Involvement of the Jak/STAT pathway in platelet-activating factor receptor signaling

Le facteur activateur de plaquettes (PAF) est un médiateur phospholipidique, exerçant son influence au niveau des systèmes nerveux, cardio-vasculaire, reproducteur, respiratoire et immunitaire. Le PAF est produit par une grande variété de cellules, incluant les monocytes/macrophages, neutrophiles, lymphocytes et cellules endothéliales. Ces cellules pettvent être à la fois source et cible du PAF. Les effets du PAF passent par l'activation d'un récepteur spécifique faisant partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Une fois stimulés, les récepteurs du PAF peuvent activer des effecteurs variés: des canaux ioniques, des adénylate cyclases, des phospholipases (PLA2, PLC, PLD) et certaines kinases (PKC, PI3K, MAPK). Il a été démontré que les inhibiteurs des protéines kinases inhibent l'activation de PLD, MAPK et PLA2 induite par le PAF. La nature des kinases impliquées reste méconnue, cependant. Dans cette étude, nous avons démontré que le PAF active des tyrosine kinases Jak2 et Tyk2 dans les cellules des lignées myéloïdes MonoMac-1 et U937, ainsi que dans les cellules COS-7 transfectées de façon transitoire avec le récepteur du PAF et les kinases. Il s'ensuit alors une phosphorylation des résidus tyrosines des facteurs STATl, STAT2, STAT3 et STAT5 ainsi qu'une translocation des STATl et STAT3 au noyau. Nous avons trouvé que Tyk2 est associée avec le récepteur du PAF et qu'elle est nécessaire pour l'activation du promoteur du PAFR. Pour étudier les mécanismes de la transcription du P AFR dependant de Tyk2, nous avons utilisé les récepteurs mutants non-couplés aux protéines G. Nous avons aussi créé des minigènes codant pour les boucles intracellulaires du P AFR et examiné leur capacité à inhiber la signalisation. Nous avons trouvé que les récepteurs mutants D63N, D289A, Y293A, non-couplés aux protéines G, étaient capables d'induire l'activation du promoteur du PAFR via Tyk2. Nous avons déterminé que la deuxième boucle intracellulaire et la queue C-terminale du récepteur sont importantes pour la transcription du PAFR dependante de Tyk2. De plus, la substitution E51A dans la première boucle intracellulaire du P AFR abolit la capacité du récepteur à induire l'activation du promoteur du P AFR. Nous avons aussi exploré les mécanismes de l'activation de Jak2 par PAFR. Nous avons trouvé que Jak2 est activée par le PAF indépendamment des protéines G, de l'internalisation et de la translocation des arrestines. L'association de Jak2 avec le récepteur a été détectée après la stimulation par le PAF et seulement en présence de Tyk2 active. L'activité catalytique de Tyk2 a aussi été impliquée dans l'activation de Jak2 après stimulation par le PAF. La co-expression d'un mutant dominant négatif de Tyk2, K930I, a aboli la phosphorylation de Jak2. À l'aide des mutants de délétion de Tyk2 et du P AFR ainsi que des protéines de fusion, portant des boucles intracellulaires du P AFR, nous avons démontré que P AFR a des sites multiples de liaison de Tyk2. En résumé, notre travail démontre que le récepteur du PAF induit la voie d'activation Jak/STAT et que cette voie joue un rôle dans la régulation transcriptionelle du promoteur du P AFR. En plus, nous avons défini les mécanismes d'activation de Tyk2 et Jak2 comme indépendants de protéine G, de l'internalisation et des arrestines. Nous avons déterminé les régions du récepteur importantes pour le couplage et l'activation de Tyk2.Abstract: Platelet-activating factor (PAF) is a potent phospholipid mediator involved in a variety of pathophysiological events, such as inflammation, asthma, cardiovascular disease, reproduction, and cerebral ischemia. PAF activates multiple signaling pathways and triggers a diverse array of biological actions by interacting with a specific receptor that belongs to the G-protein coupled receptor family (GPCR). Initially we were interested in determining whether PAF could activate the Jak/STAT pathway. This signaling cascade is known to be stimulated by cytokines and growth factors, however, recent reports indicate that it is also implicated in GPCR-mediated signal transduction. We found that PAF induced rapid Jak2 and Tyk2 tyrosine phosphorylation in the monocytic cell line MonoMac-1 and in COS-7 cells transiently transfected with PAFR and Tyk2 or Jak2 cDNAs. Tyk2 activation in MonoMac-1 cells was rapid and declined to basal levels after 5 min of PAF treatment, while Jak2 phosphorylation was sustained for a longer period. In COS-7 cells, transiently expressing PAFR and Jaks, Jak2 tyrosine phosphorylation was comparable to that in MonoMac-1 cells, whereas the increase in the level of tyrosine phosphorylation of Tyk2 was lower. In MonoMac-1 cells, PAF-induced activation of kinases was followed by transient tyrosine phosphorylation of STAT1, 2, 3 and sustained phosphorylation of STAT5 and subsequent STAT1 and STAT3 translocation to the nucleus. In a reconstituted system, PAF-mediated STAT1 and STAT3 nuclear translocation required the presence of Tyk2. PAF is known to upregulate its own receptor in certain cells. To explore the role of the Jak/STAT pathway in regulation of PAFR transcription, we used a PAFR promoter 1 construct that consists of several putative STAT-binding sites. Our results showed that Tyk2 was obligatory for PAF-stimulated PAFR promoter 1 activation. To study the mechanisms of Tyk2-dependent PAFR transcription we used mutants with impaired G-protein coupling and C-terminal deletion mutants of the receptor. We also created minigene constructs encoding the intracellular loops of PAFR and investigated their ability to inhibit signaling. We found that mutant receptors D63N, D289A, Y293A, which do not couple to G-proteins, were capable of inducing Tyk2-dependent PAFR promoter activation. We also determined that the PAFR second intracellular loop and the C-terminus of the receptor are important for Tyk2-dependent-PAFR transcription

