HMG20B stabilizes association of LSD1 with GFI1 on chromatin to confer transcription repression and leukemia cell differentiation block

Pharmacologic inhibition of LSD1 induces molecular and morphologic differentiation of blast cells in acute myeloid leukemia (AML) patients harboring MLL gene translocations. In addition to its demethylase activity, LSD1 has a critical scaffolding function at genomic sites occupied by the SNAG domain transcription repressor GFI1. Importantly, inhibitors block both enzymatic and scaffolding activities, in the latter case by disrupting the protein:protein interaction of GFI1 with LSD1. To explore the wider consequences of LSD1 inhibition on the LSD1 protein complex we applied mass spectrometry technologies. We discovered that the interaction of the HMG-box protein HMG20B with LSD1 was also disrupted by LSD1 inhibition. Downstream investigations revealed that HMG20B is co-located on chromatin with GFI1 and LSD1 genome-wide; the strongest HMG20B binding co-locates with the strongest GFI1 and LSD1 binding. Functional assays demonstrated that HMG20B depletion induces leukemia cell differentiation and further revealed that HMG20B is required for the transcription repressor activity of GFI1 through stabilizing LSD1 on chromatin at GFI1 binding sites. Interaction of HMG20B with LSD1 is through its coiled-coil domain. Thus, HMG20B is a critical component of the GFI1:LSD1 transcription repressor complex which contributes to leukemia cell differentiation block

STAT3/LKB1 controls metastatic prostate cancer by regulating mTORC1/CREB pathway

Prostate cancer (PCa) is a common and fatal type of cancer in men. Metastatic PCa (mPCa) is a major factor contributing to its lethality, although the mechanisms remain poorly understood. PTEN is one of the most frequently deleted genes in mPCa. Here we show a frequent genomic co-deletion of PTEN and STAT3 in liquid biopsies of patients with mPCa. Loss of Stat3 in a Pten-null mouse prostate model leads to a reduction of LKB1/pAMPK with simultaneous activation of mTOR/CREB, resulting in metastatic disease. However, constitutive activation of Stat3 led to high LKB1/pAMPK levels and suppressed mTORC1/CREB pathway, preventing mPCa development. Metformin, one of the most widely prescribed therapeutics against type 2 diabetes, inhibits mTORC1 in liver and requires LKB1 to mediate glucose homeostasis. We find that metformin treatment of STAT3/AR-expressing PCa xenografts resulted in significantly reduced tumor growth accompanied by diminished mTORC1/CREB, AR and PSA levels. PCa xenografts with deletion of STAT3/AR nearly completely abrogated mTORC1/CREB inhibition mediated by metformin. Moreover, metformin treatment of PCa patients with high Gleason grade and type 2 diabetes resulted in undetectable mTORC1 levels and upregulated STAT3 expression. Furthermore, PCa patients with high CREB expression have worse clinical outcomes and a significantly increased risk of PCa relapse and metastatic recurrence. In summary, we have shown that STAT3 controls mPCa via LKB1/pAMPK/mTORC1/CREB signaling, which we have identified as a promising novel downstream target for the treatment of lethal mPCa

Impact of Fibroblast Growth Factor Receptor 4 (FGFR4) on the pro-metastatic behaviour of HCC model cell lines

