Experimental evolution of genome architecture and complexity in an RNA virus

Introducción La evolución de la arquitectura del genoma – las dimensiones y la organización del material hereditario de un organismo – es poco conocida. Existe una variación asombrosa en la arquitectura genómica entre diferentes organismos. Los virus tienden a tener genomas pequeños, con un mínimo de secuencias intergénicas y típicamente con genes solapantes, los cuales se cree son una forma de compresión del genoma que permite al virus incrementar su número de proteínas sin aumentar su tamaño. Los procariotas tienen genomas compactos, pero con secuencias intergénicas más largas que los virus, y los genes con solapamientos largos son escasos. Los eucariotas presentan una amplia gama de tamaños de genoma, desde el rango de los procariotas a órdenes de magnitud más largos, y se distinguen por su organización génica en intrones y exones. Las secuencias intrónicas e intergénicas contribuyen al gran tamaño del los genomas eucariotas, pudiendo éstas constituir hasta un 60% del ADN. En contraste, los virus y procariotas consisten principalmente de ADN (o ARN) codificante, representando éste más del 85% del tamaño total del genoma. Hay un aumento notable en la complejidad del genoma desde los virus, pasando por los procariotas, hasta los eucariotas, en términos de tamaño del genoma, el número de genes, el número de elementos móviles, el número y tamaño de los intrones, y la complejidad de las regiones reguladoras. Aun así, no existen límites claros en las diferencias de la arquitectura genómica entre organismos. El descubrimiento de los virus gigantes y de bacterias simbióticas con genomas pequeños, ha eliminado la separación de genomas celulares y virales por tamaño. Por lo tanto, esto sugiere que los mecanismos principales promoviendo la divergencia de la arquitectura genómica son genético-poblacionales, y no los diferentes estilos de vida, estructuras celulares o fisiologías de los organismos. Los mecanismos genético-poblacionales, como la tasa de mutación y el tamaño efectivo de la población, podrían desempeñar un papel en la conformación de arquitecturas genómicas divergentes. La Ley de Drake describe como la tasa de mutación en todo el genoma es más o menos constante entre los organismos, por lo tanto, existe una correlación negativa entre la tasa de mutación y el tamaño de genoma. Esto también es una consecuencia de la paradoja de Eigen sobre el umbral de error: la longitud de un genoma está limitada por la tasa de mutación. Cuando la tasa de mutación está por debajo del umbral de error, una población se mantendrá en el equilibrio entre la acción de la mutación y de la selección. Los virus, que tienen genomas pequeños en comparación con las especies multicelulares, tienen una tasa de mutación más alta. En particular, las altas tasas de mutación observadas para los virus ARN son varios órdenes de magnitud superiores a las tasas de mutación observadas en la mayoría de los organismos de ADN. Una explicación para este contraste es que, a diferencia de los polimerasas de ADN, muchas polimerasas de ARN no tienen un mecanismo de corrección de errores, y por lo tanto son más propensas a introducir errores durante la replicación. Aún así, los límites de las tasas de mutación entre los virus con diferentes arquitecturas genómicas no están bien definidos, y las altas tasas de mutación de los virus de ARN son igualadas por algunos virus de ADN. Por lo tanto, se sugiere que otros aspectos como la arquitectura del genoma y la velocidad de replicación, en lugar de la baja fidelidad de la polimerasa de ARN, podrían explicar las diferencias de las tasas de mutación en los virus. Las transiciones desde organismos simples hasta organismos más complejos, parecen estar asociadas a grandes reducciones en el tamaño de la población. Cuando el tamaño poblacional es pequeño, el poder de la deriva genética aumenta, el cual crea oportunidades para la producción de nuevas y diversas características genómicas, que por el contrario serían eliminadas por la acción de la selección purificadora. Por lo tanto, se ha propuesto que un tamaño efectivo poblacional grande – como el de los virus de ARN – es un obstáculo importante para la evolución de los genomas complejos. Para estudiar la evolución de la arquitectura genómica, se optó por trabajar con el virus del grabado del tabaco (TEV). Este patógeno de planta tiene un genoma de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva. Los virus de ARN de polaridad positiva representan el grupo de virus conocido más grande hasta la fecha, y se clasifican en tres tribus: picorna- , alfa- y flavi-like. Estos virus se caracterizan por tener grupos de genes conservados, y en especial por la disposición helicasa-polimerasa, en donde el gen de la helicasa se encuentra normalmente corriente arriba del gen de la polimerasa. En particular, la tribu picorna-like se identifica por la conservación parcial de genes esenciales. Además, estos genes esenciales tienden a estar organizados en el mismo orden, mientras que los genes no esenciales son responsables de la reorganización genómica y la recombinación entre grupos distantes de virus de las tres tribus. El genoma monopartito lineal de TEV es de aproximadamente 9.5 kb en longitud, y codifica para un único marco de lectura abierto, es decir una poliproteína. Después de la traducción, la poliproteína se procesa proteolíticamente en diez péptidos maduros, mediante la acción de proteaseas que están codificadas en el propio virus. TEV está clasificado dentro del género Potyvirus de la familia Potyviridae. Esta familia se divide en ocho géneros y todos los virus en estos géneros tienen un genoma monpartito, a excepción de los virus del género Bymovirus que tienen un genoma bipartito. Curiosamente, el orden de los genes de los diferentes miembros de la familia Potyviridae está muy bien conservado, inclusive en los Bymovirus. Objetivos, metodología y resultados Esta tesis trata de entender tres conceptos básicos sobre la evolución de la arquitectura genómica de los virus de RNA: (i) el posible aumento de su complejidad mediante la adquisición de nuevos genes, (ii) la disminución de su complejidad por pérdida de material redundante