Carboxymethyl cellulose-based cryogels as scaffolds for pancreatic and skeletal muscle tissue engineering

[eng] Diabetes incidence highly increased in the last years. According to IDF (International Diabetes Federation), 463 million people suffered this disease in 2019. The estimations of diabetic people highly increase in the upcoming years, rising approximately to 700 million diabetic patients in 2045 [1]. Type 2 diabetes (T2D) is the most common type of diabetes, representing 90% of diabetic patients. It occurs when the body becomes resistant to insulin. Body insulin resistance confirms that T2D is not only a pancreatic disease, as there are many other tissues involved, like liver, adipose tissue, or skeletal muscle. This last has a significant implication in glucose-insulin homeostasis as it is one of the main glucose-consuming organs in the body. Nowadays, to study how two tissues crosstalk between them, animal testing is the gold standard. However, the unmatching physiological behaviors compared to humans, the variability between different animals, ethical dilemmas, and the need to go for more personalized medicine activates the search for other suitable alternatives. At this point, Organs-on-a-chip appeared as a valid alternative. Organs-on-a-chip (OOC) are 3D bioengineered microfluidic cell culture platforms to simulate microphysological environments of an organ or its specific functions. Nowadays, to engineer the tissues for OOC applications, encapsulating cells inside hydrogels is the most common technique. Its beneficial properties include high water content, mechanical adjustability, and moldability to generate the desired architectures [2]. However, its small porosity limits nutrient and oxygen diffusion through it [3]. This problem is a significant limitation when pancreatic islets are encapsulated inside hydrogels due to their size (~100 μm of diameter). Pancreatic islets are cell aggregations composed of many different cells as insulin-secreting cells (Beta-cells) or glucagon-secreting cells (alpha-cells). Similarly, skeletal muscle tissue is generally encapsulated in small bundles. Skeletal muscle is a highly aligned and multinucleated tissue formed from the fusion of single cells, called myoblasts, into multinucleated cells, called myotubes. Cryogels have been proposed as a valid alternative to overcome these limitations. Cryogels are fabricated by crosslinking a prepolymer solution at sub-zero temperatures, so while the material crosslinks, water freezes, generating the desired micropore architecture. After thawing, cryogels are sponge-like scaffolds with microporous structure, high interconnected porosity, high diffusivity, fine-tuned properties, and desired internal pore architecture. This thesis developed two cryogel scaffolds made of gelatin and carboxymethylcellulose with different pore architectures to engineer pancreatic and skeletal muscle tissues. Here, we proved that the achieved pore architecture fits with the prerequisites to engineer each tissue. Moreover, the mechanical and physical properties of each scaffold highly resemble the 3D microenvironment of each tissue. In pancreatic tissue, we generate a random pore cryogel to aggregate beta-cells to form pseudoislets. We proved that these engineered pseudoislets are viable, functional responding correctly to the glucose and improving insulin response compared to monolayer results. In the skeletal muscle approach, we could develop a highly aligned pore architecture to prompt cell alignment and cell fusion. Moreover, we incorporate carbon nanotubes to enhance the electrical conductivity of the scaffold, so by applying electrical pulse stimulation, we could improve the early steps of the myogenic maturation.