A phenotypic screen using intrabodies in a colorectal cancer model

L'expression intracellulaire des anticorps (intracorps) est une approche qui permet l'étude et le ciblage des antigènes dans les compartiments intracellulaires. Néanmoins, l'expression d'anticorps entiers fonctionnels dans les cellules reste une tâche difficile en raison de leur grande taille et de leur structure, l'environnement réducteur du milieu intracellulaire étant défavorable à la formation des ponts disulfure. Notre groupe a une forte expertise dans le domaine de l'immunisation intracellulaire et son application pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, notre équipe a élaboré des banques de fragments d'anticorps scFv optimisés pour une meilleure expression intracellulaire. Nos travaux antérieurs ont démontré que ces intracorps peuvent cibler spécifiquement des domaines ou des modifications post-traductionnelles de protéines dans des cellules vivantes. Ceci est particulièrement important car il démontre l'un des avantages principaux des intracorps par rapport à l'approche basée sur l'ARNi. Cet avantage a été démontré par un criblage phénotypique dans un modèle d'allergie. En appliquant cette approche à l'étude de l'activation des mastocytes, nous avons pu identifier un nouvel acteur moléculaire impliqué dans la voie de signalisation mise en jeu. Ce travail a été protégé par un brevet européen en 2013 et est publié récemment. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai construit une nouvelle banque synthétique (HUSCIv) optimisée pour la stabilité, la diversité et l'affinité des scFvs. Pour cela, le scFv 13R4 isolé dans notre équipe a servi de charpente pour le greffage des différentes boucles hypervariables, tout en respectant la diversité des régions CDR observée dans les anticorps naturels humains. Nous avons utilisé la protéine GFP en tant que rapporteur pour étudier le repliement et la solubilité des intracorps. Nos résultats ont clairement démontré que la plupart des intracorps issus de la banque HUSCIv sont soluble dans le cytoplasme des cellules mammifères. Mon projet de thèse décrit ici rapporte l'utilisation de la banque HUSCIv pour un criblage phénotypique dans des cellules de cancer colorectal portant une mutation du gène K-RAS et résistantes au traitement par l'anticorps chimérique Cetuximab. Le projet cherche à sélectionner des scFv capables de restaurer la sensibilité au Cetuximab, avec comme objectif l'identification des cibles intracellulaires impliquées.Pour ce criblage fonctionnel, la banque HUSCIv a été exprimée dans les cellules HCT116 par l'intermédiaire d'un système d'expression rétroviral. Le processus de sélection est basé sur la sélection directe de la prolifération des cellules en utilisant un colorant fluorescent (CMRA). Les cellules dont la prolifération est bloquée sont isolées et un séquençage à haut débit permet de suivre l'évolution des populations de scFv tout au long de l'expérience. Ainsi, ce projet a nécessité un séquençage profond d'un grand nombre de scFv afin de réaliser une analyse statistique. Nous avons réalisé à ce jour deux tours de sélection. Les tests de cytotoxicité réalisés sur les populations sélectionnées ont montré une inhibition significative de la prolifération en présence du Cetuximab d'environ 10%. Ces résultats indiquent l'évolution du phénotype qui tend vers une sélection de scFv inhibiteurs et suggèrent que nous devons réaliser au moins un ou plusieurs tours plus sélectifs avant de formuler des conclusions.L'approche introduite ici est différente de toutes les études existantes en ce qu'elle utilise des banques « naïves », et permet non seulement de répondre à la diversité du protéome, mais aussi d'étudier les messagers secondaires et le métabolisme des cellules. En tant que tel, et par rapport à d'autres approches à grande échelle, celle-ci représente une voie simple pour la découverte de molécules thérapeutiques potentielles.Intracellular expression of antibodies (intrabodies) permitted the study and targeting of antigens in cellular compartments. However, the expression of functional intrabodies remains a difficult task due to their large size, structure, and the reducing intracellular environment. Our group has a strong expertise in the field of intracellular immunization and the identification of new therapeutic targets. For this purpose, we have developed an scFv library optimized for intracellular expression of scFv antibody fragments. Our previous works have shown the successful use of intrabodies for targeting specific domains or post-translational modifications in living cells. This is particularly important because it demonstrates one of the main advantages of intrabodies compared to the approaches using RNAi. This benefit was demonstrated by a phenotypic screen in a model of allergy. Applying this approach to the study of mast cell activation, we identified a new molecular player involved in the signaling pathway implemented. This work was protected by a European patent in 2013 and was recently published. As part of my thesis project, I designed a new synthetic library (HUSCIv) optimized for scFv stability, diversity and affinity. For this, a highly soluble and hyper-stable framework, scFv13R4 isolated in our group, was used as a scaffold for grafting different hypervariable loops, while respecting the diversity of CDRs observed in human natural antibodies. We used protein GFP as a reporter to study the folding and solubility of intrabodies. Our findings clearly demonstrated that most of the intrabodies from HUSCIv library are soluble in the cytoplasm of mammalian cells. My thesis project described here reports the use of HUSCIv in a phenotypic screen of colorectal cancer cells carrying a mutation in the K-RAS gene and resistant to the treatment with the chimeric antibody Cetuximab. The project seeks to select scFv fragments able to restore the sensitivity to Cetuximab, with the objective to identify the intracellular targets involved. For this functional screen, the HUSCIv library was expressed in HCT116 cells via a retroviral expression system. The selection process is based on the direct selection of cell proliferation using a fluorescent dye (CMRA). The cells whose proliferation is blocked are isolated and the evolution of scFv populations throughout the experiment are tracked via high-throughput sequencing. This sequencing requires a large number of scFvs to perform a statistical analysis. So far, we have achieved two rounds of selection. The cytotoxicity tests carried out on the selected populations showed a significant inhibition of proliferation (10%) in the presence of Cetuximab. These results indicate that the evolving phenotypes are tending towards a selection of scFv inhibitors and suggest that we need to perform at least one or more selective rounds before making conclusions. The approach introduced here is different from all existing studies in that it uses "naive" libraries not only to respond to the diversity of the proteome, but also to study secondary messengers and metabolism in cells. As such, and in comparison to other large-scale approaches, it is a simple way for the discovery of potential therapeutic molecules

