Modificações genéticas em linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para a fermentação de xilose

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012.Para a produção economicamente viável de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana são necessários vários avanços tecnológicos em diferentes etapas deste bioprocesso incluindo o melhoramento genético de microrganismos fermentadores. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais usado para tal por ser uma excelente fermentadora e tolerante aos estresses dos grandes processos fermentativos industriais. Dentre os principais açúcares que compõem o bagaço de cana, destaca-se a xilose, uma pentose que pertence à fração hemicelulósica. Todavia, S. cerevisiae só utiliza hexoses na fermentação, não sendo capaz de metabolizar pentoses. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma levedura capaz de fermentar xilose. Inicialmente, foi feito um estudo das características genéticas da linhagem industrial de S. cerevisiae JP1 – microrganismo hospedeiro selecionado como alvo das modificações desejadas (Capítulo 1). Pode-se verificar que a linhagem JP1 é diploide e heterotálica. Mostrou-se também sensível às principais drogas usadas em processo de seleção de recombinantes assim com uma boa eficiência de transformação. Além disso, foi construída uma linhagem auxotrófica para uracila com a dupla deleção do gene URA3. Posteriormente, a linhagem JP1 foi modificada geneticamente para se tornar capaz de fermentar xilose a etanol (Capítulo 2). Foram construídos cassetes de expressão para duas enzimas da via metabólica de xilose - xilose isomerase e xiluloquinase – clonados em vetor epissomal. A linhagem recombinante obtida foi submetida à adaptação metabólica por 48 dias em meio contendo apenas xilose como fonte de carbono, levando a um aumento na taxa de crescimento de 0,008 h-1para 0,13 h-1. Estudos preliminares de fermentação em meio sintético mostrou um acúmulo de xilitol (YX/S = 0,29 g g-1) e baixa produção de etanol (YE/S = 0,27 g g-1). Para incrementar a produção de etanol, um cassete de deleção para o gene GRE3 (aldose redutase) foi desenvolvido. Além disso, consideramos a introdução de um gene codificador para um transportador com afinidade por xilose, visando aumentar o influxo de xilose para a célula. Para tanto, foi iniciada uma análise transcricional da levedura Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 adaptada ao hidrolisado de bagaço de cana a fim de compreender a regulação em diferentes concentraçõesde xilose e glicose, além de selecionar um possível transportador de xilose para ser expresso em S. cerevisiae (Capítulo 3). Dados preliminares indicam que o gene com maior expressão em xilose foi XYL3 e, dentre os transportadores putativos de xilose, XUT1. Esse trabalho representou uma das primeiras iniciativas no País no emprego de abordagens de engenharia metabólica para o desenvolvimento de um bioprocesso em linhagem industrial de S. cerevisiae. No seu conjunto, nossos resultados preliminares mostram que o desenvolvimento da tecnologia nacional para a produção de álcool lignocelulósico utilizando microrganismos modificados geneticamente é plenamente viável. Embora a linhagem obtida nesse estudo não tenha apresentado rendimentos de etanol desejáveis a partir de xilose, foi demonstrada a eficácia das ferramentas moleculares desenvolvidas que poderão ser empregada em futuros estudos. Além disso, comprovamos que as características genéticas da linhagem industrial JP1 a tornam uma interessante plataforma para futuras modificações relacionadas a outros bioprocessos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTIn order to achieve cost-effective, second-generation ethanol production from sugarcane bagasse, several stages of this bioprocess need to be technologically upgraded, which includes the genetic improvement of fermenting microorganisms. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most employed microbe to this purpose due to its excellent fermentative properties and high tolerance to the stressing conditions of large-scale industrial fermentation. Among the sugars that constitute sugarcane bagasse, xylose, a pentose abundant in the hemicellulosic fraction, is one of the most important. However, S. cerevisiae only uses hexoses in fermentation and is incapable of catabolising pentoses. The main goal of this project was to develop a xylose-fermenting yeast strain. Initially, we made genetic profiled the industrial S. cerevisiae strain JP1, which was to be subjected to the genetic manipulations in the pursuit of our goal (Chapter 1). We assessed that JP1 is diploid and heterothallic. It was also shown to be susceptible to the main drugs used in recombinant derivative selection and to be transformable with good efficiency. Next, we created an uracyl-auxotroph derivative by double-deleting the URA3 gene. Later, the JP1 strain was genetically modified to become able to ferment xylose to ethanol (Chapter 2). We created expression cassettes for two enzymes of the xylose catabolic pathway – xylose isomerase and xylulokinase – cloned into an episomal vector. The recombinant strain was submitted to metabolic adaptation for 48 days in medium with xylose as the sole carbon source, which led to an increase in the growth rate from 0.008 h-1 to 0.13 h-1. Preliminary studies of fermentation in synthetic medium revealed a buildup of xylitol (YX/S= 0,29 g g-1) and low ethanol production (YE/S= 0,27 g g-1) by this strain. In order to increase ethanol production, a deletion cassette for the GRE3 gene (aldose reductase) was developed. In addition, we considered introducing a gene coding for a membrane transporter with affinity for xylose to increase the influx of xylose to cell. To this end, we carried out a transcriptional analysis of the yeast Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 that had been adapted to sugarcane bagasse hydrolysate in order to understand gene regulation under different xylose and glucose concentrations and thus select a putative xylose transporter that could be expressed in S. cerevisiae (Chapter 3). Preliminary data indicate that the most upregulated gene with xylose as carbon source was XYL3 and, among putative xylose transporters, XUT1. The present work was one of the first attempts in the country to use metabolic engineering to develop a bioprocess in an industrial strain of S. cerevisiae. Overall, our preliminary results show that it is fully possible to develop national technology for production of ethanol from lignocellulosic residues using genetically modified microorganisms. Although the strain obtained in the present study did not show the desired ethanol yield from xylose, the molecular tools developed in this work were shown to be effective and validated to be used in future studies. Besides, we showed that the genetic features of the industrial strain JP1 make it interesting for future modifications related to other bioprocesses