Involvement of the Jak/STAT pathway in platelet-activating factor receptor signaling

Platelet-activating factor (PAF) is a potent phospholipid mediator involved in a variety of pathophysiological events, such as inflammation, asthma, cardiovascular disease, reproduction, and cerebral ischemia. PAF activates multiple signaling pathways and triggers a diverse array of biological actions by interacting with a specific receptor that belongs to the G-protein coupled receptor family (GPCR). Initially we were interested in determining whether PAF could activate the Jak/STAT pathway. This signaling cascade is known to be stimulated by cytokines and growth factors, however, recent reports indicate that it is also implicated in GPCR-mediated signal transduction. We found that PAF induced rapid Jak2 and Tyk2 tyrosine phosphorylation in the monocytic cell line MonoMac-1 and in COS-7 cells transiently transfected with PAFR and Tyk2 or Jak2 cDNAs. Tyk2 activation in MonoMac-1 cells was rapid and declined to basal levels after 5 min of PAF treatment, while Jak2 phosphorylation was sustained for a longer period. In COS-7 cells, transiently expressing PAFR and Jaks, Jak2 tyrosine phosphorylation was comparable to that in MonoMac-1 cells, whereas the increase in the level of tyrosine phosphorylation of Tyk2 was lower. In MonoMac-1 cells, PAF-induced activation of kinases was followed by transient tyrosine phosphorylation of STAT1, 2, 3 and sustained phosphorylation of STAT5 and subsequent STAT1 and STAT3 translocation to the nucleus. In a reconstituted system, PAF-mediated STAT1 and STAT3 nuclear translocation required the presence of Tyk2. PAF is known to upregulate its own receptor in certain cells. To explore the role of the Jak/STAT pathway in regulation of PAFR transcription, we used a PAFR promoter 1 construct that consists of several putative STAT-binding sites. Our results showed that Tyk2 was obligatory for PAF-stimulated PAFR promoter 1 activation. To study the mechanisms of Tyk2-dependent PAFR transcription we used mutants with impaired G-protein coupling and C-terminal deletion mutants of the receptor. We also created minigene constructs encoding the intracellular loops of PAFR and investigated their ability to inhibit signaling. We found that mutant receptors D63N, D289A, Y293A, which do not couple to G-proteins, were capable of inducing Tyk2-dependent PAFR promoter activation. We also determined that the PAFR second intracellular loop and the C-terminus of the receptor are important for Tyk2-dependent-PAFR transcription