Functional and molecular characterization of hyperpolarization-activated cation currents in the human epileptogenic neocortex

Der hyperpolarisations-aktivierte Kationenstrom (I-h), der von Kanälen der HCN-Familie vermittelt wird, spielt eine zentrale Rolle bei der neuronalen Erregbarkeitskontrolle. Untersuchungen an Tiermodellen der Temporallappenepilepsie (TLE) haben funktionelle Beeinträchtigungen des I-h bzw. eine verminderte Expression von HCN-Kanälen gezeigt. Ob es bei humaner TLE zu vergleichbaren Änderungen kommt, wurde bisher nicht umfassend untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die biophysikalischen Eigenschaften des I-h in Neuronen (Schichten II/III) des humanen epileptogenen Neokortex mit somatischen Patch clamp-Ableitungen (whole cell-Modus) untersucht. Die untersuchten Gewebe umfassen anfallsauslösende Kortex-Areale, die in Fällen von pharmakoresistenter TLE oder Frontallappenepilepsie (FLE) aus therapeutischen Gründen entfernt wurden. In einigen TLE-Geweben (und Autopsie- Kontrollen) wurde die mRNA der Kanal-Untereinheiten HCN1–HCN4 mit quantitativer PCR und der relative Gehalt an HCN1-Protein mit Immunoblots gemessen. In Resektatgeweben von TLE- und FLE-Patienten wurden (neben Ba2+-sensitiven I-Kir) Einwärtsströme mit den typischen biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des I-h gemessen. Im Vergleich zu neokortikalen Neuronen der Ratte waren die Stromdichten der schnellen I-h-Komponente (I-h-fast) in den TLE-Geweben 63 % geringer, die Aktivierung langsamer und die Spannungsabhängigkeit in Richtung negativerer Potentiale verschoben. In Geweben von FLE-Patienten wurden 44 % höhere Dichten von I-h-fast und eine schnellere Aktivierungskinetik gemessen als in TLE-Geweben. In TLE-Geweben von Patienten mit vielen Anfällen war die mittlere Dichte von I-h-fast ~24 % geringer als in TLE-Geweben von Patienten mit wenig Anfällen. Exemplarische Messungen zeigten eine stärkere temporale Summation von artifiziellen EPSP in Neuronen mit wenig I-h als in Neuronen mit viel I-h (z. B. von FLE-Geweben). Im Vergleich zu Autopsie-Kontrollen zeigte sich in TLE- Geweben (unabhängig von der Anfallshäufigkeit) eine ~50 %ige Verminderung der HCN1-mRNA und eine ~150 %ige Zunahme der HCN4-mRNA. Die Menge an HCN1-Protein war in den untersuchten TLE-Geweben von Patienten mit vielen Anfällen um etwa die Hälfte geringer als in Geweben von Patienten mit wenig Anfällen. Zusammengefasst zeigen die erhobenen Daten eine deutliche Verminderung des kortikalen I-h bei humaner TLE v. a. bei Patienten mit vielen Anfällen. Die Messungen der mRNA verschiedener Untereinheiten legen nahe, dass bei TLE die Anzahl funktioneller Kanäle (aus HCN1-Untereinheiten) auf transkriptionaler Ebene reduziert sein könnte. Allerdings deuten die unterschiedlichen Mengen an HCN1-Protein (bei gleicher mRNA) zwischen TLE-Geweben von Patienten mit wenig Anfällen und solchen von Patienten mit vielen Anfällen auch auf posttranskriptionale Schadesmechanismen hin. Ein pathologischer Verlust von HCN-Kanälen und dem von ihnen vermittelten I-h könnte die Erregbarkeit des Netzwerks erhöhen und zur Ausbreitung epileptischer Anfälle beitragen.The hyperpolarization-activated cation current (I-h) is mediated by the family of HCN channels and plays a pivotal role in the control of neuronal excitability. Studies on animal models of temporal lobe epilepsy (TLE) have shown functional deficits of Ih or a reduced expression of HCN-channels. Possible alterations of I-h in human TLE have not been investigated in detail, so far. Here, the biophysical properties of Ih were investigated in neurons (layer II/III) of human epileptogenic neocortex using somatic patch-clamp recordings (whole-cell mode). The tissues investigated comprise epileptogenic areas of the neocortex that were resected for therapeutical reasons from patients with pharmacoresistant TLE or frontal lobe epilepsy (FLE). In some TLE-tissues (and autopsy controls) the mRNA of the channel subunits HCN1–HCN4 were determined using quantitative PCR and the amount of HCN1 protein was investigated by immunoblotting. Neurons from TLE tissues and FLE tissues exhibited (beside a Ba2+-sensitive I-Kir) inward currents with typical biophysical and pharmacological properties of I-h. Compared to rat neocortical neurons, the current densities of the fast I-h-component (I-h-fast) were 63 % smaller than in TLE tissues. Furthermore, the kinetics of activation were slower and the voltage-dependence was shifted to more negative potentials in TLE. In FLE tissues the density of I-h-fast was 44 % larger and the current activation was faster than in TLE tissues. In TLE tissues from patients that suffered many seizures the mean density of I-h-fast was decreased by ~24 % in comparison to TLE tissues from patients that suffered many seizures. First measurements of the temporal summation of artificial EPSP revealed a more efficient summation in neurons with a small I-h than in neurons with a large I-h (e. g. in FLE tissues). Compared to autopsy controls, the HCN1 mRNA was down regulated (by ~50 %) and the HCN4-mRNA was up-regulated (by ~150 %) in TLE tissues, independent of the seizure frequency. The amount of HCN1 protein was about 50 % less in TLE tissues from patients with many seizures than in tissues from patients with few seizures. In conclusion, the data presented reveal a considerable reduction of cortical I-h in human TLE – primarily in patients that suffered many seizures. The measurements of the mRNA of the different subunits suggest that in TLE the number of functional channels (consisting of HCN1 subunits) is decreased at the transcriptional level. However, the different amounts of HCN1 protein (present at similar mRNA levels) between TLE tissues from patients with few seizures and patients with many seizures might indicate that post-transcriptional mechanisms may play a role as well. A pathophysiological loss of HCN channels and subsequently of I-h might increase the network excitability and facilitate the spread of seizure activity

Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes mediate pre- and postsynaptic effects in rat neocortex

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Cholinergic transmission has been implicated in learning, memory and cognition. However, the cellular effects induced by muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) activation are poorly understood in the neocortex. We investigated the effects of the cholinergic agonist carbachol (CCh) and various agonists and antagonists on neuronal activity in rat neocortical slices using intracellular (sharp microelectrode) and field potential recordings.</p> <p>Results</p> <p>CCh increased neuronal firing but reduced synaptic transmission. The increase of neuronal firing was antagonized by pirenzepine (M₁/M₄ mAChRs antagonist) but not by AF-DX 116 (M₂/M₄ mAChRs antagonist). Pirenzepine reversed the depressant effect of CCh on excitatory postsynaptic potential (EPSP) but had marginal effects when applied before CCh. AF-DX 116 antagonized the depression of EPSP when applied before or during CCh. CCh also decreased the paired-pulse inhibition of field potentials and the inhibitory conductances mediated by GABA_A and GABA_B receptors. The depression of paired-pulse inhibition was antagonized or prevented by AF-DX 116 or atropine but only marginally by pirenzepine. The inhibitory conductances were unaltered by xanomeline (M₁/M₄ mAChRs agonist), yet the CCh-induced depression was antagonized by AF-DX 116. Linopirdine, a selective M-current blocker, mimicked the effect of CCh on neuronal firing. However, linopirdine had no effect on the amplitude of EPSP or on the paired-pulse inhibition, indicating that M-current is involved in the increase of neuronal excitability but neither in the depression of EPSP nor paired-pulse inhibition.</p> <p>Conclusions</p> <p>These data indicate that the three effects are mediated by different mAChRs, the increase in firing being mediated by M₁ mAChR, decrease of inhibition by M₂ mAChR and depression of excitatory transmission by M₄ mAChR. The depression of EPSP and increase of neuronal firing might enhance the signal-to-noise ratio, whereas the concomitant depression of inhibition would facilitate long-term potentiation. Thus, this triade of effects may represent a “neuronal correlate” of attention and learning.</p