Impact of Fibroblast Growth Factor Receptor 4 (FGFR4) on the pro-metastatic behaviour of HCC model cell lines

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der aggressivsten Krebsarten und trotz medizinischer Fortschritte wird der Großteil der Fälle in einem bereits fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. In diesem Stadium sind die Behandlungsmöglichkeiten limitiert, was eine schlechte Prognose zur Folge hat. In vorangehenden Studien mit HCC Gewebeproben wurde eine Fehlregulierung des Fibroblasten Wachstumsfaktor Rezeptor 4 (FGFR4) festgestellt, welche darauf hindeutet, dass der Rezeptor eine Rolle in späten Phasen des Krankheitsverlaufs spielt. Vor kurzem wurde ein Gly388Arg Einzelnukleotid-Polymorphismus in der Transmembrandomäne des Rezeptors beschrieben, wobei FGFR4/Arg mit einer erhöhten Bösartigkeit des Tumors assoziiert wurde. Das Ziel der vorliegenden Studie war die Bedeutung von FGFR4 in pro-metastatischen Prozessen, wie der Zell-Matrix und Zell-Zell Adhäsion sowie der Interaktion von Krebszellen mit Blut- oder Lymphendothelzellen, zu ermitteln. Für unsere mechanistischen Studien wurden zwei HCC/Hepatom-Zelllinien verwendet. Die Interaktion von Tumorzellen mit Endothelzellen wurde mit Hilfe eines dreidimensionalen Ko-Kulturmodells untersucht, welches adaptiert wurde um die von Leberkrebszellen verursachte Lückenbildung in Blut- oder Lymphgefäßen zu imitieren. Zell-Zell und Zell-Matrix Adhäsion wurden durch den Einsatz eines „Hanging Drop Assay“ bzw. eines „Adhesion Assay“ untersucht. Zuerst wurde die die Auswirkung von Gallensäuren und spezifischen Inhibitoren auf die Fähigkeit von HCC/Hepatomzellen zur Lückenbildung überprüft um einen Einblick zu gewinnen, wie verschiedene Mediatoren die Interaktion zwischen Epithel- und Mesenchymzellen in fortgeschrittenen Stadien der Hepatokarzinogenese beeinflussen. Des Weiteren wurden FGFR4/Gly und FGFR4/Arg transient und stabil überexprimiert. In einem dritten Ansatz wurde die FGFR4 Signalübertragung durch Infektion 3 der Zellen mit adenoviralen Konstrukten, die für ein dominant negatives FGFR4 oder den löslichen Teil von FGFR4, welcher die Liganden bindende Domäne des Rezeptor blockiert, inhibiert. Die Spheroid-induzierte Lückenbildung von HCC/Hepatom-Zelllinien in Endothelzell-Monolayern wurde durch den Einsatz der spezifischen Inhibitoren BAY 11-7082, GM6001 und Baicalein verringert, was darauf hinweist, dass NF-κB, MMPs und Lipoxygenasen an dem Vorgang beteiligt sein könnten. Andererseits hatten Gallensäuren keine Auswirkung auf die Lückenbildung. Transiente wie auch stabile Überexpression der mutierten oder normalen Form von FGFR4 in HCC/Hepatom-Zelllinien verringerte die Zell-Matrix Adhäsion, wobei der Effekt von FGFR4/Arg stärker war als der von FGFR4/Gly. Die Fähigkeit zur Zellaggregation und zur Spheroid-induzierten Lückenbildung wurde aufgrund der FGFR4 Überexpression erhöht werden. Blockade der FGFR4 Signalübertragung durch adenovirale Infektion beeinträchtigte die Zell-Matrix Adhäsion, die interzelluläre Adhäsion wie auch die Induktion von Lücken in einer Blut- oder Lymphendothelzellschicht. Zusammenfassend könnte der FGFR4 das pro-metastatische Verhalten von HCC Zellen, aufgrund der Wirkung auf die Zell-Matrix Adhäsion, Zellaggregation und die Spheroid-induzierte Lückenbildung, beeinflussen. Weiterführende Studien sind notwendig um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären.Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most aggressive cancer types. Despite medical progress, the majority of cases are diagnosed at an advanced stage, implicating rather limited treatment options and a poor prognosis. Precedent studies on HCC tissue samples revealed deregulation of fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) pointing towards an involvement of this growth factor receptor in late stages of the disease. Recently, a Gly388Arg single nucleotide polymorphism in the transmembrane domain of the receptor has been described. Thereby, FGFR4/Arg has been associated with an increased malignancy of HCC. The aim of the present study was to investigate the significance of FGFR4 for pro-metastatic processes such as cell-matrix and cell-cell adhesion as well as the interaction of tumour cells with endothelial cells. For our mechanistic studies, two HCC/hepatoma model cell lines were used. The interaction of tumour cells with endothelial cells was investigated by using a 3-D co-culture in vitro assay, which was adapted to mimic tumour-cell mediated gap formation in blood or lymphatic vessels. Cell-cell and cell-matrix adhesion were examined by using a hanging drop or adhesion assay, respectively. First, we examined the impact of bile acids and specific inhibitors on the gap forming capacity of HCC/hepatoma cells in order to gain insights into mediators affecting epithelial-mesenchymal interactions in advanced hepatocarcinogenesis. Second, FGFR4/Gly and FGFR4/Arg were transiently or stably overexpressed. In a third approach, FGFR4-mediated signaling was impaired by infecting cells with adenoviral constructs coding for a dominant negative FGFR4 or for the soluble part of FGFR4, which blocks the ligand binding part of this receptor. Spheroid induced gap formation of HCC/hepatoma cell lines in endothelial cell monolayers was impaired by the use of the specific inhibitors BAY 11-7082, GM6001 and Baicalein, indicating that NF-κB, MMPs and lipoxygenases might be involved in endothelial cell retraction. On the other hand, bile acid had no effect on gap forming capabilities. Transient or stable overexpression of mutant or wildtype version of FGFR4 in the HCC/hepatoma model cell lines decreased cell-matrix adhesion, with FGFR4/Arg showing more pronounced effects 2 than FGFR4/Gly. Cell aggregation capabilities and spheroid induced gap formation was increased due to FGFR4 overexpression. Blockade of FGFR4 signalling through adenoviral infection impaired cell-matrix adhesion and intercellular adhesion as well as gap formation in blood and lymphatic endothelial cell monolayers. To conclude, FGFR4 might affect the pro-metastatic behaviour of HCC cells due to its influence on cell-matrix adhesion, cell aggregation and spheroid-induced gap formation. Further studies are necessary to elucidate the underlying mechanisms