Cloning, Purification, and Partial Characterization of Bacillus subtilis Urate Oxidase Expressed in Escherichia coli

Urate oxidase (EC 1.7.3.3) is an enzyme involved in purine metabolism which is used in the treatment of gout and as diagnostic reagent for detection of uric acid. In order to produce this enzyme in large quantities for biotechnological purposes, the gene coding for the Bacillus subtilis urate oxidase was cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. Time course induction in E. coli showed an induced protein with an apparent molecular mass of ∼60 kDa. Soluble recombinant enzyme was purified in a single-step procedure using Ni-NTA column. The enzyme was purified 2.1-fold with a yield of 56% compared to the crude extract. MALDI-TOF analysis revealed an ion with a mass of 58675 Da which is in agreement with the expected mass of the recombinant protein. The purified enzyme showed an optimal pH and temperature of 8.0 and 37°C, respectively, and retained 90% of its activity after 72 hours of incubation at −20°C and 4°C

REPRESENTAÇÕES SOCIAIS SOBRE O CÂNCER ENTRE FAMILIARES DE PACIENTES EM TRATAMENTO ONCOLÓGICO

RESUMO O câncer é uma enfermidade cercada de estigmas a qual afeta emocionalmente seus portadores, assim como os seus familiares. A pesquisa teve como objetivo apreender as representações sociais sobre o câncer entre familiares de pacientes submetidos a tratamento oncológico em um hospital de São Luís-Ma. Tratou-se de um estudo de natureza exploratório-descritiva com abordagem qualitativa, em que se seguiram os pressupostos da Teoria das Representações Sociais para fundamentação da pesquisa. Os sujeitos da pesquisa foram 102 familiares de pacientes em tratamento oncológico ambulatorial e a amostra foi do tipo aleatória e espontânea. Os dados foram coletados a partir da Técnica de Evocação Livre de Palavras e analisados com o auxílio do software EVOC 2003. A análise do quadro de quatro casas demonstrou uma representação negativa do câncer por parte dos familiares, com as seguintes palavras: desespero, dor, medo, morte, sofrimento, tratamento e tristeza como núcleo central das representações. E a palavra esperança constitui a primeira periferia. O estudo sobre as representações sociais do câncer entre os familiares de pacientes oncológicos mostrou-se de grande relevância, pois apresentou o sentimento presente entre os familiares daqueles acometidos pela doença

Artigo revisão integrativa: genômica e proteômica SARS-COV-2 / Article integrative review: genomics and proteomics SARS-COV-2

