Transkriptom-Analyse der frühen Infektionsphase von Ustilago maydis: Identifikation neuer pathogenitätsrelevanter Gene

Im phytopathogenen Pilz Ustilago maydis ist die Fusion kompatibler haploider Sporidien für die Initiation der pathogenen Entwicklung notwendig. Kontrolliert wird dieser Prozess durch zwei verschiedene Kreuzungstyploci, a und b. Der biallelische a-Locus kodiert dabei für ein Pheromonrezeptorsystem, welches für die Zell-Zellerkennung und die Fusion notwendig ist. Nach der Fusion ist der multiallelische b-Paarungstyplocus, der für zwei Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren kodiert, für die Aufrechterhaltung des filamentösen Dikaryons und die nachfolgende pathogene Entwicklung essentiell. Nach der Bildung eines stabilen Dikaryons ist U. maydis zur Vollendung seiner sexuellen Entwicklung jedoch auf die Wirtspflanze angewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch DNA-Microarray-Analysen frühe b-vermittelte Prozesse auf der Pflanzenoberfläche untersucht. Hierfür wurde das Expressionsprofil von Zellen eines nicht-pathogenen Stammes mit dem eines pathogenen Stammes, der ein aktives b-Heterodimer exprimiert, verglichen. Es wurden insgesamt 327 Gene identifiziert, die u. a. für Proteine mit putativen Funktionen im Pflanzenzellwandabbau oder bei der Transkriptionsregulation kodieren. Eines der auf der Pflanzenoberfläche b-induzierten Gene, biz1, kodiert für einen putativen C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor. Die Deletion von biz1 führte zu einer drastischen Reduktion der Anzahl an gebildeten Appressorien; Hyphen konnten zwar noch die Pflanzenoberfläche penetrieren, jedoch war invasives Wachstum und in planta Proliferation in Δbiz1-Stämmen nicht zu beobachten. Biz1 spielt demnach nicht nur eine wichtige Rolle in der Bildung von Appressorien, sondern vor allem in der Kolonisierung der Pflanze. Weitere DNA-Microarray-Analysen zeigten, dass Biz1 für die Regulation von 19 Genen on planta hinreichend und notwendig ist. Systematische Deletionsanalysen führten zur Identifizierung von pst1 und pst2, die für zwei putative sekretierte U. maydis-spezifische Proteine kodieren. Die gemeinsame Deletion beider Gene führte zu einem ähnlichen Phänotyp wie die Deletion von biz1. Der pst-Doppeldeletionsstamm war zwar noch in der Lage Appressorien zu bilden, arretierte sein Wachstum aber kurz nach der Penetration und zeigte ebenfalls keine Proliferation in der Pflanze. Pst1 und Pst2 scheinen damit ähnlich wie Biz1 ihre Hauptfunktion in Postpenetrationsprozessen auszuüben

Transkriptom-Analyse der frühen Infektionsphase von Ustilago maydis: Identifikation neuer pathogenitätsrelevanter Gene

Im phytopathogenen Pilz Ustilago maydis ist die Fusion kompatibler haploider Sporidien für die Initiation der pathogenen Entwicklung notwendig. Kontrolliert wird dieser Prozess durch zwei verschiedene Kreuzungstyploci, a und b. Der biallelische a-Locus kodiert dabei für ein Pheromonrezeptorsystem, welches für die Zell-Zellerkennung und die Fusion notwendig ist. Nach der Fusion ist der multiallelische b-Paarungstyplocus, der für zwei Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren kodiert, für die Aufrechterhaltung des filamentösen Dikaryons und die nachfolgende pathogene Entwicklung essentiell. Nach der Bildung eines stabilen Dikaryons ist U. maydis zur Vollendung seiner sexuellen Entwicklung jedoch auf die Wirtspflanze angewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch DNA-Microarray-Analysen frühe b-vermittelte Prozesse auf der Pflanzenoberfläche untersucht. Hierfür wurde das Expressionsprofil von Zellen eines nicht-pathogenen Stammes mit dem eines pathogenen Stammes, der ein aktives b-Heterodimer exprimiert, verglichen. Es wurden insgesamt 327 Gene identifiziert, die u. a. für Proteine mit putativen Funktionen im Pflanzenzellwandabbau oder bei der Transkriptionsregulation kodieren. Eines der auf der Pflanzenoberfläche b-induzierten Gene, biz1, kodiert für einen putativen C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor. Die Deletion von biz1 führte zu einer drastischen Reduktion der Anzahl an gebildeten Appressorien; Hyphen konnten zwar noch die Pflanzenoberfläche penetrieren, jedoch war invasives Wachstum und in planta Proliferation in Δbiz1-Stämmen nicht zu beobachten. Biz1 spielt demnach nicht nur eine wichtige Rolle in der Bildung von Appressorien, sondern vor allem in der Kolonisierung der Pflanze. Weitere DNA-Microarray-Analysen zeigten, dass Biz1 für die Regulation von 19 Genen on planta hinreichend und notwendig ist. Systematische Deletionsanalysen führten zur Identifizierung von pst1 und pst2, die für zwei putative sekretierte U. maydis-spezifische Proteine kodieren. Die gemeinsame Deletion beider Gene führte zu einem ähnlichen Phänotyp wie die Deletion von biz1. Der pst-Doppeldeletionsstamm war zwar noch in der Lage Appressorien zu bilden, arretierte sein Wachstum aber kurz nach der Penetration und zeigte ebenfalls keine Proliferation in der Pflanze. Pst1 und Pst2 scheinen damit ähnlich wie Biz1 ihre Hauptfunktion in Postpenetrationsprozessen auszuüben

