Sustainable one-pot immobilization of enzymes in/on metal-organic framework materials

peer-reviewedThe industrial use of enzymes generally necessitates their immobilization onto solid supports. The well-known high affinity of enzymes for metal-organic framework (MOF) materials, together with the great versatility of MOFs in terms of structure, composition, functionalization and synthetic approaches, has led the scientific community to develop very different strategies for the immobilization of enzymes in/on MOFs. This review focuses on one of these strategies, namely, the one-pot enzyme immobilization within sustainable MOFs, which is particularly enticing as the resultant biocomposite Enzyme@MOFs have the potential to be: (i) prepared in situ, that is, in just one step; (ii) may be synthesized under sustainable conditions: with water as the sole solvent at room temperature with moderate pHs, etc.; (iii) are able to retain high enzyme loading; (iv) have negligible protein leaching; and (v) give enzymatic activities approaching that given by the corresponding free enzymes. Moreover, this methodology seems to be near-universal, as success has been achieved with different MOFs, with different enzymes and for different applications. So far, the metal ions forming the MOF materials have been chosen according to their low price, low toxicity and, of course, their possibility for generating MOFs at room temperature in water, in order to close the cycle of economic, environmental and energy sustainability in the synthesis, application and disposal life cycle

Mesoporous silicas with tunable morphology for the immobilization of laccase

Siliceous ordered mesoporous materials (OMM) are gaining interest as supports for enzyme immobilization due to their uniform pore size, large surface area, tunable pore network and the introduction of organic components to mesoporous structure. We used SBA-15 type silica materials, which exhibit a regular 2D hexagonal packing of cylindrical mesopores of uniform size, for non-covalent immobilization of laccase. Synthesis conditions were adjusted in order to obtain supports with different particle shape, where those with shorter channels had higher loading capacity. Despite the similar isoelectric points of silica and laccase and the close match between the size of laccase and the pore dimensions of these SBA-15 materials, immobilization was achieved with very low leaching. Surface modification of macro-/mesoporous amorphous silica by grafting of amine moieties was proved to significantly increase the isoelectric point of this support and improve the immobilization yield. © 2014 by the authors.The authors thank the Spanish Government for financial support through the project MAT 2012-31127, and Ramiro Martinez (Novozymes, Spain) for his kind help with the supply of laccase. V. G. acknowledges Ministerio de Educación, Cultura y Deporte for a FPU PhD fellowship. We acknowledge support by the CSIC Open Access Publication Initiative through its Unit of Information Resources for Research (URICI)Peer Reviewe

Evaluation of on-line solid-phase extraction capillary electrophoresis-mass spectrometry with a nanoliter valve for the analysis of peptide biomarkers

On-line solid-phase extraction capillary electrophoresis-mass spectrometry (SPE-CE-MS) is a powerful technique for high throughput sample clean-up and analyte preconcentration, separation, detection, and characterization. The most typical design due to its simplicity and low cost is unidirectional SPE-CE-MS. However, in this configuration, the sample volumes introduced by pressure depend on the dimensions of the separation capillary and some matrix components could be irreversibly adsorbed in its inner walls. Furthermore, in many cases, the requirements of on-line preconcentration are incompatible with the background electrolyte necessary for an efficient separation and sensitive MS detection. Here, we present SPE-CE-MS with a nanoliter valve (nvSPE-CE-MS) to overcome these drawbacks while keeping the design simple. The nvSPE-CE-MS system is operated with a single CE instrument and two capillaries for independent and orthogonal SPE preconcentration and CE separation, which are interfaced through an external and electrically isolated valve with a 20 nL sample loop. The instrumental setup is proved for the analysis of opioid and amyloid beta peptide biomarkers in standards and plasma samples. NvSPE-CE-MS allowed decreasing the limits of detection (LODs) 200 times with regard to CE-MS. Compared to unidirectional SPE-CE-MS, peak efficiencies were better and repeatabilities similar, but total analysis times longer and LODs for standards slightly higher due to the heart-cut operation and the limited volume of the valve loop. This small difference on the LODs for standards was compensated for plasma samples by the improved tolerance of nvSPE-CE-MS to complex sample matrices. In view of these results, the presented setup can be regarded as a promising versatile alternative to avoid complicated matrix samples entering the separation capillary in SPE-CE-MS

