Utilização de PCR em tempo real para desenvolvimento de método qualitativo e quantitativo do vírus da hepatite B, em soro de pacientes crônicos no estado de Rondônia

Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Biologia Experimental do Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia para obtenção do título de Mestre.Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), dois bilhões de pessoas já foram infectadas pelo vírus da hepatite B (HBV) e destes 400 milhões se tornaram portadores crônicos. A quantificação deste virus é amplamente utilizada para o monitoramento do tratamento antiviral da infecção. Um sistema de quantificação da carga viral do HBV foi desenvolvido, através da metodologia de PCR em tempo real, utilizando o sistema TaqMan. Como alvo um produto de 109 pb correspondente a região pré-core foi clonado e diluido seriadamente para construção da curva padrão. O método foi validado pela comparação dos resultados de quantificação da PCR em tempo real de sete amostras, com os resultados do Centro de Genomas, onde houve uma correlação significativa (r = 0,95) entre os dois métodos. O ensaio mostrou ampla faixa dinâmica linear entre 2x10² e 2×10⁷ cópias/ml. Amostras negativas para HBV foram utilizadas como controle nas reações, indicando a alta especificidade do ensaio. Os coeficientes de variação dos ensaios intra e interexperimental foram de 1% para ambas, os quais indicaram reprodutibilidade notável. O ensaio padronizado é aplicado a todos os genótipos, porém um número maior de amostras devem ser comparadas para melhor validação do método. Esse ensaio pode ser aplicado no monitoramento de pacientes infectados pelo HBV na rotina de diagnostico dos laboratórios e na prática clínica. Além disso, o estudo possibilitou a identificação da distribuição dos genótipos do HBV em 35 amostras de pacientes HBsAg-positivos. Um fragmento de 1306bp que corresponde parcialmente aos genes de superfície e da polimerase foi amplificado purificado e seqüenciado. As seqüências foram alinhadas com seqüências referência obtidas no GenBank usando software Clustal X e, em seguida, editadas com software SE-AL. As análises filogenéticas foram conduzidas pela Cadeia de Markov Monte Carlo (MCMC) usando BEASTv.1.5.3. A distribuição dos subgenótipos foi A1 (37,1%), D3 (22,8%), F2a(20,0%), D4 (17,1%) e D2 (2,8%). Esses resultados representam a primeira caracterização genotípica do HBV no estado de Rondônia e são consistentes com outros estudos no Brasil, mostrando a presença de vários genótipos, refletindo a origem mista da população, envolvendo descendentes de nativos americanos, europeus e africanos

Identificação molecular de rinovírus humano em população infantil na região metropolitana de Porto Velho/RO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Experimental – PGBIOEXP – do Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia para obtenção do título de mestre. Orientadora: Dra. Deusilene Souza VieiraAs infecções respiratórias agudas (IRA) são as principais causas de infecções em crianças com menos de cinco anos. As IRA são causadas por diversos agentes etiológicos, sendo os agentes virais os principais causadores deste tipo de infecções. O Rinovírus humano (HRV) é um vírus de RNA, patógeno causador do resfriado comum capaz de desenvolver quadros infecciosos mais graves em crianças. O HRV está classificado em espécies A, B, e C que abrange 100 sorotipos diferentes. Este estudo teve por objetivo identificar o vírus HRV em população infantil atendida na região metropolitana de Porto-Velho/ Rondônia. A população de estudo consistiu em crianças de 0 a 6 anos de idade ambos sexos, que apresentaram sintomas clínicos de IRA. Foram coletadas 660 amostras biológicas de secreção nasofaringea por meio de um swab estéril conforme preconizado pelo Ministério da Saúde. Sendo selecionada para o presente estudo 304 amostras para isolamento viral a PCR qualitativa em tempo real utilizando o sistema Sybr Green. Do total de 304 amostras analisadas 26,3% (80/304) foram positivas para HRV. A presença do vírus foi detectada em todas as faixas etárias analisadas. Nas amostras positivas os sintomas mais freqüentes foram tosse, coriza, secreção pulmonar, obstrução nasal, síbilos, dispneia e febre apresentando frequencias superiores a 60%. O vírus HRV foi detectado durante todo o ano. Dentre os casos de coinfecções: 5 foram HRV + Adenovírus, 14 HRV + Streptococcus pneumoniae, 5 Adenovírus + Streptococcus pneumoniae e 1 caso de Adenovírus + Streptococcus pneumoniae + HRV. O HRV tem sido detectado em diversos estudos voltados para identificação etiológica em infecções respiratórias. Por meio deste trabalho foi possível afirmar a presença do mesmo na região norte do Brasil. Os dados obtidos enfatizam a importância da identificação da HRV, já que o conhecimento do agente causador deste tipo de infecção pode ajudar o prognóstico, favorecendo a prática correta terapêutica, evitando a prescrição desnecessária de antibióticos

