Is Thermosensing Property of RNA Thermometers Unique?

A large number of studies have been dedicated to identify the structural and sequence based features of RNA thermometers, mRNAs that regulate their translation initiation rate with temperature. It has been shown that the melting of the ribosome-binding site (RBS) plays a prominent role in this thermosensing process. However, little is known as to how widespread this melting phenomenon is as earlier studies on the subject have worked with a small sample of known RNA thermometers. We have developed a novel method of studying the melting of RNAs with temperature by computationally sampling the distribution of the RNA structures at various temperatures using the RNA folding software Vienna. In this study, we compared the thermosensing property of 100 randomly selected mRNAs and three well known thermometers - rpoH, ibpA and agsA sequences from E. coli. We also compared the rpoH sequences from 81 mesophilic proteobacteria. Although both rpoH and ibpA show a higher rate of melting at their RBS compared with the mean of non-thermometers, contrary to our expectations these higher rates are not significant. Surprisingly, we also do not find any significant differences between rpoH thermometers from other -proteobacteria and E. coli non-thermometers

DNA Adenine Methylation Is Required to Replicate Both Vibrio cholerae Chromosomes Once per Cell Cycle

DNA adenine methylation is widely used to control many DNA transactions, including replication. In Escherichia coli, methylation serves to silence newly synthesized (hemimethylated) sister origins. SeqA, a protein that binds to hemimethylated DNA, mediates the silencing, and this is necessary to restrict replication to once per cell cycle. The methylation, however, is not essential for replication initiation per se but appeared so when the origins (oriI and oriII) of the two Vibrio cholerae chromosomes were used to drive plasmid replication in E. coli. Here we show that, as in the case of E. coli, methylation is not essential for oriI when it drives chromosomal replication and is needed for once-per-cell-cycle replication in a SeqA-dependent fashion. We found that oriII also needs SeqA for once-per-cell-cycle replication and, additionally, full methylation for efficient initiator binding. The requirement for initiator binding might suffice to make methylation an essential function in V. cholerae. The structure of oriII suggests that it originated from a plasmid, but unlike plasmids, oriII makes use of methylation for once-per-cell-cycle replication, the norm for chromosomal but not plasmid replication

Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie

Eukaryoten und Prokaryoten unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome. Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom, welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare Chromosomen, die mehr als einen Replikationsursprung enthalten. In wie weit die prokaryotische Genomorganisation der eukaryotischen angepasst werden kann, ist eine spannende Frage, von deren Antwort grundlegende Konstruktionsregeln für die Entwicklung von synthetischen Chromosomen abgeleitet werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Escherichia coli Stämme mit multiplen Replikationsursprüngen und Chromosomen bezüglich ihrer DNA-Replikation untersucht und es wurde eine fluoreszenzbasierte Einzelzell-Methode designt und etabliert, die eine verbesserte „signal to background ratio“ aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: I. E. coli toleriert einen zusätzlichen Replikationsursprung auf dem Chromosom, der aktiv repliziert. Dieser Ansatz funktioniert sowohl mit einer zusätzlichen Kopie von oriC, als auch mit oriII, dem Replikationsursprung des zweiten Chromosoms von V. cholerae. Es konnte gezeigt werden, dass eine verkürzte oriC-Sequenz, die keine DnaA-Box R4 enthält, nicht ausreichend für die DNA-Replikation auf dem nativen Chromosom ist. Wird oriII als extra Replikationsursprung eingesetzt, verläuft die DNA-Replikation dysreguliert. Diese Dysregulation wird aufgehoben, sobald sich oriC und oriII nicht mehr auf dem gleichen Chromosom, sondern auf zwei unterschiedlichen Replikons befinden. II. Für das Design und die Assemblierung von DNA-Sequenzbibliotheken zur chromosomalen Integration in Bakterien wurde das Programm MARSeG (Motif Avoiding Randomized Sequence Generator) geschrieben und das MoClo-System optimiert. Mit dem Sequenzgenerator MARSeG, ist es möglich Sequenzen zu designen, die eine hohe Variabilität aufweisen und gleichzeitig bestimmte DNA-Motive ausschließen. Das MoClo-System wurde optimiert um die Klonierungseffizienz zu erhöhen, Assemblierungen im Bibliotheken-Maßstab zu vereinfachen und eine Genomintegration assemblierter DNA-Fragmente einfacher zu gestalten. Mit Hilfe von MARSeG und den modifizierten MoClo-Vektoren konnte das Design und der Aufbau eines LacO/TetO hybrid FROS-Arrays effizient und schnell vollzogen werden. III. Es wurde eine neue Einzelzell-Methode etabliert mit der das Hintergrundsignal konventioneller FROS (Fluorescence Repressor Operator System) stark reduziert wird. Die neue Methode BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and Repressor Operator System) basiert auf Fusionen aus Repressoren und fragmentierten Fluoreszenzproteinen, die an ein hybrid FROS-Array binden, wodurch es durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation zu einem Fluoreszenzsignal kommt. BiFCROS enthält im Vergleich zum konventionellen FROS eine deutlich verminderte Hintergrundfluoreszenz, weil nur Proteine fluoreszieren, die an das Operator-Array gebunden sind. Um zu analysieren, ob BiFCROS für die Kopienzahlbestimmung von Genloki eingesetzt werden könnte, wurde es in diese Richtung weiterentwickelt. Anhand der Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle könnte Rückschluss auf die Kopienzahl des hybrid FROS-Arrays gezogen werden, weil diese mit Anstieg der Kopienzahl proportional zunehmen sollte

