Development and characterization of nasal cell culture models based on the immortalized human nasal epithelial cell line RPMI 2650 for in vitro nasal permeation studies

Die nasale Mukosa hat in den letzten Jahren und Jahrzehnten an Bedeutung für die Applikation von Arzneistoffen gewonnen. Um Transport und Permeation durch die nasale Mukosa zu untersuchen, sind verschiedene In-vitro-Modelle entwickelt worden. Ziel der Arbeit war es, ein organotypisches Permeationsmodell der humanen nasalen Mukosa zu entwickeln, wobei zunächst die passive Permeation im Vordergrund stand. Hierfür wurden Untersuchungen mit isolierten humanen nasalen Epithelzellen in Primärkultur, mit der immortalisierten Zelllinie RPMI 2650 und mit exzidierter humaner Mukosa durchgeführt. Um den Einfluss einer Fibroblasten-Kokultur zu untersuchen, wurden humane nasale Fibroblasten (HNF) isoliert und kultiviert, die in kontaktlosen und dreidimensionalen Modellen mit direktem Kontakt zu den Epithelzellen eingesetzt wurden. Zudem wurde die mRNA-Expression verschiedener ABC-Transporter und deren Einfluss auf die Permeation eines Modellsubstrates in den verschiedenen Modellen charakterisiert. Zusätzlich wurde untersucht, inwieweit die Barriereigenschaften der nasalen Mukosa abhängig vom Entnahmeort in der Nasenhöhle schwanken. Hierfür wurde porcine Mukosa verwendet. In dieser Arbeit ist es gelungen, ein einfach zu kultivierendes, reproduzierbares Modell der humanen nasalen Mukosa zu entwickeln, das auf der Zelllinie RPMI 2650 basiert. Die Ergebnisse sprechen für organotypische Eigenschaften bei der passiven Permeation hydrophiler und lipophiler Stoffe und von Stoffen mit hohem Molekulargewicht. Die Expression der untersuchten ABC-Transporter ist auf Protein- und Funktionalitätsebene noch weiter zu charakterisieren. Als Nachteile des Modells sind fehlende Stoffwechselaktivität, Zilienbildung und mukoziliäre Clearance der nasalen Mukosa zu nennen. Dennoch erscheinen sowohl das reine Epithelmodell der Zelllinie RPMI 2650 als auch das dreidimensionale Modell für Permeations-Screenings als Alternative zu exzidierter Mukosa oder isolierten humanen nasalen Epithelzellen gut geeignet.Over the last decades, the nasal route became increasingly important for drug application. To study drug transport and permeation through the nasal mucosa, different in vitro models have been developed. The aim of this study was to develop an organotypic model of the human nasal mucosa for in vitro drug permeation studies. The focus was on the passive permeation through the barrier via the paracellular and transcellular pathways, in addition to a model substance of high molecular weight. Human nasal epithelial cells in primary culture were as well used as excised human nasal mucosa and the immortalized human nasal epithelial cell line RPMI 2650. To observe the influence of human nasal fibroblasts (HNF) on the properties of the cell layer, a method to isolate and cultivate HNF was established. Contact- and non-contact-coculture of epithelial cells and HNF were examined. Additionally, the mRNA expression of selected efflux transporters in the cell culture models was evaluated using PCR and a model substance for permeation studies. Furthermore, the intraindividual differences of the barrier properties of the nasal mucosa were examined using excised porcine mucosa from different locations in the nasal cavity. The findings suggest that it is possible to form a permeation model of the nasal mucosa with the immortalized human nasal epithelial cell line RPMI 2650. In conclusion, a permeation barrier for passive permeation of hydrophilic, lipophilic and large compounds was achieved, which resembles the barrier properties of human nasal mucosa. The mRNA expression of certain ABC efflux transporters could be shown, while further studies must be completed to evalute protein functionality. Keeping in mind the limits of the models, both the RPMI 2650 epithelial model on Transwell filter inserts, and the three-dimensional reconstructed human nasal mucosa model are promising alternatives for excised mucosa to evaluate passive permeation of substances through the nasal mucosa