Analysis of circulating microRNAs and their post-transcriptional modifications in cancer serum by on-line solid-phase extraction-capillary electrophoresis-mass spectrometry

In this paper, an on-line solid-phase extraction capillary electrophoresis-mass spectrometry (SPE-CE-MS) method is described for the purification, preconcentration, separation, and characterization of endogenous microRNA (miRNA) and their post-transcriptional modifications in serum. First, analysis by CE-MS was optimized using a standard mixture of hsa-miR-21-5p (miR-21-5p) and hsa-let-7g-5p (let-7g-5p). For SPE-CE-MS, a commercial silicon carbide (SiC) resin was used to prepare the microcartridges. Under the optimized conditions with standards, the microcartridge lifetime (>25 analyses) and repeatability (2.8% RSD for the migration times; 4.4 and 6.4% RSD for the miR-21-5p and let-7g-5p peak areas, respectively) were good, the method was linear between 25 and 100 nmol·L-1, and the limit of detection (LOD) was around 10 nmol·L-1 (50 times lower than by CE-MS). In order to analyze human serum samples, an off-line sample pretreatment based on phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCA) extraction was necessary prior to SPE-CE-MS. The potential of the SPE-CE-MS method to screen for B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) was demonstrated by an analysis of serum samples from healthy controls and patients. MicroRNAs, specifically miR-21-5p and a 23 nucleotide long 5'-phosphorylated miRNA with 3'-uridylation (iso-miR-16-5p), were only detected in the CLL patients

Determination of acidity constants and prediction of electrophoretic separation of amyloid beta peptides

In this paper we describe a strategy to estimate by CE the acidity constants (pKa) of complex polyprotic peptides from their building peptide fragments. CE has been used for the determination of the pKas of five short polyprotic peptides that cover all the sequence of amyloid beta (Aβ) peptides 1-40 and 1-42 (Aβ fragments 1-15, 10-20, 20-29, 25-35 and 33-42). First, the electrophoretic mobility (me) was measured as a function of pH of the background electrolyte (BGE) in the pH range 2-12 (bare fused silica capillary, I=25mM and T=25ºC). Second, the mes were fitted to equations modelling the ionisable behaviour of the different fragments as a function of pH to determine their pKas. The accuracy of the pKas was demonstrated predicting the electrophoretic behaviour of the studied fragments using the classical semiempirical relationships between me and peptide charge-to-mass ratio (me vs. q/Mr1/2, classical polymer model, q=charge and Mr=relative molecular mass). Separation selectivity in a mixture of the fragments as a function of pH was evaluated, taking into account the influence of the EOF at each pH value, and a method for the simple and rapid simulation of the electropherograms at the optimum separation pH was described. Finally, the pKas of the fragments were used to estimate the pKas of the Aβ peptides 1-40 and 1-42 (tC and D 3.1, E 4.6 and Y 10.8 for acidic amino acids and tN-D 8.6, H 6.0, K 10.6 and R 12.5 for basic amino acids), which were used to predict their behaviour and simulate their electropherograms with excellent results. However, as expected due to the very small differences on q/Mr1/2 values, separation resolution of their mixtures was poor over the whole pH range. The use of poly(vinyl alcohol) (PVA) coated capillaries allowed reducing the electroosmotic flow (EOF) and a slight improvement of resolution

Estudio de las rutas moleculares implicadas en la acción de la melatonina sobre la calcio-calmodulina kinasa II de los espermatozoides