Introdução: O combate à pandemia da COVID-19 decretada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) tem impulsionado pesquisas científicas em todo o mundo, como ou entre eles, a caracterização de aspectos da genômica e proteômica relacionados ao SARS-CoV-2. O SARS-CoV-2 é responsável por ocasionar doenças respiratórias e entéricas, sendo associado às infecções agudas e graves do trato respiratório e tem mostrado um impacto significativo na saúde humana global. A análise das ômicas fornece informações importantes da evolução do vírus, um dado importante para o desenvolvimento de vacinas eficazes. Métodos: Este artigo foi desenvolvido utilizando-se o método de revisão integrativa a partir de buscas na literatura nos seguintes bancos de dados: PubMed, site de buscas mantido pela Biblioteca Nacional de Medicina (NLM®) dos Estados Unidos; na PeerJ, revista científica de acesso aberto com revisão por pares e na Science Direct, plataforma para acesso a revistas científicas. Resultados: Os resultados foram compostos por onze artigos científicos, selecionados pelos critérios de inclusão previamente estabelecidos. Destes, oito foram encontrados na base de dados PubMed, um na PeerJ e dois na Science Direct. Conclusões: As variações relatadas do vírus, indicam o grande potencial de ocorrência de mutação através de exclusões e recombinações genômicas, as quais são fatores relevantes e que podem gerar desafios para o desenvolvimento de vacina

Multicopy plasmid integration in Komagataella phaffii mediated by a defective auxotrophic marker

Background: A commonly used approach to improve recombinant protein production is to increase the levels of expression by providing extra-copies of a heterologous gene. In Komagataella phaffii (Pichia pastoris) this is usually accomplished by transforming cells with an expression vector carrying a drug resistance marker following a screening for multicopy clones on plates with increasingly higher concentrations of an antibiotic. Alternatively, defective auxotrophic markers can be used for the same purpose. These markers are generally transcriptionally impaired genes lacking most of the promoter region. Among the defective markers commonly used in Saccharomyces cerevisiae is leu2-d, an allele of LEU2 which is involved in leucine metabolism. Cells transformed with this marker can recover prototrophy when they carry multiple copies of leu2-d in order to compensate the poor transcription from this defective allele. Results: A K. phaffii strain auxotrophic for leucine (M12) was constructed by disrupting endogenous LEU2. The resulting strain was successfully transformed with a vector carrying leu2-d and an EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter gene. Vector copy numbers were determined from selected clones which grew to different colony sizes on transformation plates. A direct correlation was observed between colony size, number of integrated vectors and EGFP production. By using this approach we were able to isolate genetically stable clones bearing as many as 20 integrated copies of the vector and with no significant effects on cell growth. Conclusions: In this work we have successfully developed a genetic system based on a defective auxotrophic which can be applied to improve heterologous protein production in K. phaffii. The system comprises a K. phaffii leu2 strain and an expression vector carrying the defective leu2-d marker which allowed the isolation of multicopy clones after a single transformation step. Because a linear correlation was observed between copy number and heterologous protein production, this system may provide a simple approach to improve recombinant protein productivity in K. phaffii

Factors associated with precarious prenatal care in a sample of post-partum adolescent mothers in maternity hospitals in Rio de Janeiro, Brazil, 1999-2000