Dissidents and God-Talk in the Johannine Epistles

Peer reviewe

Tensid free multiple w/o/w emulsions as drug delivery system: developement, preparation and characterisation

Ziel der Arbeit war es, stabile tensidfreie multiple Emulsionen herzustellen und die Freisetzung eines in die innere Wasserphase eingearbeiteten hydrophilen Wirkstoffs zu untersuchen. Für die Beurteilung der Stabilität der hergestellten Emulsionen konnten zwei neue Methoden entwickelt werden: Mit einem Bildanalyseverfahren konnte die Tropfengrößenverteilung von W/O-Primäremulsionen bestimmt werden. Des Weiteren wurde ein Verfahren entwickelt, das die Bestimmung des tatsächlichen Phasenverhältnisses einer multiplen W/O/W-Emulsion ermöglicht. Für das untersuchte System konnte gezeigt werden, dass auch eine extrem polare Substanz wie KCl durch die polymerhaltige Ölphase diffundieren kann. Daher lässt sich vermuten, dass es während der Lagerung zu einem Konzentrationsausgleich von verkapselten Arzneistoffen zwischen beiden wässrigen Phasen durch Diffusion kommen wird. Da nur der Wirkstoffanteil, der sich in der inneren Wasserphase befindet, durch die Formulierung retardiert wird, sollte das Verhältnis der inneren zur äußeren Wasserphase möglichst groß sein. Aus den Untersuchungen zur Freisetzung von Ambroxol HCl aus der multiplen Emulsion ergaben sich zwei Forderungen für die Durchführung von Freisetzungsuntersuchungen aus W/O/W-Emulsionen: Bei Verwendung eines Dialyseschlauches muss beachtet werden, dass nicht dieser die Freisetzung maßgeblich beeinflusst. Außerdem ist ein Vergleich der W/O/W- mit einer O/W-Emulsion hinsichtlich ihrer Retardierung sinnvoll. Dies ist notwendig, da es bei physiologischen pH-Werten dazu kommen kann, dass der Wirkstoff hauptsächlich in der Ölphase vorliegt und aus dieser freigesetzt wird. Die aufwändige Herstellung einer multiplen Emulsion hätte dann keinen Einfluss auf die Freisetzung und eine „einfache“ O/W-Emulsion würde die gleichen Freisetzungseigenschaften zeigen. Im Falle des untersuchten multiplen Systems konnte ein retardierender Einfluss auf die Freisetzung eindeutig dem multiplen Charakter zugeordnet werden.The aim of this study was to produce stable tensid free multiple emulsions and to characterise the release of an hydrophilic drug from the inner water phase. Two new methods were developed to evaluate the stability of these emulsions: The size distribution of the inner water droplets was determined using an image analysis software. Furthermore another new method was developed to determine the real phase ratio of multiple w/o/w emulsions. It was shown that even extreme polar substances like KCl were able to diffuse through an oil phase containing polymers by simple Fick diffusion. That leads to the conclusion that a concentration equilibration of the entrapped drug between the two water phases will be reached during storage. Since the formulation could only prolong the release of the entrapped part of the substance the ratio of inner to outer water phase should be as high as possible. Two major demands for further release studies resulted from the conducted release experiments: If a dialysis membrane is used, it has to be shown that its effect on the release is only of minor importance. Furthermore it is reasonable to compare the release kinetic of a w/o/w emulsion with that of a o/w emulsion. This is recommended because at physical pH values most of the drug can be located in the oil phase and therefore the release rate ist determined by the diffusion out of this phase. This means that the complex preparation of a multiple emulsion will have no influence on the drug release and a “simple” o/w emulsion will show the same release kinetics. In the case of the investigated multiple system a prolonged effect of the drug release could be definitely associated with the multiple character of the emulsion