Synthetische Biologie

Zusammenfassung Das Ausstatten und Erzeugen von Zellen mit neuen Eigenschaften im „Baukastenverfahren“ stellt einen komplett neuen Ansatz in der Biologie dar, der sich von den bisherigen analytisch-deskriptiven Methoden stark unterscheidet. Durch die Synthetische Biologie werden die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler zu Designern von Lebensprozessen, einzelnen Molekülen und ganzen Zellen. Dabei ist der Begriff „synthetisch“ dehnbar und vielfältig: Das Einbringen eines am DNA-Synthesizer künstlich hergestellten Erbmoleküls wird ebenso wie eine am Reißbrett vorab modellierte und nachfolgend künstlich im Labor erzeugte Enzymreaktion, die beispielsweise der Biosynthese neuartiger Wirkstoffe und Materialien dienen kann, als Synthetische Biologie bezeichnet. Die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler des Marburger LOEWE-Zentrums für Synthetische Mikrobiologie (www.synmikro.com) widmen sich verschiedenen Forschungsansätzen, deren Schwerpunkte im Bereich der Mikroben und Mikroorganismen liegen

Chromosomal macrodomains and associated proteins : implications for DNA organization and replication in gram negative bacteria

The Escherichia coli chromosome is organized into four macrodomains, the function and organisation of which are poorly understood. In this review we focus on the MatP, SeqA, and SlmA proteins that have recently been identified as the first examples of factors with macrodomain-specific DNA-binding properties. In particular, we review the evidence that these factors contribute towards the control of chromosome replication and segregation by specifically targeting subregions of the genome and contributing towards their unique properties. Genome sequence analysis of multiple related bacteria, including pathogenic species, reveals that macrodomain-specific distribution of SeqA, SlmA, and MatP is conserved, suggesting common principles of chromosome organisation in these organisms. This discovery of proteins with macrodomain-specific binding properties hints that there are other proteins with similar specificity yet to be unveiled. We discuss the roles of the proteins identified to date as well as strategies that may be employed to discover new factors

Co-immunoprecipitation: Protein–RNA and Protein–DNA Interaction

International audienceTranscriptional and posttranscriptional regulators play a critical role in allowing a bacterium to adapt to the diverse environments and conditions it encounters. In order to characterize the role of these regulators the identification of their specific interaction partners is of utmost importance. Co-immunoprecipitation (IP) is based on antigen/antibody complex formation to purify a protein of interest from the rest of the samples together with its interaction partner. This method allows us to study direct interaction of a regulator with its specific binding partners like protein-RNA, protein-DNA, or protein-protein interactions. IP typically requires careful optimization and troubleshooting depending on the varying physicochemical characteristics of the protein of interest. In this chapter we present a starting point and the basic guidelines to obtain the best possible results from an IP experiment with subsequent use of new-generation sequencing techniques to detect mRNA or ncRNA targets (RIPseq) and protein-DNA interactions (ChIPseq)