o innecesario y (iii) la reorganización de elementos ya existentes. Utilizando como sistema modelo al TEV, hemos generado cambios importantes en el genoma viral (reorganizaciones, duplicaciones y la introducción de genes exógenos), seguidos por evolución experimental de estos genomas modificados para ver cómo acomodaban los cambios introducidos. Hemos comparado por secuenciación masiva, mediciones de acumulación, virulencia y experimentos de competencia los linajes evolucionados contra los ancestrales y entre si. Los cuatro objetivos principales de este estudio se corresponden con los cuatro capítulos en esta tesis. Capítulo 1: Múltiples barreras a la evolución de órdenes alternativos de genes. El primer objetivo es comprender mejor la conservación del orden génico en los órdenes y familias de los virus. El orden en que los genes se organizan dentro de un genoma por lo general no se conserva entre especies poco relacionadas. Sin embargo, dentro de los órdenes y las familias virales, se observa una fuerte conservación en el orden génico. Los factores que limitan o promueven la diversidad en el orden génico son en su mayoría desconocidos, aunque se sabe que la regulación de la expresión génica es una limitación importante para los virus. Aquí investigamos por qué el orden de los genes se conserva en un virus de ARN de cadena positiva que codifica una única poliproteína, en el contexto de su huésped natural (multicelular). Inicialmente, hemos identificado la trayectoria más plausible por la cual los órdenes alternativos de genes podrían evolucionar. Posteriormente, se estudió la accesibilidad de los pasos clave a lo largo de esta trayectoria evolutiva mediante la construcción de dos pasos intermedios: (i) la duplicación de un gen seguido por (ii) la pérdida del gen ancestral. Se identificaron cinco barreras a la evolución de los órdenes alternativos de genes. En primer lugar, el número de posiciones viables para el reordenamiento es limitado. En segundo lugar, la eficacia viral dentro del huésped de los virus con duplicaciones de genes es baja en comparación con el virus silvestre. En tercer lugar, después de la duplicación, la copia del gen ancestral siempre se mantiene, y nunca la del gen duplicado. En cuarto lugar, los virus con un orden génico alternativo tienen una eficacia viral incluso más baja que los virus con duplicaciones de genes. En quinto lugar, después de más de medio año de evolución experimental, en aislamiento, los virus con un orden génico alternativo son aún mucho más inferiores que el virus silvestre. Nuestros resultados muestran que todos los pasos a lo largo de las trayectorias evolutivas plausibles a los órdenes génicos alternativos, son muy poco probables. Estos resultados contribuyen a nuestro entendimiento acerca de los factores que limitan y/o promueven la conservación del orden génico. Capítulo 2: Predicción de la estabilidad de duplicaciones de genes homólogos. El segundo objetivo es comprender mejor la estabilidad de la redundancia genética y cómo los virus evolucionan a tener genomas pequeños mediante la eliminación de ésta. Una de las características sorprendentes de muchos eucariotas, es la cantidad aparente de redundancia de los elementos codificantes y no codificantes de sus genomas. A pesar de sus ventajas evolutivas, hay menos ejemplos de secuencias redundantes en los genomas virales, particularmente en aquellos con genomas de ARN. La baja prevalencia de duplicación génica en los virus de ARN probablemente refleja las fuertes restricciones selectivas en contra del aumento en el tamaño de genoma. Mediante la evolución experimental de variantes de TEV hemos explorado como un genoma de ARN viral puede acomodar duplicaciones génicas potencialmente beneficiosas, y cómo la evolución adaptativa procede a eliminarlos. Hemos medido la estabilidad y los costes en la eficacia viral de los genomas del TEV con redundancia genética. Ninguno de los eventos de duplicación explorados parecen ser beneficiosos para TEV. La duplicación de un gen resultó en un virus no viable o en una reducción significativa en la eficacia viral. En todos los casos, se delecionó el gen duplicado, lo que condujo a la recuperación de la eficacia viral. Hemos observado diferencias en la dinámica de cómo se delecionan las secuencias, asociadas a la duración de los pases evolutivos, y al origen, al tamaño y a la ubicación del gen duplicado. Basado en los datos experimentales, hemos desarrollado un modelo que permite predecir la estabilidad de la redundancia genética. Con este modelo, mostramos que hay una tasa de recombinación dependiente del contexto genómico, donde la identidad y la posición de la duplicación juegan un papel. Los resultados contribuyen a nuestra comprensión de que características biológicas limitan la probabilidad de la retención de genes duplicados. Capítulo 3: Introducción de secuencias exógenas funcionales. El tercer objetivo es explorar el destino evolutivo de un aumento en el tamaño genómico, en el contexto de la transferencia horizontal de genes (THG). La THG es un mecanismo clave en la evolución de los virus y extendido en estos organismos. Sin embargo, la fuerte selección en contra de un aumento en el tamaño genómico de los virus es un impedimento para la THG. Además, la inestabilidad de los genomas virales puede impedir la innovación evolutiva. Aquí, consideramos dos posibles eventos de THG introduciendo secuencias exógenas funcionales en el genoma de TEV que están relacionadas con la supresión del silenciamiento de ARN. Mediante evolución experimental, hemos observado cómo se acomodan estas secuencias exógenas y hemos determinado su estabilidad. Uno de los eventos simula la adquisición de una nueva función, mediante THG del dominio AlkB, responsable de la reparación de daños de alquilación. Encontramos que AlkB es inestable en TEV, por lo menos en nuestra configuración experimental. El otro evento simula la adquisición de una función existente, mediante THG del supresor del silenciamiento 2b del virus del mosaico del pepino (CMV). Este gen foráneo es estable y no parece afectar al TEV en términos de acumulación y eficacia darwiniana. Además, nuestros resultados sugieren que este gen puede hacerse cargo de la supresión de silenciamiento