Made available in DSpace on 2010-08-23T16:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license.txt: 1848 bytes, checksum: 8f66c4f51d8d752109ffb897a971b036 (MD5) LANDMANN_Assistencia Pre-Natal Adolescentes RJ_2004.pdf: 83353 bytes, checksum: 9ecf10d46d5894eba91ad16d688e6521 (MD5) LANDMANN_Assistencia Pre-Natal Adolescentes RJ_2004.pdf.txt: 39167 bytes, checksum: 2ccebc0dfa7bbbdaaf82cd517425e421 (MD5) Previous issue date: 2004Made available in DSpace on 2010-11-04T14:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 3 LANDMANN_Assistencia Pre-Natal Adolescentes RJ_2004.pdf.txt: 39167 bytes, checksum: 2ccebc0dfa7bbbdaaf82cd517425e421 (MD5) LANDMANN_Assistencia Pre-Natal Adolescentes RJ_2004.pdf: 83353 bytes, checksum: 9ecf10d46d5894eba91ad16d688e6521 (MD5) license.txt: 1848 bytes, checksum: 8f66c4f51d8d752109ffb897a971b036 (MD5) Previous issue date: 2004Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Departamento de Epidemiologia e Métodos Quantitativos em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Informação Científica e Tecnológica. Departamento de Informações em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Departamento de Epidemiologia e Métodos Quantitativos em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Departamento de Epidemiologia e Métodos Quantitativos em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Departamento de Epidemiologia e Métodos Quantitativos em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Caracterizou-se o perfil das gestantes com pré-natal precário, segundo variáveis sócio-demográficas, história reprodutiva da mãe, apoio familiar, satisfação com a gestação e comportamentos de risco durante a gravidez. Foram entrevistadas 1.967 adolescentes no pós-parto imediato de maternidades públicas, conveniadas com o SUS e particulares no Município do Rio de Janeiro. A variável dependente foi o número de consultas de pré-natal (0-3; 4-6; 7 e mais). A análise estatística testou a hipótese de homogeneidade de proporções mediante análises bi e multivariada, com o uso de regressão logística multinomial, cuja categoria de referência da variável-resposta foi a realização de > 7 consultas. Foram encontradas maiores proporções de 0-3 consultas nos grupos de mães com grau de escolaridade < 4a série do ensino fundamental; que não têm água encanada; não vivem com o pai do bebê; tiveram nascidos vivos anteriores; não ficaram satisfeitas com a gestação; não tiveram apoio do pai do bebê; tentaram interromper a gestação e as que fumaram, beberam e/ou usaram drogas durante a gestação. Pode-se concluir que as mães com piores condições de vida e comportamentos de risco na gravidez foram as que mais ficaram à margem da assistência pré-natal.This study characterizes the women receiving precarious prenatal care according to socio-demographic variables, mother’s reproductive history, family support, satisfaction with pregnancy, and risk behavior during pregnancy. A total of 1,967 adolescents were interviewed in the immediate post-partum in public and outsourced maternity hospitals in the City of Rio de Janeiro. The dependent variable was the number of prenatal appointments (0-3; 4-6; 7 or more). The statistical analysis aimed to test the hypothesis of homogeneity of proportions, including biand multivariate analysis, using multinomial logistic regression, in which the reference category for the response variable was 7 or more prenatal visits. Higher (and statistically significant) proportions of insufficient number of prenatal visits (0-3) were associated with: precarious sanitation conditions; not living with the child’s father; attempted abortion; and smoking, drinking, and/or drug use during pregnancy. The results strongly indicate that mothers with worse living conditions and risk behavior during pregnancy were the same who lacked access to prenatal care

Construction and characterization of centromeric plasmids for Komagataella phaffii using a color-based plasmid stability assay.

The yeast Komagataella phaffii is widely used as a microbial host for heterologous protein production. However, molecular tools for this yeast are basically restricted to a few integrative and replicative plasmids. Four sequences that have recently been proposed as the K. phaffii centromeres could be used to develop a new class of mitotically stable vectors. In this work, we designed a color-based genetic assay to investigate plasmid stability in K. phaffii and constructed vectors bearing K. phaffii centromeres and the ADE3 marker. These genetic tools were evaluated in terms of mitotic stability by transforming an ade2/ade3 auxotrophic strain and regarding plasmid copy number by quantitative PCR (qPCR). Our results confirmed that the centromeric plasmids were maintained at low copy numbers as a result of typical chromosome-like segregation during cell division. These features, combined with in vivo assembly possibilities, prompt these plasmids as a new addition to the K. phaffii genetic toolbox

Xylose Fermentation by Saccharomyces cerevisiae: Challenges and Prospects

Many years have passed since the first genetically modified Saccharomyces cerevisiae strains capable of fermenting xylose were obtained with the promise of an environmentally sustainable solution for the conversion of the abundant lignocellulosic biomass to ethanol. Several challenges emerged from these first experiences, most of them related to solving redox imbalances, discovering new pathways for xylose utilization, modulation of the expression of genes of the non-oxidative pentose phosphate pathway, and reduction of xylitol formation. Strategies on evolutionary engineering were used to improve fermentation kinetics, but the resulting strains were still far from industrial application. Lignocellulosic hydrolysates proved to have different inhibitors derived from lignin and sugar degradation, along with significant amounts of acetic acid, intrinsically related with biomass deconstruction. This, associated with pH, temperature, high ethanol, and other stress fluctuations presented on large scale fermentations led the search for yeasts with more robust backgrounds, like industrial strains, as engineering targets. Some promising yeasts were obtained both from studies of stress tolerance genes and adaptation on hydrolysates. Since fermentation times on mixed-substrate hydrolysates were still not cost-effective, the more selective search for new or engineered sugar transporters for xylose are still the focus of many recent studies. These challenges, as well as under-appreciated process strategies, will be discussed in this review