Análise molecular do vírus da hepatite Delta: desenvolvimento de transcrição reversaPCR em tempo real e nested PCR-RFLP para quantificação e genotipagem viral

Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Biologia Experimental – PGBIOEXP – do Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia para obtenção do título de mestre.O vírus da hepatite Delta (HDV) é um patógeno que causa um infecção grave e rapidamente progressiva nos pacientes portadores. A determinação da quantidade e do genótipo do vírus circulante no sangue de pacientes com a infecção pelo HDV é importante para o diagnóstico, monitoramento do tratamento e para oferecer suporte para estudos de acompanhamento da replicação viral no curso da doença. Neste estudo desenvolvemos in house um ensaio capaz de detectar e quantificar o vírus da hepatite Delta através de amostras de soro baseando-se em uma Transcrição reversa–PCR em tempo real quantitativa (HDV RT-qPCR) e uma nested PCR-RFLP para a genotipagem do HDV. Para a determinação da carga viral foram produzidos dois calibradores padrão, um cDNA HDV clonado em plasmídeo e um transcrito de RNA HDV. Para a validação este ensaio foram utilizadas 140 amostras clínicas de soro, sendo 100 amostras clínicas de pacientes anti-HDV e antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) reagentes por ELISA, 30 amostras clínicas de doadores de sangue, 5 amostras clínicas monoinfectadas pelo vírus da hepatite B (HBV) e 5 amostras monoinfectadas pelo vírus da hepatite C (HCV). Para genotipagem foi estabelecida uma nested PCR-RFLP, utilizando Xho l e a Sma l para digerir os amplicons, os resultados corroboraram com as análises por sequenciamento. O desempenho do ensaio HDV RTqPCR foi melhor quando utilizado o calibrador padrão HDV baseado em cDNA clonado em plasmídeo linear com uma eficiência de 99,8% e linearidade de R2 0,97 e uma especificidade de 100% nos ensaios in vitro. Este estudo representa o primeiro ensaio HDV RT-qPCR desenvolvido com amostras clínicas do Brasil e oferece um grande potencial para novos estudos de eficácia clínica da terapêutica antiviral para utilização em pacientes com hepatite Delta na região ocidental da Amazônia

O estado de flow na alta performance de líderes organizacionais / The flow state in high performance of organizational leaders

O objeto de estudo desta pesquisa foi discutir sobre o estado Flow em líderes, um estado mental no qual a pessoa está totalmente imersa na execução de uma atividade, sendo caraterizado por um sentimento de absoluto envolvimento na realização de qualquer tarefa. Todo líder para desenvolver um bom trabalho deve estar motivado, principalmente quando surgem estímulos internos que propiciam o desenvolvimento de comportamentos e atitudes que levam o líder a executar seu trabalho com esmero e eficiência. A partir de uma leitura inicial levantou-se como problema desta investigação entender de qual forma o estado flow contribui para o desenvolvimento de líderes. Para responder a essa questão, esta pesquisa teve como objetivo primário discutir sobre o estado flow para o desenvolvimento de competências e a elevação da alta performance em pessoas que exercem cargos de liderança nas organizações, utilizando-se de um procedimento bibliográfico e abordagem qualitativa. A levantamento dos dados da pesquisa ocorreu nas plataformas periódicos.Capes (CAPES) e Scielo (Scientific Eletronic Library Online). Nos resultados observou-se que para manter e alcançar o estado do flow, o líder deve organizar suas ações para manter-se intrinsecamente motivado, bem como traçar metas e resultados para as atividades que lhe favorecem. Verificou-se ainda que a capacidade de executar atividades satisfatórias para si estimula sentimentos de auto realização a qualquer outra atividade de forma espontânea e feliz

Detecção de arbovírus em mosquitos (Diptera: Culicidae) capturado em três áreas florestais do Estado de Rondônia

Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Experimental/UNIR, para obtenção do título de Mestrado em Ciências Biológicas com ênfase em Virologia Orientadora: Dra. Deusilene de Souza Vieira Dall’Acqua Co-orientadora: Dra. Genimar Rebouças JuliãoArbovírus são vírus transmitidos principalmente por artrópodes. Importantes arbovírus como o vírus da dengue constantemente causam surtos, gerando milhões de casos em quase todos os países. Além do que, nas últimas décadas diversos arbovírus emergiram e/ou reemergiram em países do Novo Mundo. Vírus que antes eram restritos as regiões da África e talvez da Ásia, como o vírus Zika e o vírus chikungunya, invadiram novos continentes causando grandes transtornos na saúde pública. Atualmente aproximadamente 300 espécies de mosquitos podem transmitir arbovírus, sendo o Aedes spp e o Culex spp os principais vetores de importância médica em seres humanos. A maioria dos arbovírus é mantido circulante entre os animais silvestres e ações desenvolvidas pelo homem em áreas florestais constituem risco evidente de contaminação por arbovírus uma vez que os animais e vetores são deslocados dos seus ambientes naturais e se mantêm próximos ao homem. A identificação de mosquitos transmissores de arbovírus é essencial para o controle desses vetores, geralmente a partir das características morfológicas que distinguem as espécies de mosquitos, porém, esse método de identificação apresenta limitações, sendo de extrema importância a utilização de métodos moleculares que aperfeiçoe e facilite a correta identificação da diversidade biológica. Este trabalho teve como objetivos (i) descrever a frequência de espécies de Culicinae capturadas em três áreas florestais do estado de Rondônia; (ii) testar a região 5’ do gene COI como marcador molecular para identificação de morfotipos do gênero Culex; e identificar e caracterizar molecularmente arbovírus em mosquitos. A captura dos mosquitos foi realizada nas áreas florestais de Santo Antônio, São Vicente e Flona do Jamari, utilizando armadilhas CDC e BG. A identificação por DNA Barcode de morfotipos de Culex foi através do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase 1 (COI). Mosquitos selecionados da subfamília Culicinae foram processados para detecção de flavivírus, vírus chikungunya, vírus Mayaro e vírus Oropouche por PCR convencional. Dos espécimes de mosquitos analisados para detecção de arbovírus, os gêneros mais predominantes foram Culex (43,46%), Coquillettidia (20,85%), Aedeomyia (19,8%), Mansonia (9,4%) e Aedes (1,9 %). Dez sequências foram obtidas do gene COI a partir de morfotipos do gênero Culex. A análise molecular das sequências do gene COI permitiu a identificação das espécies Culex bastagarius e Culex idottus entre os exemplares de morfotipos de Culex. Em dois exemplares não foi possível identificar a espécie, provavelmente devido à ausência de sequência do gene COI conhecida ou depositada no GenBank. Observou-se que o marcador do gene COI provavelmente não é eficaz na diferenciação de espécies do complexo Coronator de Culex. Do total de 3.837 espécimes de Culicinae analisados nenhum foi positivo para arbovírus. Potenciais vetores de arbovírus foram analisados no presente estudo. A identificação de morfotipos do gênero Culex através da região 5’ do gene COI mostrou ser marcador eficaz, sendo necessários mais estudos para depósito no banco de dados das sequências do COI das diferentes espécies deste gênero. Arbovírus de extrema importância médica foram pesquisados em Culicinae nesse estudo, porém, é comum em estudos com mosquitos, encontrar baixas taxas de infecção, assim como amostra sem nenhum indivíduo infectado, pois, alguns fatores como a baixa carga viral, o período de não epizootia durante a captura, assim como a quantidade de espécimes analisadas, podem ter influenciado na ausência de detecção de mosquitos infectados por arbovírus

Características dos genótipos e subgenótipos do vírus da hepatite b em portadores crônicos do estado de Rondônia