del virus, relajando la presión de selección sobre esta función en la proteína HC-Pro del TEV. Capítulo 4: Los efectos sobre la eficacia viral de las secuencias exógenas pueden ser impredecibles en huéspedes alternativos. El cuarto objetivo es entender mejor los efectos de la virulencia y la transmisión sobre la evolución. Cuando predominan las presiones de selección entre huéspedes, la teoría sugiere que la alta virulencia podría dificultar la transmisión de microparásitos entre huéspedes, y por lo tanto, que la virulencia evolucionaría hacia niveles más bajos, lo cuál optimizaría la transmisión entre huéspedes. Los microparásitos con una alta virulencia también pueden restringir el desarrollo del huésped, lo cual limitaría los recursos del huésped disponibles tanto para ellos como para su propio tamaño poblacional efectivo. Por lo tanto, la alta virulencia puede reducir la tasa de mutación y aumentar la fuerza con la que la deriva genética actúa sobre las poblaciones de microparásitos, limitando así el potencial para adaptarse al huésped y, finalmente, quizás a la capacidad de evolucionar una virulencia baja. Como una primera exploración de esta hipótesis, hemos evolucionado experimentalmente un TEV protador del marcador eGFP en dos especies de huésped semipermisivas, Nicotiana benthamiana y Datura stramonium. Después de aproximadamente 30 semanas de evolución, hemos secuenciado los genomas de los linajes evolucionados y hemos medido su eficacia viral. Sorprendentemente, el marcador eGFP no tiene ningún costo de eficacia viral en N. benthamiana, mientras que sí tenia un coste en D. stramonium, lo que sugiere que los efectos en la eficacia de las secuencias heterólogas pueden ser impredecibles en huéspedes alternativos. En N. benthamiana, el marcador eGFP es estable en todos los linajes. En uno de los seis linajes evolucionados donde observamos una eficacia mayor, sólo encontramos mutaciones puntuales. En D. stramonium, el marcador eGFP se perdió en sólo uno de los diez linajes siendo éste el único con un aumento significativo en la eficacia viral. Los patrones observados de la adaptación son consistentes con los costes de la inserción de eGFP en los diferentes huéspedes. Nuestros resultados no proporcionan soporte alguno a la hipótesis de que la alta virulencia impide la evolución. Más bien, los resultados sugieren que un salto entre huéspedes puede cambiar radicalmente la dinámica evolutiva. Conclusiones Se identificaron múltiples barreras a la evolución de órdenes génicos alternativos, revelando limitaciones importantes a la evolución viral. Los pasos intermedios para evolucionar un orden génico alternativo, están asociados a costes elevados en la eficacia viral, los cuales no son fáciles de superar. La falta de trayectorias accesibles a un orden génico alternativo sugiere una contribución a la conservación del orden génico en los potyvirus. Las duplicaciones génicas que se exploraron en este estudio son evolutivamente inestables y no parecen ser beneficiosas para TEV. La duplicación de un gen resulta en una reducción en la eficacia viral, la cual se restaura mediante la eliminación de la copia duplicada del gen. Además de la eficacia viral, la estabilidad de la copia del gen duplicado se ve afectada por una tasa de recombinación dependiente de la identidad y la posición de las duplicaciones génicas. Contrariamente a la duplicación génica, la inserción de una secuencia exógena funcional – el gen 2b del virus del CMV – ha demostrado ser evolutivamente estable, sin afectar a la eficacia viral. Además, 2b ha demostrado ser beneficioso para TEV en el caso del fallo de su propio mecanismo de supresión de silenciamento de ARN. Estos resultados sugieren que la THG entre virus de plantas es un evento posible y prometedor para futuros estudios en evolución experimental. Un salto de huéspedes puede cambiar radicalmente la dinámica evolutiva de un virus. Una secuencia exógena funcional – eGFP – era más estable en huéspedes alternativos, para los cuales TEV tenía una virulencia tanto menor como superior. Además, eGFP no parece afectar la eficacia viral en el huésped para el que TEV tiene una virulencia alta. Esto choca con nuestra hipótesis de que la alta virulencia ralentiza el ritmo de adaptación. Los resultados sugieren que cuando se considera la evolución de la arquitectura del genoma, los saltos de huéspedes podrían desempeñar un papel muy importante, al permitir que los pasos evolutivos intermedios sean competitivos.The evolution of genome architecture – the dimensions and organization of an organism's hereditary material – is poorly understood. There are clear differences in genome architecture over organisms, and it is clear that this complexity can be altered on relatively short time scales. Here, three specific processes of the evolution of genome architecture in viruses are studied: (i) the reshuffling of existing elements, (ii) the decrease of genome complexity through loss of redundant or unnecessary genetic material, (iii) and the increase of genome complexity through the acquisition of new genes. These topics were addressed in vivo using Tobacco etch virus, a plant RNA virus, as a model organism. Important changes in the viral genome were generated – from changes in gene order, to duplications of existing genes, to the introduction of exogenous sequences – followed by experimental evolution to observe how these changes were accommodated. The evolved and ancestral lineages were compared by next-generation sequencing and measurements of virulence, viral accumulation and within-host competitive fitness. First, we identified multiple barriers to the evolution of alternative gene orders. Second, we observed differences in the deletion dynamics of genetically and functionally redundant sequences and we developed a model to predict the stability of gene insertions. Third, we found an exogenous sequence that was evolutionary stable in the Tobacco etch virus genome that does not appear to affect viral fitness and can act as a backup in case of failure of the viral host defense mechanism. Lastly, we observed that a host species jump can be a game changer for evolutionary dynamics, allowing unstable viruses to be competitive in alternative hosts