Criblage phénotypique à l'aide d'intracorps dans un modèle de cancer colorectal

Intracellular expression of antibodies (intrabodies) permitted the study and targeting of antigens in cellular compartments. However, the expression of functional intrabodies remains a difficult task due to their large size, structure, and the reducing intracellular environment. Our group has a strong expertise in the field of intracellular immunization and the identification of new therapeutic targets. For this purpose, we have developed an scFv library optimized for intracellular expression of scFv antibody fragments. Our previous works have shown the successful use of intrabodies for targeting specific domains or post-translational modifications in living cells. This is particularly important because it demonstrates one of the main advantages of intrabodies compared to the approaches using RNAi. This benefit was demonstrated by a phenotypic screen in a model of allergy. Applying this approach to the study of mast cell activation, we identified a new molecular player involved in the signaling pathway implemented. This work was protected by a European patent in 2013 and was recently published. As part of my thesis project, I designed a new synthetic library (HUSCIv) optimized for scFv stability, diversity and affinity. For this, a highly soluble and hyper-stable framework, scFv13R4 isolated in our group, was used as a scaffold for grafting different hypervariable loops, while respecting the diversity of CDRs observed in human natural antibodies. We used protein GFP as a reporter to study the folding and solubility of intrabodies. Our findings clearly demonstrated that most of the intrabodies from HUSCIv library are soluble in the cytoplasm of mammalian cells. My thesis project described here reports the use of HUSCIv in a phenotypic screen of colorectal cancer cells carrying a mutation in the K-RAS gene and resistant to the treatment with the chimeric antibody Cetuximab. The project seeks to select scFv fragments able to restore the sensitivity to Cetuximab, with the objective to identify the intracellular targets involved. For this functional screen, the HUSCIv library was expressed in HCT116 cells via a retroviral expression system. The selection process is based on the direct selection of cell proliferation using a fluorescent dye (CMRA). The cells whose proliferation is blocked are isolated and the evolution of scFv populations throughout the experiment are tracked via high-throughput sequencing. This sequencing requires a large number of scFvs to perform a statistical analysis. So far, we have achieved two rounds of selection. The cytotoxicity tests carried out on the selected populations showed a significant inhibition of proliferation (10%) in the presence of Cetuximab. These results indicate that the evolving phenotypes are tending towards a selection of scFv inhibitors and suggest that we need to perform at least one or more selective rounds before making conclusions. The approach introduced here is different from all existing studies in that it uses "naive" libraries not only to respond to the diversity of the proteome, but also to study secondary messengers and metabolism in cells. As such, and in comparison to other large-scale approaches, it is a simple way for the discovery of potential therapeutic molecules.L'expression intracellulaire des anticorps (intracorps) est une approche qui permet l'étude et le ciblage des antigènes dans les compartiments intracellulaires. Néanmoins, l'expression d'anticorps entiers fonctionnels dans les cellules reste une tâche difficile