Role of the different actin genes during extrusion of capping protein mutant cells in the Drosophila wing blade epithelium

Dissertação mest., Biotecnologia, Universidade do Algarve, 2008O citosqueleto da actina é constituido por um enorme número de proteínas e mecanismos regulatórios que estão envolvidos na polimerização, depolimerização e organização dos filamentos de actina. Por esta razão, este sistema é vulnerável a alterações genéticas que podem vir a causar determinadas doenças, tais como o cancro. Nas células cancerígenas, as perturbações estruturais e funcionais do citosqueleto de actina estão relacionadas com elevadas taxas de proliferação e movimentos não controlados das células. Os discos imaginais de Drosophila são considerados um modelo de estudo bastante interessante para estudar a morfogénese epitelial, uma vez que estes são considerados verdadeiro tecido epitelial, o qual é diferenciado e fácil de dissecar. Ainda assim, as vantagens deste modelo de estudo baseia-se principalmente no enorme sucesso de Drosophila como organismo modelo genético. Os discos imaginais consistem de um epitélio colunar coberto por uma membrana peripodial. As células colunares compreendem uma camada de células lateralmente coerentes que são polarizadas ao longo do eixo apical-basal. Estas células epiteliais contém junções celulares (AJ) compostas principalmente por E-caderina e a- e b-catenina (em Drosophila codificada por armadillo). Estas junções celulares localizadas na região apical das células fazem a ligação entre o citosqueleto de actina das células vizinhas. Na região superior das AJ existem dois complexos que estão envolvidos na regulação da polaridade epitelial, que são o complexo Baz/Par-6/aPKC e o complexo Crb/Stardust/Patj. Na parte basal das AJ existe um outro complexo formado por Dlg/Scribble/Lgl. O crescimento e divisão do disco imaginal da asa ocorre durante o desenvolvimento larvar. No terceiro estádio de desenvolvimento da larva, o disco imaginal é extensivamente regulado por complexos padrões de expressão de genes, que dividem o disco em vários territórios ou compartimentos. O disco é ainda dividido em três regiões distintas: a região da blade, a qual irá dar origem à asa, a região da hinge, que irá dar origem às estruturas que ligam a asa ao tórax da mosca e a região do notum, a qual irá dar origem ao tórax. Em todos os organismos eucariotas, o citosqueleto de actina desempenha um papel fundamental em numerosos processos celulares, tais como, geração e mantimento iv da morfologia e polaridade celular, endocitose e tráfego intracelular, contratibilidade, mobilidade e divisão celular. A actina é uma das proteínas mais abundantes e com elevado grau de conservação nos organismos eucariotas. Tal como nos mamíferos, Drosophila codifica seis proteínas de actina que diferem em apenas alguns aminoácidos, mas em contrapartida a sua expressão é altamente regulada durante o desenvolvimento. Em Drosophila, as isoformas de actina são codificadas por: actina 5C, actina 42A, actina 57B, actina 79B, actina 87E e actina 88F. Os genes de actina podem ser subdivididos em três grupos, com base no estádio de desenvolvimento onde estes se expressam. Dois genes de actina codificam actinas citoplasmáticas (actina 5C e 42A), enquanto quatro genes de actina codificam actinas específicas do músculo. Estas quatro actinas podem ser depois subdivididas em actinas do músculo das asas (actina 79B e 88F) e actinas do músculo da larva (actina 57B e 87E). As seis isoformas de actina são reguladas durante o desenvolvimento ao nível da transcrição e ao nível da pos-tradução. O primeiro nível de regulação ocorre quando, por exemplo, os fragmentos de genes de actina clonados para examinar os níveis individuais de RNA mensageiro em diferentes estádios de desenvolvimento de organismos e partes do corpo dissecadas, foi observado que cada gene de actina é transcrito para RNA mensageiro funcional, o qual se acumula com padrões distintos. Os genes de actina podem ainda ser regulados ao nível proteico. Por exemplo, quando os diferentes genes de actina ligados à proteina GFP são sobreexpressos no epitélio folicular de Drosophila, estes são incorporados em diferentes estruturas de filamentos de actina dentro da célula. A actina existe em dois estados, em monómeros ou em filamentos. Os monómeros de actina têm a habilidade de polimerizar em filamentos, enquanto os filamentos depolimerizam em monómeros através de um mecanismo chamado treadmilling. Dada a elevada dinâmica deste ciclo da actina é necessária uma regulação eficaz do mesmo, a qual é desempenhada por proteínas que se ligam à actina (ABPs). Um enorme número de ABPs são responsáveis pelo controlo do crescimento, estabilidade, polimerização/depolimerização e organização dos filamentos de actina. Uma dessas proteínas é o heterodímero capping protein (CP), o qual é composto por duas subunidades ab que se ligam à região terminal dos filamentos de actina onde os monómeros são incorporados, impedindo assim a adição ou perda de monómeros de v actina. Portanto, a CP é necessária para a prevenção da polimerização dos filamentos de actina e quando esta proteína não está presente nas células, os filamentos de actina acumulam-se em excesso. Curiosamente, a remoção de qualquer uma das subunidades da CP, cpa ou cpb, resulta em diferentes fenótipos dependente do contexto epitelial, sugerindo que o citosqueleto da actina não é equivalente entre os tecidos epiteliais. Uma vez que algumas ABPs regulam a dinâmica da actina de um modo específico para cada isoforma de actina, o objectivo deste trabalho é investigar se a CP poderá prevenir a polimerização de isoformas de actina específicas num tecido específico. Para isso, analisei as consequências de desenvolvimento quando cada um dos seis genes de actina ligados à proteína GFP são sobreexpressos durante a morfogénese do epitélio da asa. Embora tenha observado que as seis isoformas de actina-GFP são sobreexpressas a níveis similares e que estas promovem uma acumulação excessiva de filamentos de actina, cada isoforma é incorporada em subpopulações específicas de filamentos e resultam em várias consequências de desenvolvimento que parecem ser dependentes da região do disco e do tempo (estádio de desenvolvimento). Assim como na ausência de CP, a sobreexpressão das isoformas de actina 5C, 42A e 57B promove o sobrecrescimento da região da hinge, o qual está associado à sobre-regulação do Wingless. Enquanto, na região da blade, apenas a sobreexpressão da isoforma de actina 42A promove o mesmo fenótipo observado quando há perda de CP. Isto sugere que a CP previne a polimerização das isoformas de actina 5C, 42A e 57B na região da hinge para regular o mecanismo Hippo e restringir o crescimento desta região. Enquanto, na região da blade, a CP previne especificamente a polimerização da isoforma de actina 42A para restringir a actividade da Src. Todos os resultados apresentados sugerem que, embora não seja clara a razão da existência das diversas isoformas de actina e a razão pela qual estas foram retidas durante a evolução, cada gene de actina parece possuir uma função específica durante a morfogénese do epitélio da asa