Experimental evolution of pseudogenization and gene loss in a plant RNA virus

[EN] Viruses have evolved highly streamlined genomes and a variety of mechanisms to compress them, suggesting that genome size is under strong selection. Horizontal gene transfer has, on the other hand, played an important role in virus evolution. However, evolution cannot integrate initially nonfunctional sequences into the viral genome if they are rapidly purged by selection. Here we report on the experimental evolution of pseudogenization in virus genomes using a plant RNA virus expressing a heterologous gene. When long 9-week passages were performed, the added gene was lost in all lineages, whereas viruses with large genomic deletions were fixed in only two out of ten 3-week lineages and none in 1-week lineages. Illumina next-generation sequencing revealed considerable convergent evolution in the 9- and 3-week lineages with genomic deletions. Genome size was correlated to within-host competitive fitness, although there was no correlation with virus accumulation or virulence. Within-host competitive fitness of the 3-week virus lineages without genomic deletions was higher than for the 1-week lineages. Our results show that the strength of selection for a reduced genome size and the rate of pseudogenization depend on demographic conditions. Moreover, for the 3-week passage condition, we observed increases in within-host fitness, whereas selection was not strong enough to quickly remove the nonfunctional heterologous gene. These results suggest a demographically determined "sweet spot" might exist, where heterologous insertions are not immediately lost while evolution can act to integrate them into the viral genome.The authors thank Alejandro Manzano Marin for his bioinformatics guidance with the Illumina analysis and Francisca de la Iglesia, Paula Agudo, and Angels Prosper for technical support. This project was made possible through the support of grant 22371 from the John Templeton Foundation to S. F. E. The opinions expressed in this publication are those of the authors and do not necessarily reflect the views of John Templeton Foundation. Additional support was received from the Spanish Direccion General de Investigacion Cientifica y Tecnica grants BFU2012-30805 to S. F. E, JCI2011-10379 to M.P.Z, and BIO2011-26741 to J.A.D., and by a Rubicon grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (www.nwo.nl) to M.P.Z.Zwart, MP.; Willemsen, A.; Daros Arnau, JA.; Elena Fito, SF. (2014). Experimental evolution of pseudogenization and gene loss in a plant RNA virus. Molecular Biology and Evolution. 31(1):121-134. https://doi.org/10.1093/molbev/mst175S12113431

Predicting the Stability of Homologous Gene Duplications in a Plant RNA Virus

One of the striking features of many eukaryotes is the apparent amount of redundancy in coding and non-coding elements of their genomes. Despite the possible evolutionary advantages, there are fewer examples of redundant sequences in viral genomes, particularly those with RNA genomes. The factors constraining the maintenance of redundant sequences in present-day RNA virus genomes are not well known. Here, we use Tobacco etch virus, a plant RNA virus, to investigate the stability of genetically redundant sequences by generating viruses with potentially beneficial gene duplications. Subsequently, we tested the viability of these viruses and performed experimental evolution. We found that all gene duplication events resulted in a loss of viability or in a significant reduction in viralfitness. Moreover,uponanalyzing thegenomesof theevolved viruses,wealways observedthedeletionof the duplicated gene copy andmaintenance of the ancestral copy. Interestingly, there were clear differences in the deletion dynamics of the duplicated gene associated with the passage duration and the size and position of the duplicated copy. Based on the experimental data,wedeveloped a mathematical model to characterize the stability of genetically redundant sequences, and showed that fitness effects are not enough to predict genomic stability.Acontext-dependent recombination rate is also required, with the context being the duplicated gene and its position. Our results therefore demonstrate experimentally the deleterious nature of gene duplications in RNA viruses. Beside previously described constraints on genome size, we identified additional factors that reduce the likelihood of the maintenance of duplicated genes.We thank Francisca de la Iglesia and Paula Agudo for excellent technical assistance. This work was supported by the John Templeton Foundation [grant number 22371 to S.F.E.]; the European Commission 7th Framework Program EvoEvo Project [grant number ICT-610427 to S.F.E.]; the Spanish Ministerio de Economia y Competitividad (MINECO) [grant numbers BFU2012-30805 and BFU2015-65037-P to S.F.E.]; the Botin Foundation from Banco Santander through its Santander Universities Global Division [J.S.]; the Secretaria d'Universitats i Recerca del Departament d'Economia i Coneixement de la Generalitat de Catalunya [J.S.]; and the European Molecular Biology Organization [grant number ASTF 625-2015 to A.W]. The opinions expressed in this publication are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the John Templeton Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.Willemsen, A.; Zwart, MP.; Higueras, P.; Sardanyes Cayuela, J.; Elena Fito, SF. (2016). Predicting the Stability of Homologous Gene Duplications in a Plant RNA Virus. Genome Biology and Evolution. 8(9):3065-3082. https://doi.org/10.1093/gbe/evw219S306530828

Quantitative assessment of myelin density using [C-11]MeDAS PET in patients with multiple sclerosis:a first-in-human study