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der aggressivsten Krebsarten und trotz medizinischer Fortschritte wird der Großteil der Fälle in einem bereits fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. In diesem Stadium sind die Behandlungsmöglichkeiten limitiert, was eine schlechte Prognose zur Folge hat. In vorangehenden Studien mit HCC Gewebeproben wurde eine Fehlregulierung des Fibroblasten Wachstumsfaktor Rezeptor 4 (FGFR4) festgestellt, welche darauf hindeutet, dass der Rezeptor eine Rolle in späten Phasen des Krankheitsverlaufs spielt. Vor kurzem wurde ein Gly388Arg Einzelnukleotid-Polymorphismus in der Transmembrandomäne des Rezeptors beschrieben, wobei FGFR4/Arg mit einer erhöhten Bösartigkeit des Tumors assoziiert wurde. Das Ziel der vorliegenden Studie war die Bedeutung von FGFR4 in pro-metastatischen Prozessen, wie der Zell-Matrix und Zell-Zell Adhäsion sowie der Interaktion von Krebszellen mit Blut- oder Lymphendothelzellen, zu ermitteln. Für unsere mechanistischen Studien wurden zwei HCC/Hepatom-Zelllinien verwendet. Die Interaktion von Tumorzellen mit Endothelzellen wurde mit Hilfe eines dreidimensionalen Ko-Kulturmodells untersucht, welches adaptiert wurde um die von Leberkrebszellen verursachte Lückenbildung in Blut- oder Lymphgefäßen zu imitieren. Zell-Zell und Zell-Matrix Adhäsion wurden durch den Einsatz eines „Hanging Drop Assay“ bzw. eines „Adhesion Assay“ untersucht. Zuerst wurde die die Auswirkung von Gallensäuren und spezifischen Inhibitoren auf die Fähigkeit von HCC/Hepatomzellen zur Lückenbildung überprüft um einen Einblick zu gewinnen, wie verschiedene Mediatoren die Interaktion zwischen Epithel- und Mesenchymzellen in fortgeschrittenen Stadien der Hepatokarzinogenese beeinflussen. Des Weiteren wurden FGFR4/Gly und FGFR4/Arg transient und stabil überexprimiert. In einem dritten Ansatz wurde die FGFR4 Signalübertragung durch Infektion 3 der Zellen mit adenoviralen Konstrukten, die für ein dominant negatives FGFR4 oder den löslichen Teil von FGFR4, welcher die Liganden bindende Domäne des Rezeptor blockiert, inhibiert. Die Spheroid-induzierte Lückenbildung von HCC/Hepatom-Zelllinien in Endothelzell-Monolayern wurde durch den Einsatz der spezifischen Inhibitoren BAY 11-7082, GM6001 und Baicalein verringert, was darauf hinweist, dass NF-κB, MMPs und Lipoxygenasen an dem Vorgang beteiligt sein könnten. Andererseits hatten Gallensäuren keine Auswirkung auf die Lückenbildung. Transiente wie auch stabile Überexpression der mutierten oder normalen Form von FGFR4 in HCC/Hepatom-Zelllinien verringerte die Zell-Matrix Adhäsion, wobei der Effekt von FGFR4/Arg stärker war als der von FGFR4/Gly. Die Fähigkeit zur Zellaggregation und zur Spheroid-induzierten Lückenbildung wurde aufgrund der FGFR4 Überexpression erhöht werden. Blockade der FGFR4 Signalübertragung durch adenovirale Infektion beeinträchtigte die Zell-Matrix Adhäsion, die interzelluläre Adhäsion wie auch die Induktion von Lücken in einer Blut- oder Lymphendothelzellschicht. Zusammenfassend könnte der FGFR4 das pro-metastatische Verhalten von HCC Zellen, aufgrund der Wirkung auf die Zell-Matrix Adhäsion, Zellaggregation und die Spheroid-induzierte Lückenbildung, beeinflussen. Weiterführende Studien sind notwendig um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären.Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most aggressive cancer types. Despite medical progress, the majority of cases are diagnosed at an advanced stage, implicating rather limited treatment options and a poor prognosis. Precedent studies on HCC tissue samples revealed deregulation of fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) pointing towards an involvement of this growth factor receptor in late stages of the disease. Recently, a Gly388Arg single nucleotide polymorphism in the transmembrane domain of the receptor has been described. Thereby, FGFR4/Arg has been associated with an increased malignancy of HCC. The aim of the present study was to investigate the significance of FGFR4 for pro-metastatic processes such as cell-matrix and cell-cell adhesion as well as the interaction of tumour cells with endothelial cells. For our mechanistic studies, two HCC/hepatoma model cell lines were used. The interaction of tumour cells with endothelial cells was investigated by using a 3-D co-culture in vitro assay, which was adapted to mimic tumour-cell mediated gap formation in blood or lymphatic vessels. Cell-cell and cell-matrix adhesion were examined by using a hanging drop or adhesion assay, respectively. First, we examined the impact of bile acids and specific inhibitors on the gap forming capacity of HCC/hepatoma cells in order to gain insights into mediators affecting epithelial-mesenchymal interactions in advanced hepatocarcinogenesis. Second, FGFR4/Gly and FGFR4/Arg were transiently or stably overexpressed. In a third approach, FGFR4-mediated signaling was impaired by infecting cells with adenoviral constructs coding for a dominant negative FGFR4 or for the soluble part of FGFR4, which blocks the ligand binding part of this receptor. Spheroid induced gap formation of HCC/hepatoma cell lines in endothelial cell monolayers was impaired by the use of the specific inhibitors BAY 11-7082, GM6001 and Baicalein, indicating that NF-κB, MMPs and lipoxygenases might be involved in endothelial cell retraction. On the other hand, bile acid had no effect on gap forming capabilities. Transient or stable overexpression of mutant or wildtype version of FGFR4 in the HCC/hepatoma model cell lines decreased cell-matrix adhesion, with FGFR4/Arg showing more pronounced effects 2 than FGFR4/Gly. Cell aggregation capabilities and spheroid induced gap formation was increased due to FGFR4 overexpression. Blockade of FGFR4 signalling through adenoviral infection impaired cell-matrix adhesion and intercellular adhesion as well as gap formation in blood and lymphatic endothelial cell monolayers. To conclude, FGFR4 might affect the pro-metastatic behaviour of HCC cells due to its influence on cell-matrix adhesion, cell aggregation and spheroid-induced gap formation. Further studies are necessary to elucidate the underlying mechanisms