La melatonina es una hormona sintetizada principalmente en la glándula pineal que está implicada en la regulación de muchos procesos biológicos, entre los que se encuentra la reproducción estacional en algunos mamíferos. A nivel celular, la melatonina puede llevar a cabo sus efectos regulatorios a través de dos vías: bien por la unión a receptores específicos de membrana, denominados MT1 y MT2, o bien atravesando directamente la membrana plasmática. En el espermatozoide ovino se ha descrito que la melatonina modula la capacitación espermática (conjunto de cambios bioquímicos y biofísicos que necesita sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), de forma que añadida a concentraciones altas (1 M) tiene un efecto descapacitante. Dado que la enzima calcio-calmodulina proteín-kinasa II (CaMKII) también está implicada en la capacitación espermática, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la melatonina, y de un agonista y un antagonista de los receptores de la misma, sobre la capacitación espermática y sobre los niveles y la activación por modificaciones postraduccionales de la CaMKII en espermatozoides ovinos. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 C, 5 % de CO2 y 100 % humedad) en medio TALP (control), en un medio con agentes elevadores del AMPc (cocktail), en medio cocktail con melatonina a una concentración 1 M, y con un agonista (8M-PDOT) o un antagonista (4P-PDOT) de los receptores de melatonina añadidos a diferentes concentraciones (1 M y 10 nM). Tras la incubación se evaluó la motilidad, viabilidad y estado de capacitación mediante tinción con clorotetraciclina y fosforilación en residuos de tirosina evaluados por western-blot. El análisis de los cambios en los niveles de CaMKII y su isoforma CaMKIIα se realizaron mediante un inmunoensayo ELISA y la identificación y cuantificación de las modificaciones post-traduccionales en CaMKII se realizó mediante western-blot. Los resultados obtenidos mostraron que la incubación con melatonina o su agonista a una concentración 1 M aumentó el porcentaje de espermatozoides no capacitados (PEn conclusión, este trabajo sugiere que la melatonina ejercería su acción descapacitante a través de la unión a sus receptores de membrana, pero no modificaría los niveles o la activación de la enzima CaMKII por medio de modificaciones post-traduccionales, al menos mediante fosforilación.<br /

Influencia de los polimorfismos de MTNR1A en el efecto crioprotector de la melatonina en dosis seminales ovinas

La refrigeración y la congelación del semen provoca una serie de efectos perjudiciales para los espermatozoides conocidos como cold-shock, que podrían ser evitados parcialmente empleando agentes crioprotectores, entre ellos, la melatonina. Esta hormona puede llevar a cabo alguno de sus efectos uniéndose a sus receptores de membrana, MT1 y MT2. El gen del receptor de melatonina 1A (MNTR1A) presenta varios polimorfismos, pero se desconoce si podrían influir en el efecto de la melatonina durante la criopreservación de dosis seminales ovinas.Así, el objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia de los polimorfismos de MTNR1A en el efecto crioprotector de la melatonina en espermatozoides ovinos. Para ello, muestras seminales de seis moruecos adultos, previamente genotipados para el polimorfismo RsaI del gen MTNR1A (2 C/C, 2 C/T y 2 T/T), se refrigeraron y congelaron sin y con melatonina 1 mM y 1 μM. Antes y después de este proceso se evaluó la motilidad, integridad de membrana, estado de capacitación y marcadores apoptóticos de los espermatozoides.<br /

Efecto de la melatonina sobre la Ca2+/Calmodulina proteín-kinasa II de los espermatozoides ovinos