Purpose: Multiple sclerosis (MS) is a disease characterized by inflammatory demyelinated lesions. New treatment strategies are being developed to stimulate myelin repair. Quantitative myelin imaging could facilitate these developments. This first-in-man study aimed to evaluate [11C]MeDAS as a PET tracer for myelin imaging in humans. Methods: Six healthy controls and 11 MS patients underwent MRI and dynamic [11C]MeDAS PET scanning with arterial sampling. Lesion detection and classification were performed on MRI. [11C]MeDAS time-activity curves of brain regions and MS lesions were fitted with various compartment models for the identification of the best model to describe [11C]MeDAS kinetics. Several simplified methods were compared to the optimal compartment model. Results: Visual analysis of the fits of [11C]MeDAS time-activity curves showed no preference for irreversible (2T3k) or reversible (2T4k) two-tissue compartment model. Both volume of distribution and binding potential estimates showed a high degree of variability. As this was not the case for 2T3k-derived net influx rate (Ki), the 2T3k model was selected as the model of choice. Simplified methods, such as SUV and MLAIR2 correlated well with 2T3k-derived Ki, but SUV showed subject-dependent bias when compared to 2T3k. Both the 2T3k model and the simplified methods were able to differentiate not only between gray and white matter, but also between lesions with different myelin densities. Conclusion: [11C]MeDAS PET can be used for quantification of myelin density in MS patients and is able to distinguish differences in myelin density within MS lesions. The 2T3k model is the optimal compartment model and MLAIR2 is the best simplified method for quantification. Trial registration. NL7262. Registered 18 September 2018

Heritability estimates for 361 blood metabolites across 40 genome-wide association studies

Metabolomics examines the small molecules involved in cellular metabolism. Approximately 50% of total phenotypic differences in metabolite levels is due to genetic variance, but heritability estimates differ across metabolite classes. We perform a review of all genome-wide association and (exome-) sequencing studies published between November 2008 and October 2018, and identify >800 class-specific metabolite loci associated with metabolite levels. In a twin-family cohort (N = 5117), these metabolite loci are leveraged to simultaneously estimate total heritability (h2 total), and the proportion of heritability captured by known metabolite loci (h2 Metabolite-hits) for 309 lipids and 52 organic acids. Our study reveals significant differences in h2 Metabolite-hits among different classes of lipids and organic acids. Furthermore, phosphatidylcholines with a high degree of unsaturation have higher h2 Metabolite-hits estimates than phosphatidylcholines with low degrees of unsaturation. This study highlights the importance of common genetic variants for metabolite levels, and elucidates the genetic architecture of metabolite classes

Temporal Dynamics of Intrahost Molecular Evolution for a Plant RNA Virus

[EN] Populations of plant RNA viruses are highly polymorphic in infected plants, which may allow rapid within-host evolution. To understand tobacco etch potyvirus (TEV) evolution, longitudinal samples from experimentally evolved populations in the natural host tobacco and from the alternative host pepper were phenotypically characterized and genetically analyzed. Temporal and compartmental variabilities of TEV populations were quantified using high throughput Illumina sequencing and population genetic approaches. Of the two viral phenotypic traits measured, virulence increased in the novel host but decreased in the original one, and viral load decreased in both hosts, though to a lesser extent in the novel one. Dynamics of population genetic diversity were also markedly different among hosts. Population heterozygosity increased in the ancestral host, with a dominance of synonymous mutations fixed, whereas it did not change or even decreased in the new host, with an excess of nonsynonymous mutations. All together, these observations suggest that directional selection is the dominant evolutionary force in TEV populations evolving in a novel host whereas either diversifying selection or random genetic drift may play a fundamental role in the natural host. To better understand these evolutionary dynamics, we developed a computer simulation model that incorporates the effects of mutation, selection, and drift. Upon parameterization with empirical data from previous studies, model predictions matched the observed patterns, thus reinforcing our idea that the empirical patterns of mutation accumulation represent adaptive evolution.The authors thank Francisca de la Iglesia and Paula Agudo for excellent technical assistance, our labmates for useful discussions and suggestions, and Dr Jose A. Daros for gifting us the pMTEV infectious clone. This work was supported by grants BFU2009-06993 and BFU2012-30805 from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO), grant PROMETEOII/2014/021 from Generalitat Valenciana, and by the European Commission 7th Framework Programme (FP7-ICT-611640 FET Proactive: Evolving Living Technologies) EvoEvo project to S.F.E. J.M.C. was supported by a JAE-doc postdoctoral contract from CSIC. A.W. was supported by the EvoEvo project. J.H. was recipient of a predoctoral contract from MINECO. M.P.Z. was supported by a Juan de la Cierva postdoctoral contract from MINECO.Cuevas, JM.; Willemsen, A.; Hillung, J.; Zwart, MP.; Elena Fito, SF. (2015). Temporal Dynamics of Intrahost Molecular Evolution for a Plant RNA Virus. Molecular Biology and Evolution. 32(5):1132-1147. https://doi.org/10.1093/molbev/msv028S1132114732

Heritability estimates for 361 blood metabolites across 40 genome-wide association studies

Metabolomics examines the small molecules involved in cellular metabolism. Approximately 50% of total phenotypic differences in metabolite levels is due to genetic variance, but heritability estimates differ across metabolite classes. We perform a review of all genome-wide association and (exome-) sequencing studies published between November 2008 and October 2018, and identify >800 class-specific metabolite loci associated with metabolite levels. In a twin-family cohort (N = 5117), these metabolite loci are leveraged to simultaneously estimate total heritability (h2 total), and the proportion of heritability captured by known metabolite loci (h2 Metabolite-hits) for 309 lipids and