Targeting STAT5 in hematopoietic cancers

Die Entstehung von Krebs beim Menschen ist häufig verbunden mit außergewöhnlichen Aktivitäten von sonst normalen Signalwegen. Folglich, werden onkogene Transkriptionsfaktoren, von denen Krebszellen abhängig sind, als therapeutisch interessante Ziele für die Entwicklung von Arzneimitteln angesehen. Obwohl diese allgemein als "undruggable" angesehen werden, initiierten neue chemische Ansätze zur Modulation von Transkriptionsfaktorfunktionen, einschließlich Methoden zur Stabilisierung oder Degradation von Transkriptionsfaktoren oder zur Störung der Interaktionen mit Partnerproteinen oder Kofaktoren, eine neue Ära der Forschung, die sich auf bislang schwierige Ziele konzentriert. Die konstitutive Aktivierung des JAK-STAT-Signalwegs ist eine der häufigsten Ursachen für hämatopoetische Krebserkrankungen. Es wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, Inhibitoren zu entwickeln, die den JAK-STAT-Signalweg blockieren, was sich in der erfolgreichen Implementierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren, wie Imatinib, als Standard für die Versorgung verschiedener Leukämie-Subtypen widerspiegelt. Trotz dieses enormen Erfolges für personalisierte und zielgerichtete Therapieentwicklung und signifikante Verbesserungen der therapeutischen Möglichkeiten für Leukämiepatienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen Tyrosinkinase-Inhibitoren aufgrund von Tumorheterogenität oder sekundären Mutationen eine große Herausforderung. Neben Tyrosinkinasen wurden STATs, insbesondere STAT5, als wertvolle Ziele für die Wirkstoffforschung in Verbindung gebracht, da sie am Konvergenzpunkt vieler Signalwege sitzen und durch eine Vielzahl von aufwärts gelegenen Kinasen in einer Vielzahl von Krebsarten aktiviert werden. In der Tat ist das direkte „Targeting“ von STAT5 ein Bereich der aktiven Forschung in der medizinischen Chemie, bleibt jedoch aufgrund der Beschränkungen in Spezifität, Potenz und in vivo Aktivität herausfordernd, was neue Ansätze zur Hemmung dieses onkogenen Transkriptionsfaktors erforderlich macht. In einem multidisziplinären Ansatz, der Molekularbiologen, Medizinalchemiker und Kliniker vereint, entwickelten und charakterisierten wir eine neue chemische Verbindung, AC-4-130, die direkt an die STAT5 SH2-Domäne bindet und somit deren Aktivierung und Transkription von „Downstream“-Onkogenen in einem niedrigen mikromolaren Bereich hemmt. Mit AML-Zelllinien und Primärmaterial von gesunden Individuen und AML-Patienten konnten wir zeigen, dass insbesondere Zellen, die von FLT3-ITD gesteuert werden, empfindlich auf AC-4-130 reagieren, während gesunde Zellen weitgehend unbeeinflusst sind. Darüber hinaus konnten wir in einem Xenograft-AML-Modell eine signifikante Abnahme des Tumorwachstums nachweisen, ohne die gesunde Stammzellpopulation zu beeinflussen. Schließlich zeigte ein Highthroughput-Screening für Arzneimittelkombinationen vielversprechende Ergebnisse auf, wenn AC-4-130 mit Tyrosinkinase-Inhibitoren oder epigenetischen Arzneimitteln gepaart wurde, was eine zukünftige Perspektive der STAT5-Hemmung in einer klinischen Studie zur Folge haben könnte. Zweifelsohne wird die Weiterentwicklung und detailliertere Charakterisierung dieser Verbindung in naher Zukunft zu Wirkstoffen führen, die wertvolle Werkzeuge für mechanistische Studien zu bislang unbekannten Funktionen von STATs sowie für wichtige Therapeutika für Patienten mit FLT3-ITD-getriebener AML oder anderen STAT5-getriebenen hämatopoetischen Krebsarten darstellen.The pathogenesis of human cancer is frequently associated with inappropriate functions of otherwise normal signaling pathways. Consequently, oncogenic transcription factors, a major dependency of cancer cells, are considered as attractive therapeutic targets for drug discovery. Although generally considered as “undruggable”, emerging chemical approaches to modulate transcription factor functions, including methods to stabilize or degrade transcription factors or to interfere with interaction partners and cofactors, initiated a new era of research focusing on these so far challenging targets. Constitutive activation of the JAK-STAT pathway is one of the most common underlying causes of hematopoietic cancers. Extensive efforts have been ongoing to develop inhibitors that interfere with JAK-STAT signaling reflected by the successful implementation of tyrosine kinase inhibitors, such as Imatinib, as standard-of-care for various leukemia subtypes. Despite this tremendous success for personalized and targeted therapy and significant improvements in therapeutic options for leukemia patients, development of resistance to tyrosine kinase inhibitors due to tumor heterogeneity or secondary mutations constitutes a major challenge. Besides tyrosine kinases, STATs, particularly STAT5, have been implicated as valuable targets for drug discovery as they sit at the convergence point of many signaling pathways and are activated by a plethora of upstream kinases in a variety of cancers. Indeed, direct targeting of STAT5 is an area of active research in medicinal chemistry but remains challenging due to limitations in specificity, potency, and in vivo bioavailability, necessitating new approaches to inhibit this oncogenic transcription factor. In a multidisciplinary approach, unifying molecular biologists, medicinal chemists, and clinicians, we developed and characterized a novel chemical lead compound, AC-4-130, that directly binds into the STAT5 SH2 domain and consequently inhibits its activation and the transcription of downstream oncogenes in a low micromolar range. Using AML cell lines and primary material from healthy individuals and AML patients, we could show that particularly cells driven by FLT3-ITD were sensitive to AC-4-130 whereas healthy cells were largely unaffected. In addition, we could show a significant decrease in tumor growth in a xenograft AML model without affecting the healthy stem cell population. Finally, a high throughput screen for drug combinations pinpointed promising effects when AC-4-130 was paired with tyrosine kinase inhibitors or epigenetic drugs, presenting a future perspective of STAT5 inhibition in a clinical setting. Certainly, further development and more detailed characterization of this lead compound will produce agents that will be valuable tools for mechanistic studies into yet unknown functions of STATs as well as important therapeutics for patients with FLT3-ITD driven AML or other STAT5 driven hematopoietic cancers in the near future.submitted by Bettina WingelhoferAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Diss., 2018(VLID)276378