Biz1, a Zinc Finger Protein Required for Plant Invasion by Ustilago maydis, Regulates the Levels of a Mitotic Cyclin

Plant invasion by pathogenic fungi involves regulated growth and highly organized fungal morphological changes. For instance, when the smut fungus Ustilago maydis infects maize (Zea mays), its dikaryotic infective filament is cell cycle arrested, and appressoria are differentiated prior to plant penetration. Once the filament enters the plant, the cell cycle block is released and fungal cells begin proliferation, suggesting a tight interaction between plant invasion and the cell cycle and morphogenesis control systems. We describe a novel factor, Biz1 (b-dependent zinc finger protein), which has two Cys(2)His(2) zinc finger domains and nuclear localization, suggesting a transcriptional regulatory function. The deletion of biz1 shows no detectable phenotypic alterations during axenic growth. However, mutant cells show a severe reduction in appressoria formation and plant penetration, and those hyphae that invade the plant arrest their pathogenic development directly after plant penetration. biz1 is induced via the b-mating–type locus, the key control instance for pathogenic development. The gene is expressed at high levels throughout pathogenic development, which induces a G2 cell cycle arrest that is a direct consequence of the downregulation of the mitotic cyclin Clb1. Our data support a model in which Biz1 is involved in cell cycle arrest preceding plant penetration as well as in the induction of appressoria

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell's DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion

The transcription factor Rbf1 is the master regulator for b-mating type controlled pathogenic development in Ustilago maydis.

In the phytopathogenic basidiomycete Ustilago maydis, sexual and pathogenic development are tightly connected and controlled by the heterodimeric bE/bW transcription factor complex encoded by the b-mating type locus. The formation of the active bE/bW heterodimer leads to the formation of filaments, induces a G2 cell cycle arrest, and triggers pathogenicity. Here, we identify a set of 345 bE/bW responsive genes which show altered expression during these developmental changes; several of these genes are associated with cell cycle coordination, morphogenesis and pathogenicity. 90% of the genes that show altered expression upon bE/bW-activation require the zinc finger transcription factor Rbf1, one of the few factors directly regulated by the bE/bW heterodimer. Rbf1 is a novel master regulator in a multilayered network of transcription factors that facilitates the complex regulatory traits of sexual and pathogenic development

Plant Surface Cues Prime <i>Ustilago maydis</i> for Biotrophic Development

<div><p>Infection-related development of phytopathogenic fungi is initiated by sensing and responding to plant surface cues. This response can result in the formation of specialized infection structures, so-called appressoria. To unravel the program inducing filaments and appressoria in the biotrophic smut fungus <i>Ustilago maydis</i>, we exposed cells to a hydrophobic surface and the cutin monomer 16-hydroxy hexadecanoic acid. Genome-wide transcriptional profiling at the pre-penetration stage documented dramatic transcriptional changes in almost 20% of the genes. Comparisons with the <i>U. maydis sho1 msb2</i> double mutant, lacking two putative sensors for plant surface cues, revealed that these plasma membrane receptors regulate a small subset of the surface cue-induced genes comprising mainly secreted proteins including potential plant cell wall degrading enzymes. Targeted gene deletion analysis ascribed a role to up-regulated GH51 and GH62 arabinofuranosidases during plant penetration. Among the <i>sho1</i>/<i>msb2</i>-dependently expressed genes were several secreted effectors that are essential for virulence. Our data also demonstrate specific effects on two transcription factors that redirect the transcriptional regulatory network towards appressorium formation and plant penetration. This shows that plant surface cues prime <i>U. maydis</i> for biotrophic development.</p></div