Transthoracic echocardiography reference values in juvenile and adult 129/Sv mice

Background In the recent years, the use of Doppler-echocardiography has become a standard non-invasive technique in the analysis of cardiac malformations in genetically modified mice. Therefore, normal values have to be established for the most commonly used inbred strains in whose genetic background those mutations are generated. Here we provide reference values for transthoracic echocardiography measurements in juvenile (3 weeks) and adult (8 weeks) 129/Sv mice. Methods Echocardiographic measurements were performed using B-mode, M-mode and Doppler-mode in 15 juvenile (3 weeks) and 15 adult (8 weeks) mice, during isoflurane anesthesia. M-mode measurements variability of left ventricle (LV) was determined. Results Several echocardiographic measurements significantly differ between juvenile and adult mice. Most of these measurements are related with cardiac dimensions. All B-mode measurements were different between juveniles and adults (higher in the adults), except for fractional area change (FAC). Ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS), calculated from M-mode parameters, do not differ between juvenile and adult mice. Stroke volume (SV) and cardiac output (CO) were significantly different between juvenile and adult mice. SV was 31.93 ± 8.67 μl in juveniles vs 70.61 ± 24.66 μl in adults, ρ < 0.001. CO was 12.06 ± 4.05 ml/min in juveniles vs 29.71 ± 10.13 ml/min in adults, ρ < 0.001. No difference was found in mitral valve (MV) and tricuspid valve (TV) related parameters between juvenile and adult mice. It was demonstrated that variability of M-mode measurements of LV is minimal. Conclusions This study suggests that differences in cardiac dimensions, as wells as in pulmonary and aorta outflow parameters, were found between juvenile and adult mice. However, mitral and tricuspid inflow parameters seem to be similar between 3 weeks and 8 weeks mice. The reference values established in this study would contribute as a basis to future studies in post-natal cardiovascular development and diagnosing cardiovascular disorders in genetically modified mouse mutant lines.Peer Reviewe

