücrelerarası iletişimin sağlanmasında rol alır. Bu çalışmada, bilinen 17 adet insan CXCL kemokin öncül dizilerinden türevlenen küçük peptit molekülleri rasyonel ve özgün bir algoritma ile irdelemiş, bu dizilerden türevlenen küçük peptit molekülleri belirlenmiş ve in vitro kullanıma uygun olacak ve sentezlenmesi mümkün peptitler (15 molekül) seçilmiştir. İlgili küçük peptit moleküllerinin periferik kan immün hücrelerinin çeşitli uyaranlar altında aktivasyonunu, çoğalmasını ve sitokin sentezini nasıl etkilediği araştırıldı. İmmün düzenleyici etki gösterme olasılığı olan CXCL kemokin öncül dizilerinden türevlenen küçük peptit molekülleri saptandı. En yüksek etkiye sahip olduğu belirlenen üç molekül (Pep8, Pep14 ve Pep17-2) floresan ile işaretli olarak sentezletildi ve hangi immün hücre tipleri ile daha çok etkileştikleri hakkında bilgiler edinildi. Çalışmamız sonucunda elde edilen pek çok peptit türevinin immün yanıtları farklı açılardan ve farklı hassasiyette etkileyebileceği sonucuna varıldı. Bu küçük peptit moleküllerinin en çok miyeloid hücreler ile etkileşim gösterdiği belirlendi. Bu etkileşim kapasitelerinden dolayı akut miyeloid lösemi (AML) hücrelerini hedeflemede kullanılabilecek adaylar olduğu düşünüldü. AML hücre hatlarının özellikle monositik alt-tipi olan THP-1 hücre hattı ile Pep14 arasında en yüksek etkileşim görüldü. Genel olarak peptitler olgunlaşma düzeyi daha ileride bulunan CD11byüksek hücreler ile daha çok etkileşim gösterdi. İlgili peptitlerin endositoz mekanizmaları da değerlendilmiş olup, reseptör aracılı girişin yanı sıra diğer endositoz mekanizmalarını da kullanabildikleri belirlendi

Transcriptional splice variants of CD40 and its prognostic value in breast cancer

CD40 is an important tumor necrosis factor receptor (TNFR) family protein for the development of antitumor response against cancer cells, apart from its role in the regulation of the immune system as a costimulatory molecule. It is broadly expressed on the surface of immune cells and in diverse cancer types, including breast cancer. Here, we analyzed both CD40/CD40 ligand expression in breast cancer cells and tissues using public data sets and overall survival analysis in ungrouped breast cancer patients, as well as in the triple-negative breast cancer subtype. We detected CD40 gene expression along with its 3 different splice variants (variants 1-3), predominantly in the triple-negative subgroup of breast cancer cell lines. The results of the overall survival analysis showed that high CD40 gene expression, particularly in the triple-negative subgroup of breast cancer patients, is associated with better survival. In addition to the transcriptional levels of CD40 splice variants, investigation of protein levels of these variants will allow the categorization of breast cancer cells and reveal their potential as an immunotherapeutic target

Unified list of the highest expressing (top 300) genes exhibiting the highest variation (FC>3) in response to injury in the three studied cell subpopulations.

This signature was annotated using the matrisome gene ontology classification presented in Fig 5. (XLSX)</p

Stromal cells isolated from the control muscles and the 3rd day samples following acute injury.

Cells were sorted based on relevant immunophenotypes. Sorting efficiencies for each sub-population was assessed using flow cytometry. Lowest enrichment was observed in CD140a(+)Sca1(+) population in control samples (80%). (TIF)</p

Stromal cells were enumerated based on relevant immunophenotypes (CD140a(+) Sca1(-), CD140a(-) Sca1(+) and CD140a(+)Sca1(+)) and BrDU positivity.

Typical flowcytometry panels from acute injury (day3), tenotomy (day 7) and denervation (day10) are shown in the upper panel (n = 10). BrdU positivity of each stromal subpopulation is calculated and presented in pie charts in lower panel. Diminutive amount of BrdU positivity was observed in the control samples and the highest proliferation in stromal cells was observed following acute injury. Stromal cells from the immobilization models exhibited limited BrdU positivity (n = 10 for each group). (TIF)</p

Upregulated gene list was annotated using the DAVID tool that revealed two major annotation clusters with enrichment scores of 26.50 and 24.73, both containing genes of secreted extracellular matrix components.

Upregulated gene list was annotated using the DAVID tool that revealed two major annotation clusters with enrichment scores of 26.50 and 24.73, both containing genes of secreted extracellular matrix components.</p