Fibroblast growth factor receptor 4: a putative key driver for the aggressive phenotype of hepatocellular carcinoma

Recently, we found upregulation of fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) in a subset of hepatocellular carcinoma (HCC). Here, we provide mechanistic insight into the role of FGFR4-mediated signalling for the aggressive behaviour of HCC cells. To overexpress FGFR4, hepatoma/hepatocarcinoma cells were transfected with a construct coding for FGFR4. For downmodulation of endogenous FGFR4, we used small interfering RNA or adenoviral infection with dominant-negative FGFR4 constructs being either kinase dead (kdFGFR4) or coding for the autoinhibitory soluble domain (solFGFR4). FGFR4 overexpression in non-tumourigenic hepatocarcinoma cells significantly reduced cell-matrix adhesion, enabled cells to grow anchorage-independently in soft agar, to disintegrate the lymph-/blood-endothelial barrier for intra-/extravasation of tumour cells and to form tumours in SCID mice. Transcriptome analysis revealed altered expression of genes involved in cell-matrix interactions. Conversely, in highly tumourigenic cell lines, kdFGFR4 or solFGFR4 lowered the proportion of cells in S phase of the cell cycle, enhanced the G0/G1 and G2/M-phase proportions, reduced anchorage-independent growth in vitro and attenuated disintegration of the lymph-/blood-endothelium and tumour formation in vivo. These findings were confirmed by altered expression profiles of genes being important for late stages of cell division. Deregulated FGFR4 expression appears to be one of the key drivers of the malignant phenotype of HCC cells. Accordingly, blockade of FGFR4-mediated signalling by soluble dominant-negative constructs, like solFGFR4, may be a feasible and promising therapeutic approach to antagonize aggressive behaviour of hepatoma/hepatocarcinoma cells. © The Author 2014. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For Permissions, please email: [email protected]

STAT5 is Expressed in CD34+/CD38− Stem Cells and Serves as a Potential Molecular Target in Ph-Negative Myeloproliferative Neoplasms

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