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Experimental – PGBIOEXP – do Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia para a obtenção do título de mestre. Orientador: Dr. Juan Miguel VillalobosSalcedo Co-orientadora: Dra. Deusilene Souza Vieira DallA’cquaA infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é um problema de saúde global, com prevalência de 400 milhões de pessoas afetadas e pelo menos 1 milhão de mortes por ano. O HBV é um vírus hepatotrópico pertencente à família Hepadnaviridae e gênero Orthohepadnavirus.Seu genoma é composto por uma molécula de DNA circular parcialmente duplicada, com aproximadamente 3.200 pares de base e quatro regiões sobrepostas de leitura aberta. Clinicamente, o HBV pode manifestar-se em hepatite aguda ou crônica com progressão da doença principalmente para cirrose e hepatocarcinoma (HCC). O HBV possui uma ampla diversidade genética e é classificado em dez genótipos, designados de A a J, de acordo com a variabilidade das suas sequências, com distribuições geográficas distintas. Os genótipos do HBV podem influenciar nas características clínicas da doença e na resposta ao tratamento, assim como a presença de recombinantes inter ou intra-genotípicos e mutantes virais. O objetivo desse estudo é caracterizar os genótipos e subgenótipos do HBV, possíveis recombinantes e variantes virais em portadores crônicos do estado de Rondônia. Nesta proposta foram analisadas 40 amostras de soro de pacientes crônicos do HBV coletadas no ambulatório de hepatites virais do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia (CEPEM). As amostras incluídas neste estudo foram submetidas à extração de DNA e posteriormente à amplificação molecular por PCR de dois fragmentos dos genes S, P, C e X de 1.500 e 1.700 pb. Os produtos amplificados foram purificados e submetidos ao sequenciamento. A genotipagem viral foi realizada utilizando o programa MEGA 7.0 e a análise para a detecção de sequências virais recombinantes foi realizada com os programas SplitsTree4 e RDP4. A amplificação molecular foi possível de ser realizada para 17 casos. A presença do fragmento maior foi observada para 17 amostras, enquanto para o fragmento menor em 7 amostras. Um total de 12 sequências foram obtidas no sequenciamento de DNA. Foram encontrados a presença dos genótipos A, D e F na população estudada. A genotipagem das amostras mostrou uma maior frequência do genótipo A (50%; 6/12), seguido do genótipo D (33,4%; 4/12) e F (16,6%; 2/12). Dentro do genótipo A, o subgenótipo mais prevalente foi o A1 (83,4%; 5/6) e no D o D3 (50%; 2/4), enquanto para o genótipo F o único subgenótipo encontrado foi o F2. Na análise de mutações no genoma do HBV foram encontradas 10 substituições de nucleotídeos no gene C, 5 substituições de aminoácidos no gene S e 3 substituições de nucleotídeos no gene X. As alterações clínicas associadas à presença das substituições encontradas nesta análise incluem a redução ou ausência da secreção de HBeAg, progressão da hepatite B crônica para hepatocarcinoma e escape imunológico. Os dados obtidos nesse estudo refletem a diversidade genética do vírus da hepatite B, observada principalmente pela presença de variantes virais na população de Rondônia

Aspectos epidemiológicos associados ao Câncer de Mama e de Colo de Útero na região norte de 2016 a 2023

O câncer é um relevante problema de Saúde Pública, dados indicam que apesar do câncer de mama e do câncer de colo de útero serem considerados de bom prognóstico, quando diagnosticados e tratados precocemente, permanecem com altas taxas de mortalidade devido ao diagnóstico em fase avançada da doença. Assim, no Brasil a taxa de mortalidade por essas neoplasias representa 22,65%, e na Região Norte essa taxa de mortalidade representa 18,39%. Contudo, apesar de a taxa de mortalidade da Região Norte ser menor que a média nacional, observa-se uma mudança de padrão da prevalência dessas duas formas de neoplasias. Dessa forma, esse estudo visa analisar os aspectos epidemiológicos associados ao câncer de mama e colo de útero na região Norte, através de uma revisão bibliográfica utilizando dados de plataformas governamentais que disponibilizam estimativas sobre a incidência de câncer no Brasil, junto a correlação com fatores socioepidemiológicos e resultados de estudos realizados previamente. Ao analisar de forma isolada o câncer de mama e posteriormente  o câncer de colo uterino observa-se que o primeiro, no Brasil, apresenta taxa de mortalidade de 16,53% e na Região Norte essa taxa equivale a 8,33%. Já o câncer de colo uterino no Brasil apresenta taxa de mortalidade de 6,12% e na Região Norte essa taxa equivale a 10,06%. Portanto, é evidente que essa região em relação ao câncer de colo uterino ultrapassa de forma acentuada o padrão da média nacional, sendo um marcador de iniquidade em saúde. Isso deve-se ao fato desta Região possuir particularidades a respeito dessa temática, como menores índices de escolaridade, maior dificuldade de acesso ao diagnóstico e tratamento adequado, assim como áreas de difícil acesso geográfico. À vista disso, é imperioso atenuar as desigualdades persistentes no acesso aos serviços de saúde e oferecer a  reeducação nas questões relativas à saúde da mulher

Evaluation of antiviral treatment for hepatitis B with tenofovir and entecavir at the viral hepatitis outpatient clinic of the tropical medicine research center in Rondônia / Avaliação do tratamento antiviral da hepatite B com tenofovir e entecavir no ambulatório de hepatites virais do centro de pesquisa em medicina tropical de Rondônia