La melatonina es una hormona que se sintetiza principalmente en la glándula pineal y que regula muchos procesos fisiológicos, como la reproducción estacional. A nivel celular es capaz de aumentar los niveles de calcio intracelular en células somáticas y unirse a la proteína calmodulina. Esto inhibe la formación del complejo calcio/calmodulina, que regula la actividad de la enzima calcio/calmodulina proteín-quinasa II (CaMKII). Dado que tanto el aumento de los niveles de calcio como la actividad de CaMKII están implicados en la capacitación espermática (conjunto de cambios que debe sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina podría modular la capacitación espermática ovina a través de la enzima CaMKII. Así, los objetivos de este estudio fueron investigar el efecto de la melatonina sobre los niveles y distribución del calcio intracelular, identificar la presencia de la proteína CaMKII en el espermatozoide ovino y evaluar los cambios en la concentración de la misma en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 °C y 5% de CO2) en medio TALP (control), y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 µM). Tras la incubación se evaluó la motilidad, viabilidad, y estado de capacitación de las muestras. Los cambios en la concentración y distribución de calcio intracelular se evaluaron mediante citometría de flujo con las sondas Fluo-4 AM y Rhod-5N AM. Finalmente, la identificación y cuantificación de CaMKII se realizó mediante Western Blot en proteínas espermáticas extraídas tras la capacitación in vitro. Los resultados obtenidos indican que la melatonina a una concentración 1 µM es capaz de aumentar el porcentaje de espermatozoides vivos con altos niveles de calcio tras tres horas de incubación en condiciones capacitantes, sin afectar negativamente a la funcionalidad espermática. Además, la presencia de melatonina en el medio parece aumentar los niveles de CaMKII y de una de sus isoformas (CaMKIIα) en el espermatozoide de morueco. En conclusión, este trabajo sugiere que la melatonina podría regular el proceso de capacitación espermática aumentando los niveles de la enzima CaMKII, aunque las implicaciones que puede tener esto en su activación o actividad todavía no están esclarecidas

Dehiscencia de anastomosis colorrectal: Investigación de resultados en cirugía del cáncer de recto en la Unidad de Coloproctología del Hospital Universitario Miguel Servet

INTRODUCCIÓN: La dehiscencia de la anastomosis colorrectal continúa siendo una temida complicación en la cirugía del cáncer de recto, con una incidencia del 1-19%. Produce mayor morbimortalidad en el postoperatorio y empeora los resultados oncológicos en términos de recidiva local y supervivencia a los 5 años. El objetivo del presente estudio es aplicar el índice REAL-score a los pacientes intervenidos de cáncer de recto para predecir el riesgo de dehiscencia anastomótica (DA) preoperatoria; así como investigar los resultados clínicos en términos de morbimortalidad a 30 días.MATERIAL Y MÉTODO: Estudio descriptivo observacional retrospectivo de pacientes intervenidos de cáncer de recto en Unidad de Coloproctología (UCP) del Hospital Universitario Miguel Servet (HUMS) en 2019 que incluye: 1) estadística descriptiva, 2) análisis estadístico inferencial de variables resultado de morbimortalidad (clasificación Clavien-Dindo) y de la aplicación del índice pronóstico REAL-score mediante curvas ROC.RESULTADOS: De los 80 pacientes intervenidos de cáncer de recto, 52 precisaron anastomosis colorrectal (asociada a ileostomía temporal en el 21,2%): hombres 57%, mujeres 43%, mayores de 65 años 71,2%. Morbilidad 38,4%: grado I 7,7%, grado II 23,1%, grado IIIb 7,7%, grado V 0 (sin mortalidad a los 30 días). Dehiscencias en 4 pacientes (7,7%), 1 tipo B y 3 tipo C. Se ha observado una relación directa entre riesgo de fuga y estoma temporal asociado, con un ABC = 0,856. Punto de corte establecido 14,74%.CONCLUSIONES: REAL-score aplicado a los pacientes intervenidos de cáncer de recto con anastomosis colorrectal concuerda de forma significativa con los pacientes de alto riesgo a los que se les practicó una ileostomía temporal. Podría ayudar en la toma de decisiones frente al riesgo de dehiscencia anastomótica asociando ileostomía por debajo de un punto de corte. Los resultados clínicos en términos de morbilidad a 30 días están dentro de los estándares admitidos.<br /