Emergence and phylodynamics of Citrus tristeza virus in Sicily, Italy

[EN] Citrus tristeza virus (CTV) outbreaks were detected in Sicily island, Italy for the first time in 2002. To gain insight into the evolutionary forces driving the emergence and phylogeography of these CTV populations, we determined and analyzed the nucleotide sequences of the p20 gene from 108 CTV isolates collected from 2002 to 2009. Bayesian phylogenetic analysis revealed that mild and severe CTV isolates belonging to five different clades (lineages) were introduced in Sicily in 2002. Phylogeographic analysis showed that four lineages co-circulated in the main citrus growing area located in Eastern Sicily. However, only one lineage (composed of mild isolates) spread to distant areas of Sicily and was detected after 2007. No correlation was found between genetic variation and citrus host, indicating that citrus cultivars did not exert differential selective pressures on the virus. The genetic variation of CTV was not structured according to geographical location or sampling time, likely due to the multiple introduction events and a complex migration pattern with intense co- and recirculation of different lineages in the same area. The phylogenetic structure, statistical tests of neutrality and comparison of synonymous and nonsynonymous substitution rates suggest that weak negative selection and genetic drift following a rapid expansion may be the main causes of the CTV variability observed today in Sicily. Nonetheless, three adjacent amino acids at the p20 N-terminal region were found to be under positive selection, likely resulting from adaptation events.A.W. and S.F.E. were supported by grant BFU2012-30805 from the Spanish Secretaria de Estado de Investigacion, Desarrollo e Innovacion and by a grant 22371 from the John Templeton Foundation. The opinions expressed in this publication are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the John Templeton Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.Davino, S.; Willemsen, A.; Panno. Stefano; Davino, M.; Catara, A.; Elena Fito, SF.; Rubio, L. (2013). Emergence and phylodynamics of Citrus tristeza virus in Sicily, Italy. PLoS ONE. 8:66700-66700. doi:10.1371/journal.pone.0066700S66700667008Domingo, E., & Holland, J. J. (1997). RNA VIRUS MUTATIONS AND FITNESS FOR SURVIVAL. Annual Review of Microbiology, 51(1), 151-178. doi:10.1146/annurev.micro.51.1.151Grenfell, B. T. (2004). Unifying the Epidemiological and Evolutionary Dynamics of Pathogens. Science, 303(5656), 327-332. doi:10.1126/science.1090727Moya, A., Holmes, E. C., & González-Candelas, F. (2004). The population genetics and evolutionary epidemiology of RNA viruses. Nature Reviews Microbiology, 2(4), 279-288. doi:10.1038/nrmicro863Gray, R. R., Tatem, A. J., Lamers, S., Hou, W., Laeyendecker, O., Serwadda, D., … Salemi, M. (2009). Spatial phylodynamics of HIV-1 epidemic emergence in east Africa. AIDS, 23(14), F9-F17. doi:10.1097/qad.0b013e32832faf61Holmes, E. C. (2008). Evolutionary History and Phylogeography of Human Viruses. Annual Review of Microbiology, 62(1), 307-328. doi:10.1146/annurev.micro.62.081307.162912Pybus, O. G., Suchard, M. A., Lemey, P., Bernardin, F. J., Rambaut, A., Crawford, F. W., … Delwart, E. L. (2012). Unifying the spatial epidemiology and molecular evolution of emerging epidemics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(37), 15066-15071. doi:10.1073/pnas.1206598109Talbi, C., Lemey, P., Suchard, M. A., Abdelatif, E., Elharrak, M., Jalal, N., … Bourhy, H. (2010). Phylodynamics and Human-Mediated Dispersal of a Zoonotic Virus. PLoS Pathogens, 6(10), e1001166. doi:10.1371/journal.ppat.1001166Vijaykrishna, D., Bahl, J., Riley, S., Duan, L., Zhang, J. X., Chen, H., … Guan, Y. (2008). Evolutionary Dynamics and Emergence of Panzootic H5N1 Influenza Viruses. PLoS Pathogens, 4(9), e1000161. doi:10.1371/journal.ppat.1000161Gómez, P., Sempere, R. N., Aranda, M. A., & Elena, S. F. (2012). Phylodynamics of Pepino mosaic virus in Spain. European Journal of Plant Pathology, 134(3), 445-449. doi:10.1007/s10658-012-0019-0Lefeuvre, P., Martin, D. P., Harkins, G., Lemey, P., Gray, A. J. A., Meredith, S., … Heydarnejad, J. (2010). The Spread of Tomato Yellow Leaf Curl Virus from the Middle East to the World. PLoS Pathogens, 6(10), e1001164. doi:10.1371/journal.ppat.1001164TOMITAKA, Y., & OHSHIMA, K. (2006). A phylogeographical study of the Turnip mosaic virus population in East Asia reveals an ‘emergent’ lineage in Japan. Molecular Ecology, 15(14), 4437-4457. doi:10.1111/j.1365-294x.2006.03094.xWu, B., Blanchard-Letort, A., Liu, Y., Zhou, G., Wang, X., & Elena, S. F. (2011). Dynamics of Molecular Evolution and Phylogeography of Barley yellow dwarf virus-PAV. PLoS ONE, 6(2), e16896. doi:10.1371/journal.pone.0016896MORENO, P., AMBRÓS, S., ALBIACH-MARTÍ, M. R., GUERRI, J., & PEÑA, L. (2008). Citrus tristeza virus: a pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology, 9(2), 251-268. doi:10.1111/j.1364-3703.2007.00455.xTatineni, S., Robertson, C. J., Garnsey, S. M., & Dawson, W. O. (2011). A plant virus evolved by acquiring multiple nonconserved genes to extend its host range. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(42), 17366-17371. doi:10.1073/pnas.1113227108Folimonova, S. Y. (2012). Superinfection Exclusion Is an Active Virus-Controlled Function That Requires a Specific Viral Protein. Journal of Virology, 86(10), 5554-5561. doi:10.1128/jvi.00310-12Bar-Joseph, M., Marcus, R., & Lee, R. F. (1989). The Continuous Challenge of Citrus Tristeza Virus Control. Annual Review of Phytopathology, 27(1), 291-316. doi:10.1146/annurev.py.27.090189.001451Davino, S., Rubio, L., & Davino, M. (2005). Molecular analysis suggests that recent Citrus tristeza virus outbreaks in Italy were originated by at least two independent introductions. European Journal of Plant Pathology, 111(3), 289-293. doi:10.1007/s10658-003-2815-zAlbiach-Marti, M. R., Mawassi, M., Gowda, S., Satyanarayana, T., Hilf, M. E., Shanker, S., … Dawson, W. O. (2000). Sequences of Citrus Tristeza Virus Separated in Time and Space Are Essentially Identical. Journal of Virology, 74(15), 6856-6865. doi:10.1128/jvi.74.15.6856-6865.2000Rubio, L., Ayllon, M. A., Kong, P., Fernandez, A., Polek, M., Guerri, J., … Falk, B. W. (2001). Genetic Variation of Citrus Tristeza Virus Isolates from California and Spain: Evidence for Mixed Infections and Recombination. Journal of Virology, 75(17), 8054-8062. doi:10.1128/jvi.75.17.8054-8062.2001Silva, G., Marques, N., & Nolasco, G. (2011). The evolutionary rate of citrus tristeza virus ranks among the rates of the slowest RNA viruses. Journal of General Virology, 93(2), 419-429. doi:10.1099/vir.0.036574-0Mawassi, M., Mietkiewska, E., Gofman, R., Yang, G., & Bar-Joseph, M. (1996). Unusual Sequence