The emergence of treatment-resistant strains has been an obstacle in antiviral treatment of hepatitis B, which is carried out when the disease evolves to the chronic phase. In 2017, the Ministry of Health limited the therapeutic arsenal to the use of Tenofovir and Entecavir, due to their greater effectiveness and genetic barrier. However, there are no comparative studies of the antiviral activity of these two drugs in the state of Rondônia; such studies would improve the treatment of this disease. Thus, the objective of this study is to evaluate the therapeutic response of hepatitis B patients treated with Entecavir and Tenofovir at state of Rondônia. Patient data were analyzed in medical records containing information about the treatment used and the evolution of each patient’s clinical condition. The tests observed are those that detect HBV DNA to assess viral load, HBV serological markers and liver transaminases, to monitor the evolution of the disease. As a result, the samplings and correlations carried out in this study indicated that the efficacy of both Entecavir and Tenofovir was satisfactory in view of the different profiles of chronic HBV patients evaluated, since they reduced the viral load and normalized transaminases. The data obtained may help to understand the profile and therapeutic response of patients infected with the HBV virus who are treated with Tenofovir and Entecavir, as well as to disseminate pharmacoepidemiological data

Epidemiological profile of Zika, Dengue and Chikungunya virus infections identified by medical and molecular evaluations in Rondonia, Brazil

Several arboviruses have emerged and/or re-emerged in North, Central and SouthAmerican countries. Viruses from some regions of Africa and Asia, such as the Zika and Chikungunya virus have been introduced in new continents causing major public health problems. The aim of this study was to investigate the presence of RNA from Zika, Dengue and Chikungunya viruses in symptomatic patients from Rondonia, where the epidemiological profile is still little known, by one-step real-time RT-PCR. The main clinical signs and symtoms were fever (51.2%), headache (78%), chills (6.1%), pruritus (12.2%), exanthema (20.1%), arthralgia (35.3%), myalgia (26.8%) and retro-orbital pain (19.5%). Serum from 164 symptomatic patients were collected and tested for RNA of Zika, Dengue types 1 to 4 and Chikungunya viruses, in addition to antibodies against Dengue NS1 antigen. Direct microscopy for Malaria was also performed. Only ZIKV RNA was detected in 4.3% of the patients, and in the remaining 95.7% of the patients RNA for Zika, Dengue and Chikungunya viruses were not detected. This finding is intriguing as the region has been endemic for Dengue for a long time and more recently for Chikungunya virus as well. The results indicated that medical and molecular parameters obtained were suitable to describe the first report of symptomatic Zika infections in this region. Furthermore, the low rate of detection, compared to clinical signs and symptoms as the solely diagnosis criteria, suggests that molecular assays for detection of viruses or other pathogens that cause similar symptoms should be used and the corresponding diseases could be included in the compulsory notification list

Identification of some Amazonian species of Culex (Culex) and Culex (Melanoconion) by morphotyping and barcoding

Os mosquitos Culex spp. apresentam características idiossincráticas e sua baixa variabilidade dificulta sua identificação. O objetivo do nosso estudo foi analisar a região 5 'do gene da subunidade I do citocromo oxidase (coI) para a identificação taxonômica de espécies de Culex que foram previamente diagnosticadas em subgêneros Culex e Melanoconion em condições de campo. Dez sequências de espécimes foram analisadas pelo Automatic Barcode Gap Discovery (ABGD). Todas as sequências apresentaram 94-99% de identidade quando comparadas com outras sequências de espécies de Culex disponíveis no GenBank. Cinco partições iniciais suportaram 80-88 grupos de espécies. Entre eles, oito conjuntos continham os espécimes do presente estudo. Das 10 sequências de mosquitos, cinco não formaram nenhum cluster consistente, e as demais apresentaram alguma consistência no diagnóstico taxonômico nas condições de campo. Nossos resultados sugerem que algumas sequências do gene coI de espécimes podem pertencer a espécies do subgênero Melanoconion, cuja sequência 5' coI é desconhecida ou inédita no GenBank.Culex spp. mosquitoes have idiosyncratic characteristics and its low variability makes difficult their identification. The aim of our study was to analyze the 5' region of the cytochrome oxidase subunit I gene (coI) for the taxonomic identification of Culex species which were previously morphotyped and diagnosed in Culex and Melanoconion subgenera at the field conditions. Ten specimen sequences were analyzed by the Automatic Barcode Gap Discovery (ABGD). All sequences showed 94-99% identity when compared to other Culex species sequences available from GenBank. Five initial partitions supported 80-88 species groups. Among them, eight sets contained the specimens of the present study. Of the 10 mosquito sequences, five did not form any consistent cluster, and the remaining showed some consistency in the taxonomic diagnosis at the field conditions. Our results suggest that some coI gene sequences of specimens may belong to species of the subgenus Melanoconion, whose 5’ coI sequence is unknown or unpublished in GenBank