[cat] La incidència de la diabetis ha augmentat considerablement en els últims anys. Segons l’IDF (International Diabetes Federation), al 2019 hi havia 463 milions de persones que patien diabetis i les estimacions estimen un augment considerable de casos, arribant als 700 milions de persones diabètiques cap al 2045 [1]. Entre els diferents tipus de diabetis, la diabetis tipus 2, és la que té major incidència en la població, corresponent al 90% dels casos de pacients amb diabetis. Aquest tipus de diabetis, succeeix quan el cos es torna resistent a la insulina. Aquesta resistència a la insulina per part dels teixits perifèrics ens prova que la diabetis no és només una malaltia del pàncreas, sinó que hi ha altres teixits relacionats, com el fetge, el teixit adipós o el múscul esquelètic. Aquest últim té un factor molt rellevant en la homeòstasi de la insulina i la glucosa, ja que és un dels principals teixits consumidors de glucosa. La interacció, però, entre aquest dos teixits encara presenta molts interrogants. Actualment, per estudiar com dos teixits interactuen entre ells, el testeig animal és el mètode més confiable. No obstant, presenta certes limitacions, com la poca similitud en quan a l’activitat dels illots, la variabilitat fisiològica entre diferents animals, dilemes ètics o la necessitat d’encarar la recerca cap a una medicina més personalitzada. Aquesta finalitat és el que ha portat als científics a buscar alternatives a l’experimentació animal. Entre moltes, una de les més prometedores són els anomenats Òrgans-en-un-xip, plataformes 3D de cultiu cel·lular combinades amb microfluídica i biomaterials que permeten simular les funcions específiques d’un òrgan. Per tal de generar el teixit dins d’aquesta plataforma, l’encapsulació de cèl·lules dins de hidrogels és la tècnica més utilitzada, degut al seu alt contingut d’aigua, la seva adaptabilitat mecànica o la possibilitat de generar una certa estructura geomètrica [2]. No obstant, la seva petita porositat, limita la difusió homogènia d’oxigen i de nutrients dins seu [3]. Aquest problema creix quan es volen encapsular illots pancreàtics en bastides d’hidrogel, degut a la seva mida (~100 μm de diàmetre). Els illots pancreàtics són agregacions de varis tipus diferent de cèl·lules, on destaquen les cèl·lules secretores de insulina (cèl·lules beta) i les secretores de glucagó (cèl·lules alfa). Per altre costat, el teixit muscular s’encapsula en petits constructes per tal d’imitar l’estructura d’aquest. El múscul esquelètic és un teixit altament alineat, amb cèl·lules multi nucleades, anomenades miotubs, que s’obtenen a partir de la fusió de cèl·lules soles, anomenades mioblasts. Per tal de solucionar aquests problemes, els criogels han aparegut com a alternativa. Els criogels, estan fabricats a temperatures sota zero, així mentres el polímer crosslinca es formen cristalls de gel. Un cop formada la matriu, la bastida es descongela i aquests cristalls es desfaran, deixant pas a espais buits, anomenats pors. Aquests, seran els que posteriorment li donaran la l’estructura porosa, altament interconnectada, amb alta permeabilitat i amb una arquitectura de pors determinada a la nostra bestida. En aquesta tesi s’han desenvolupat dos bastides de cel·lulosa carboxymetilada diferents seguint la tècnica de la criogelificació. Cada bastida ha estat dissenyada per tenir una distribució i una arquitectura de pors diferent d’acord amb la necessitat i propietat del teixit que es vulgui generar. A més, les propietats físiques i mecàniques de les dos bastides tenen alta semblança amb les propietats físiques i mecàniques de la matriu extracel·lular de cada teixit. Per el teixit pancreàtic, s’ha generat una bastida amb un diàmetre de pors similar als illots pancreàtics, per tal que, sembrant cèl·lules beta, aquestes formin pseudoillots similars als illots fisiològics. A més, s’ha demostrat que aquests illots tenen el diàmetre i la arquitectura desitjada, són viables i capaços de respondre a diferents nivells de glucosa. A més, s’ha demostrat que aquestes cèl·lules agregades en forma de pseudoillots responen millor a la glucosa que les cèl·lules configurades en distribució dispersa. En el cas del múscul esquelètic, s’ha desenvolupat una bastida amb una arquitectura de pors altament alineada per promoure l’alineament cel·lular i la fusió cel·lular. A més, s’han pogut incorporar nanotubs de carboni per millorar les propietats elèctriques de la vestida. D’aquesta manera, aplicant pulsos elèctrics per estimular el teixit, s’han pogut millorar les etapes primerenques de la maduració miogènica