en raison de leur grande taille et de leur structure, l'environnement réducteur du milieu intracellulaire étant défavorable à la formation des ponts disulfure. Notre groupe a une forte expertise dans le domaine de l'immunisation intracellulaire et son application pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, notre équipe a élaboré des banques de fragments d'anticorps scFv optimisés pour une meilleure expression intracellulaire. Nos travaux antérieurs ont démontré que ces intracorps peuvent cibler spécifiquement des domaines ou des modifications post-traductionnelles de protéines dans des cellules vivantes. Ceci est particulièrement important car il démontre l'un des avantages principaux des intracorps par rapport à l'approche basée sur l'ARNi. Cet avantage a été démontré par un criblage phénotypique dans un modèle d'allergie. En appliquant cette approche à l'étude de l'activation des mastocytes, nous avons pu identifier un nouvel acteur moléculaire impliqué dans la voie de signalisation mise en jeu. Ce travail a été protégé par un brevet européen en 2013 et est publié récemment. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai construit une nouvelle banque synthétique (HUSCIv) optimisée pour la stabilité, la diversité et l'affinité des scFvs. Pour cela, le scFv 13R4 isolé dans notre équipe a servi de charpente pour le greffage des différentes boucles hypervariables, tout en respectant la diversité des régions CDR observée dans les anticorps naturels humains. Nous avons utilisé la protéine GFP en tant que rapporteur pour étudier le repliement et la solubilité des intracorps. Nos résultats ont clairement démontré que la plupart des intracorps issus de la banque HUSCIv sont soluble dans le cytoplasme des cellules mammifères. Mon projet de thèse décrit ici rapporte l'utilisation de la banque HUSCIv pour un criblage phénotypique dans des cellules de cancer colorectal portant une mutation du gène K-RAS et résistantes au traitement par l'anticorps chimérique Cetuximab. Le projet cherche à sélectionner des scFv capables de restaurer la sensibilité au Cetuximab, avec comme objectif l'identification des cibles intracellulaires impliquées.Pour ce criblage fonctionnel, la banque HUSCIv a été exprimée dans les cellules HCT116 par l'intermédiaire d'un système d'expression rétroviral. Le processus de sélection est basé sur la sélection directe de la prolifération des cellules en utilisant un colorant fluorescent (CMRA). Les cellules dont la prolifération est bloquée sont isolées et un séquençage à haut débit permet de suivre l'évolution des populations de scFv tout au long de l'expérience. Ainsi, ce projet a nécessité un séquençage profond d'un grand nombre de scFv afin de réaliser une analyse statistique. Nous avons réalisé à ce jour deux tours de sélection. Les tests de cytotoxicité réalisés sur les populations sélectionnées ont montré une inhibition significative de la prolifération en présence du Cetuximab d'environ 10%. Ces résultats indiquent l'évolution du phénotype qui tend vers une sélection de scFv inhibiteurs et suggèrent que nous devons réaliser au moins un ou plusieurs tours plus sélectifs avant de formuler des conclusions.L'approche introduite ici est différente de toutes les études existantes en ce qu'elle utilise des banques « naïves », et permet non seulement de répondre à la diversité du protéome, mais aussi d'étudier les messagers secondaires et le métabolisme des cellules. En tant que tel, et par rapport à d'autres approches à grande échelle, celle-ci représente une voie simple pour la découverte de molécules thérapeutiques potentielles