Relationships Between Two Isolates of Citrus Tristeza Virus. Journal of General Virology, 77(9), 2359-2364. doi:10.1099/0022-1317-77-9-2359Vives, M. C., Dawson, W. O., Flores, R., L√≥pez, C., Albiach-Mart√≠, M. R., Rubio, L., … Moreno, P. (1999). The complete genome sequence of the major component of a mild citrus tristeza virus isolate. Journal of General Virology, 80(3), 811-816. doi:10.1099/0022-1317-80-3-811Martín, S., Elena, S. F., Guerri, J., Moreno, P., Sambade, A., Rubio, L., … Vives, M. C. (2009). Contribution of recombination and selection to molecular evolution of Citrus tristeza virus. Journal of General Virology, 90(6), 1527-1538. doi:10.1099/vir.0.008193-0Vives, M. C., Rubio, L., Sambade, A., Mirkov, T. E., Moreno, P., & Guerri, J. (2005). Evidence of multiple recombination events between two RNA sequence variants within a Citrus tristeza virus isolate. Virology, 331(2), 232-237. doi:10.1016/j.virol.2004.10.037D’Urso, F., Sambade, A., Moya, A., Guerri, J., & Moreno, P. (2003). Variation of haplotype distributions of two genomic regions of Citrus tristeza virus populations from eastern Spain. Molecular Ecology, 12(2), 517-526. doi:10.1046/j.1365-294x.2000.01747.xSambade, A., Rubio, L., Garnsey, S. M., Costa, N., Muller, G. W., Peyrou, M., … Moreno, P. (2002). Comparison of viral RNA populations of pathogenically distinct isolates of Citrus tristeza virus : application to monitoring cross-protection. Plant Pathology, 51(3), 257-265. doi:10.1046/j.1365-3059.2002.00720.xReed, J. C., Kasschau, K. D., Prokhnevsky, A. I., Gopinath, K., Pogue, G. P., Carrington, J. C., & Dolja, V. V. (2003). Suppressor of RNA silencing encoded by Beet yellows virus. Virology, 306(2), 203-209. doi:10.1016/s0042-6822(02)00051-xFolimonova, S. Y., Robertson, C. J., Shilts, T., Folimonov, A. S., Hilf, M. E., Garnsey, S. M., & Dawson, W. O. (2009). Infection with Strains of Citrus Tristeza Virus Does Not Exclude Superinfection by Other Strains of the Virus. Journal of Virology, 84(3), 1314-1325. doi:10.1128/jvi.02075-09Kong, P., Rubio, L., Polek, M., & Falk, B. W. (2000). Virus Genes, 21(3), 139-145. doi:10.1023/a:1008198311398Powell, C. A., Pelosi, R. R., Rundell, P. A., & Cohen, M. (2003). Breakdown of Cross-Protection of Grapefruit from Decline-Inducing Isolates of Citrus tristeza virus Following Introduction of the Brown Citrus Aphid. Plant Disease, 87(9), 1116-1118. doi:10.1094/pdis.2003.87.9.1116Roistacher C, Dodds J. (1993) Failure of 100 mild Citrus tristeza virus isolates from california to cross protect against a challenge by severe sweet orange stem pitting isolates. Proc 12th Conf IOCV: 100–107.Ayllón, M. A., Rubio, L., Sentandreu, V., Moya, A., Guerri, J., & Moreno, P. (2006). Variations in Two Gene Sequences of Citrus Tristeza Virus after Host Passage. Virus Genes, 32(2), 119-128. doi:10.1007/s11262-005-6866-4Ayllón, M. A., Rubio, L., Moya, A., Guerri, J., & Moreno, P. (1999). The Haplotype Distribution of Two Genes of Citrus Tristeza Virus Is Altered after Host Change or Aphid Transmission. Virology, 255(1), 32-39. doi:10.1006/viro.1998.9566Sentandreu, V., Castro, J. A., Ayllón, M. A., Rubio, L., Guerri, J., González-Candelas, F., … Moya, A. (2005). Evolutionary analysis of genetic variation observed in citrus tristeza virus (CTV) after host passage. Archives of Virology, 151(5), 875-894. doi:10.1007/s00705-005-0683-xMatos, L. A., Hilf, M. E., Cayetano, X. A., Feliz, A. O., Harper, S. J., & Folimonova, S. Y. (2013). Dramatic Change in Citrus tristeza virus Populations in the Dominican Republic. Plant Disease, 97(3), 339-345. doi:10.1094/pdis-05-12-0421-reDavino, S., Davino, M., Sambade, A., Guardo, M., & Caruso, A. (2003). The First Citrus tristeza virus Outbreak Found in a Relevant Citrus Producing Area of Sicily, Italy. Plant Disease, 87(3), 314-314. doi:10.1094/pdis.2003.87.3.314aRUBIO, L., AYLLONl, M. A., GUERRI, J., PAPPU, H., NIBLETT, C., & MORENO, P. (1996). Differentiation of citrus tristeza closterovirus (CTV) isolates by single-strand conformation polymorphism analysis of the coat protein gene. Annals of Applied Biology, 129(3), 479-489. doi:10.1111/j.1744-7348.1996.tb05770.xLarkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., … Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23(21), 2947-2948. doi:10.1093/bioinformatics/btm404Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., & Kumar, S. (2011). MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, 28(10), 2731-2739. doi:10.1093/molbev/msr121Kosakovsky Pond, S. L., Posada, D., Gravenor, M. B., Woelk, C. H., & Frost, S. D. W. (2006). GARD: a genetic algorithm for recombination detection. Bioinformatics, 22(24), 3096-3098. doi:10.1093/bioinformatics/btl474Martin, D. P., Lemey, P., Lott, M., Moulton, V., Posada, D., & Lefeuvre, P. (2010). RDP3: a flexible and fast computer program for analyzing recombination. Bioinformatics, 26(19), 2462-2463. doi:10.1093/bioinformatics/btq467Librado, P., & Rozas, J. (2009). DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 25(11), 1451-1452. doi:10.1093/bioinformatics/btp187Kimura M. (1985) The neutral theory of molecular evolution. Cambridge Univ Pr.Weir, B. S., & Cockerham, C. C. (1984). Estimating F-Statistics for the Analysis of Population Structure. Evolution, 38(6), 1358. doi:10.2307/2408641Pond, S. L. K., & Frost, S. D. W. (2005). Datamonkey: rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments. Bioinformatics, 21(10), 2531-2533. doi:10.1093/bioinformatics/bti320Drummond, A. J., & Rambaut, A. (2007). BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evolutionary Biology, 7(1), 214. doi:10.1186/1471-2148-7-214Bielejec, F., Rambaut, A., Suchard, M. A., & Lemey, P. (2011). SPREAD: spatial phylogenetic reconstruction of evolutionary dynamics. Bioinformatics, 27(20), 2910-2912. doi:10.1093/bioinformatics/btr481Stamatakis, A. (2006). RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics, 22(21), 2688-2690. doi:10.1093/bioinformatics/btl446Ott M, Zola J, Stamatakis A, Aluru S. (2007) Large-scale maximum likelihood-based phylogenetic analysis on the IBM BlueGene/L. Proceedings of the 19th ACM/IEEE conference on Supercomputing. Article No. 4.Shimodaira, H., & Hasegawa, M. (1999). Multiple Comparisons of Log-Likelihoods with Applications to Phylogenetic Inference. Molecular Biology and Evolution, 16(8), 1114-1116. doi:10.1093/oxfordjournals.molbev.a026201Soria-Carrasco, V., Talavera, G., Igea, J., & Castresana, J. (2007). The K tree score: quantification of differences in the relative branch length and topology of phylogenetic trees. Bioinformatics, 23(21), 2954-2956. doi:10.1093/bioinformatics/btm466Puigbo, P., Garcia-Vallve, S., & McInerney, J. O. (2007). TOPD/FMTS: a new software to compare phylogenetic trees. Bioinformatics, 23(12), 1556-1558. doi:10.1093/bioinformatics/btm13