Funcionalització de titani amb biomolècules adhesives per millorar la osteointegració en implants ossis

Tot i que actualment els implants dentals de titani tenen un baix percentatge de fallada, encara hi ha diverses causes que poden provocar dificultats. Dues de les causes més rellevants i comunes són la baixa velocitat d’osteointegració i la creació de film bacterià a la superfície de l’implant. Per tal de millorar aquestes dificultats s’ha demostrat que diferents pèptids com l’RGD, són capaços de millorar l’osteointegració i altres com la hLf1-11 reduir l’adhesió bacteriana. Fins a la data, aquestes dificultats s’han tractat de forma separada. Actualment, però, hi ha diverses investigacions que estudien poder combinar aquestes dues estratègies per poder resoldre els problemes de forma simultània. Una d’aquestes estratègies és l’adhesió sobre la superfície de titani d’una plataforma dual que contingui els pèptids que realitzen la funció desitjada. En el aquest projecte es vol, mitjançant diverses caracteritzacions físiques, químiques i biològiques de la superfície del titani, demostrar la funcionalitat d’una plataforma dual amb els pèptids RGD i hLf1-11

Cellulose-based scaffolds enhance pseudoislets formation and functionality

In vitro research for the study of type 2 diabetes (T2D) is frequently limited by the availability of a functional model for islets of Langerhans. To overcome the limitations of obtaining pancreatic islets from different sources, such as animal models or human donors, immortalized cell lines as the insulin-producing INS1E β-cells have appeared as a valid alternative to model insulin-related diseases. However, immortalized cell lines are mainly used in flat surfaces or monolayer distributions, not resembling the spheroid-like architecture of the pancreatic islets. To generate islet-like structures, the use of scaffolds appeared as a valid tool to promote cell aggregations. Traditionally-used hydrogel encapsulation methods do not accomplish all the requisites for pancreatic tissue engineering, as its poor nutrient and oxygen diffusion induces cell death. Here, we use cryogelation technology to develop a more resemblance scaffold with the mechanical and physical properties needed to engineer pancreatic tissue. This study shows that carboxymethyl cellulose (CMC) cryogels prompted cells to generate β-cell clusters in comparison to gelatin-based scaffolds, that did not induce this cell organization. Moreover, the high porosity achieved with CMC cryogels allowed us to create specific range pseudoislets. Pseudoislets formed within CMC-scaffolds showed cell viability for up to 7 d and a better response to glucose over conventional monolayer cultures. Overall, our results demonstrate that CMC-scaffolds can be used to control the organization and function of insulin-producing β-cells, representing a suitable technique to generate β-cell clusters to study pancreatic islet function

Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies

Muscular dystrophies are a group of highly disabling disorders that share degenerative muscle weakness and wasting as common symptoms. To date, there is not an effective cure for these diseases. In the last years, bioengineered tissues have emerged as powerful tools for preclinical studies. In this review, we summarize the recent technological advances in skeletal muscle tissue engineering. We identify several ground-breaking techniques to fabricate in vitro bioartificial muscles. Accumulating evidence shows that scaffold-based tissue engineering provides topographical cues that enhance the viability and maturation of skeletal muscle. Functional bioartificial muscles have been developed using human myoblasts. These tissues accurately responded to electrical and biological stimulation. Moreover, advanced drug screening tools can be fabricated integrating these tissues in electrical stimulation platforms. However, more work introducing patient-derived cells and integrating these tissues in microdevices is needed to promote the clinical translation of bioengineered skeletal muscle as preclinical tools for muscular dystrophies

Composite biomaterials as long-lasting scaffolds for 3D bioprinting of highly aligned muscle tissue

New biocompatible materials have enabled the direct 3D printing of complex functional living tissues, such as skeletal and cardiac muscle. Gelatinmethacryloyl (GelMA) is a photopolymerizable hydrogel composed of natural gelatin functionalized with methacrylic anhydride. However, it is difficult to obtain a single hydrogel that meets all the desirable properties for tissue engineering. In particular, GelMA hydrogels lack versatility in their mechanical properties and lasting 3D structures. In this work, a library of composite biomaterials to obtain versatile, lasting, and mechanically tunable scaffolds are presented. Two polysaccharides, alginate and carboxymethyl cellulose chemically functionalized with methacrylic anhydride, and a synthetic material, such as poly(ethylene glycol) diacrylate are combined with GelMA to obtain photopolymerizable hydrogel blends. Physical properties of the obtained composite hydrogels are screened and optimized for the growth and development of skeletal muscle fibers from C2C12 murine cells, and compared with pristine GelMA. All these composites show high resistance to degradation maintaining the 3D structure with high fidelity over several weeks. Altogether, in this study a library of biocompatible novel and totally versatile composite biomaterials are developed and characterized, with tunable mechanical properties that give structure and support myotube formation and alignment