Circadian clock genes Bmal1 and Clock during early chick development

Background: The circadian clock is a well‐described temporal organizer in adult organisms. Despite the particularly evident need for temporal control during embryo development, the effect of environmental cues is still greatly neglected. Few studies have reported circadian clock gene expression in early embryonic stages. However, nothing is known about circadian clock gene expression and function in the first stages of avian embryogenesis. Results/Conclusions: In this work, the presence and spatial distribution of core circadian clock Bmal1 and Clock transcripts were thoroughly characterized during the first 50 hr of chick development using reverse transcriptase‐polymerase chain reaction (RT‐PCR), single and double whole‐mount in situ hybridization and subsequent cross‐section histology analysis. RT‐PCR detected both Bmal1 and Clock transcripts since the egg is laid and until the embryo reaches the 22‐somite stage. Whole‐mount in situ hybridization showed that Bmal1 and Clock are expressed in the Hensen's node and primitive streak at early gastrula stage. Later, both mRNAs are present in the developing nervous system, optic vesicle, notochord, foregut, and somites. Clock was further identified in the developing heart. Noticeably, Bmal1 and Clock are expressed with a “salt and pepper” pattern, suggesting the existence of nonentrained oscillatory transcription which could play a nondependent dark/light function during chick embryo development.The authors thank Catarina Olimpio for critically reading this manuscript. This work was supported by L. G. and F. B. were supported by national Portuguese funding through FCT-Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia, project ref. PEst-OE/EQB/LA0023/201. L. G. and F. B. were supported by FCT grants SFRH/BPD/65652/2009 and SFRH/BPD/17368/2004, respectively

Nanoencapsulation of Gla-Rich Protein (GRP) as a Novel Approach to Target Inflammation

LA/P/0101/2020 LA/P/0140/2020 AAC nº 41/ALG/2020—Project nº 072583—NUTRISAFEChronic inflammation is a major driver of chronic inflammatory diseases (CIDs), with a tremendous impact worldwide. Besides its function as a pathological calcification inhibitor, vitamin K-dependent protein Gla-rich protein (GRP) was shown to act as an anti-inflammatory agent independently of its gamma-carboxylation status. Although GRP’s therapeutic potential has been highlighted, its low solubility at physiological pH still constitutes a major challenge for its biomedical application. In this work, we produced fluorescein-labeled chitosan-tripolyphosphate nanoparticles containing non-carboxylated GRP (ucGRP) (FCNG) via ionotropic gelation, increasing its bioavail-ability, stability, and anti-inflammatory potential. The results indicate the nanosized nature of FCNG with PDI and a zeta potential suitable for biomedical applications. FCNG’s anti-inflammatory activity was studied in macrophage-differentiated THP1 cells, and in primary vascular smooth muscle cells and chondrocytes, inflamed with LPS, TNFα and IL-1β, respectively. In all these in vitro human cell systems, FCNG treatments resulted in increased intra and extracellular GRP levels, and decreased pro-inflammatory responses of target cells, by decreasing pro-inflammatory cytokines and inflammation mediators. These results suggest the retained anti-inflammatory bioactivity of ucGRP in FCNG, strengthening the potential use of ucGRP as an anti-inflammatory agent with a wide spectrum of application, and opening up perspectives for its therapeutic application in CIDs.publishersversionpublishe