Mapping within-field soil variability for precision agriculture using electromagnetic induction

peer reviewedAmong the crops production factors, the soil is obviously one of the most important. Therefore, within the context of Precision Agriculture, the spatial variability knowledge of its physical and chemical properties is essential as a decision support information for cultural operations modulation. The purpose of this study is to assess the capability of electromagnetic induction sensing of apparent electrical conductivity (ECa) for the characterisation of withinfield variability of soil physical and/or chemical properties in the particular soil conditions encountered in our experimental area, namely non-saline deep silty soils. ECa maps were produced on a 7ha field in April 2001, September 2001 and April 2002. Concurrently, an intensive soil survey (112 points) was carried out in February 2001 in order to determine a series of physical, textural and chemical soil parameters. ECa accurately described clay content, and exchangeable K and Ca cations concentrations.Etude de la variabilité spatiale des champs cultivé

In-cell intrabody selection from a diverse human library identifies C12orf4 protein as a new player in rodent mast cell degranulation.

The high specificity of antibodies for their antigen allows a fine discrimination of target conformations and post-translational modifications, making antibodies the first choice tool to interrogate the proteome. We describe here an approach based on a large-scale intracellular expression and selection of antibody fragments in eukaryotic cells, so-called intrabodies, and the subsequent identification of their natural target within living cell. Starting from a phenotypic trait, this integrated system allows the identification of new therapeutic targets together with their companion inhibitory intrabody. We applied this system in a model of allergy and inflammation. We first cloned a large and highly diverse intrabody library both in a plasmid and a retroviral eukaryotic expression vector. After transfection in the RBL-2H3 rat basophilic leukemia cell line, we performed seven rounds of selection to isolate cells displaying a defect in FcεRI-induced degranulation. We used high throughput sequencing to identify intrabody sequences enriched during the course of selection. Only one intrabody was common to both plasmid and retroviral selections, and was used to capture and identify its target from cell extracts. Mass spectrometry analysis identified protein RGD1311164 (C12orf4), with no previously described function. Our data demonstrate that RGD1311164 is a cytoplasmic protein implicated in the early signaling events following FcεRI-induced cell activation. This work illustrates the strength of the intrabody-based in-cell selection, which allowed the identification of a new player in mast cell activation together with its specific inhibitor intrabody

Anti-C12orf4 intrabody inhibits mast cell degranulation.

<p>Analysis of stable clone 5H4: a) measurement of Annexin-V staining; b) β-hexosaminidase release; c) calcium flux and d) TNFα secretion. T-: Irrelevant intrabody. S: IgE/DNP stimulated. NS: unstimulated. Boxplot whiskers extend to the most extreme data point that is no more than 1.5 times the interquartile range. e) Measure of β-hexosaminidase release by retroviral infected populations. Clone R_8 is identical to the intrabody expressed by the plasmid clone 5H4. Sequences of the clones are given in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0104998#pone.0104998.s006" target="_blank">Fig. S6</a>. Boxplot whiskers extend to the most extreme data point. f) Specific binding of 5H4-VH to C12orf4. Top panel: pull-down assay using 5H4-VH as capture agent and a commercial anti-C12orf4 polyclonal serum to reveal the protein. Irr: Irrelevant VH fragment, differing from 5H4 VH only by its CDR3 sequence. Low panel: subcellular localization of C12orf4 analyzed by confocal laser microscopy after double staining. Top left: Hoechst; top right: 5H4-VH-Fc fusion; bottom left: anti-C12orf4 commercial antibody; bottom right: merge. *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (Student t-test).</p

Selection of intrabodies that inhibit mast cell degranulation.

<p>a) Schematic view of the selection method. The scFv/intrabody library previously described <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0104998#pone.0104998-Philibert1" target="_blank">[13]</a> was cloned in plasmid and retroviral vectors and used to transfect the RBL-2H3 cell line in order to induce a phenotypic diversity in a collection of cells. Clones displaying the desired phenotype, measured by inhibition of degranulation, were selected and the couple constituted by the inhibitory intrabody and its target antigen was identified and characterized. b) Annexin-V staining of cell populations from the library selection rounds is illustrated as the ratio of the geometric mean (MFI) of the FcεRI-stimulated (S) to the unstimulated (NS) cells (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0104998#pone.0104998.s001" target="_blank">Fig. S1</a>).</p