Origin and evolution of papillomavirus (onco)genes and genomes

International audienceOne contribution of 16 to a theme issue 'Silent cancer agents: multidisciplinary modelling of human DNA oncoviruses'. Papillomaviruses (PVs) are ancient viruses infecting vertebrates, from fishes to mammals. Although the genomes of PVs are small and show conserved synteny, PVs display large genotypic diversity and ample variation in the phenotypic presentation of the infection. Most PV genomes contain two small early genes E6 and E7. In a bunch of closely related human papilloma-viruses (HPVs), the E6 and E7 proteins provide the viruses with oncogenic potential. The recent discoveries of PVs without E6 and E7 in different fish species place a new root on the PV tree, and suggest that ancestral PVs consisted of the minimal PV backbone E1-E2-L2-L1. Bayesian phylogenetic analyses date the most recent common ancestor of the PV backbone to 424 million years ago (Ma). Common ancestry tests on extant E6 and E7 genes indicate that they share a common ancestor dating back to at least 184 Ma. In AlphaPVs infecting Old World monkeys and apes, the appearance of the E5 oncogene 53-58 Ma concurred with (i) a significant increase in substitution rate, (ii) a basal radiation and (iii) key gain of functions in E6 and E7. This series of events was instrumental to construct the extant phenotype of oncogenic HPVs. Our results assemble the current knowledge on PV diversity and present an ancient evolutionary timeline punctuated by evolutionary innovations in the history of this successful viral family. This article is part of the theme issue 'Silent cancer agents: multidisciplinary modelling of human DNA oncoviruses'