In Situ LSPR Sensing of Secreted Insulin in Organ-on-Chip

Organ-on-a-chip (OOC) devices offer new approaches for metabolic disease modeling and drug discovery by providing biologically relevant models of tissues and organs in vitro with a high degree of control over experimental variables for high-content screening applications. Yet, to fully exploit the potential of these platforms, there is a need to interface them with integrated non-labeled sensing modules, capable of monitoring, in situ, their biochemical response to external stimuli, such as stress or drugs. In order to meet this need, we aim here to develop an integrated technology based on coupling a localized surface plasmon resonance (LSPR) sensing module to an OOC device to monitor the insulin in situ secretion in pancreatic islets, a key physiological event that is usually perturbed in metabolic diseases such as type 2 diabetes (T2D). As a proof of concept, we developed a biomimetic islet-on-a-chip (IOC) device composed of mouse pancreatic islets hosted in a cellulose-based scaffold as a novel approach. The IOC was interfaced with a state-of-the-art on-chip LSPR sensing platform to monitor the in situ insulin secretion. The developed platform offers a powerful tool to enable the in situ response study of microtissues to external stimuli for applications such as a drug-screening platform for human models, bypassing animal testing

Funcionalització de titani amb biomolècules adhesives per millorar la osteointegració en implants ossis

Tot i que actualment els implants dentals de titani tenen un baix percentatge de fallada, encara hi ha diverses causes que poden provocar dificultats. Dues de les causes més rellevants i comunes són la baixa velocitat d’osteointegració i la creació de film bacterià a la superfície de l’implant. Per tal de millorar aquestes dificultats s’ha demostrat que diferents pèptids com l’RGD, són capaços de millorar l’osteointegració i altres com la hLf1-11 reduir l’adhesió bacteriana. Fins a la data, aquestes dificultats s’han tractat de forma separada. Actualment, però, hi ha diverses investigacions que estudien poder combinar aquestes dues estratègies per poder resoldre els problemes de forma simultània. Una d’aquestes estratègies és l’adhesió sobre la superfície de titani d’una plataforma dual que contingui els pèptids que realitzen la funció desitjada. En el aquest projecte es vol, mitjançant diverses caracteritzacions físiques, químiques i biològiques de la superfície del titani, demostrar la funcionalitat d’una plataforma dual amb els pèptids RGD i hLf1-11

Funcionalització de titani amb biomolècules adhesives per millorar la osteointegració en implants ossis

Tot i que actualment els implants dentals de titani tenen un baix percentatge de fallada, encara hi ha diverses causes que poden provocar dificultats. Dues de les causes més rellevants i comunes són la baixa velocitat d’osteointegració i la creació de film bacterià a la superfície de l’implant. Per tal de millorar aquestes dificultats s’ha demostrat que diferents pèptids com l’RGD, són capaços de millorar l’osteointegració i altres com la hLf1-11 reduir l’adhesió bacteriana. Fins a la data, aquestes dificultats s’han tractat de forma separada. Actualment, però, hi ha diverses investigacions que estudien poder combinar aquestes dues estratègies per poder resoldre els problemes de forma simultània. Una d’aquestes estratègies és l’adhesió sobre la superfície de titani d’una plataforma dual que contingui els pèptids que realitzen la funció desitjada. En el aquest projecte es vol, mitjançant diverses caracteritzacions físiques, químiques i biològiques de la superfície del titani, demostrar la funcionalitat d’una plataforma dual amb els pèptids RGD i hLf1-11

New volumetric CNT-doped gelatin–cellulose scaffolds for skeletal muscle tissue engineering

Currently, the fabrication of scaffolds for engineered skeletal muscle tissues is unable to reach the millimeter size. The main drawbacks are the poor nutrient diffusion, lack of an internal structure to align the precursor cells, and poor mechanical and electric properties. Herein, we present a combination of gelatin-carboxymethyl cellulose materials polymerised by a cryogelation process that allowed us to reach scaffold fabrication up to millimeter size and solve the main problems related to the large size muscle tissue constructs. (1) By incorporating carbon nanotubes (CNT), we can improve the electrical properties of the scaffold, thereby enhancing tissue maturation when applying an electric pulse stimulus (EPS). (2) We have fabricated an anisotropic internal three-dimensional microarchitecture with good pore distribution and highly aligned morphology to enhance the cell alignment, cell fusion and myotube formation. With this set up, we were able to generate a fully functional skeletal muscle tissue using a combination of EPS and our doped-biocomposite scaffold and obtain a mature tissue on the millimeter scale. We also characterized the pore distribution, swelling, stiffness and conductivity of the scaffold. Moreover, we proved that the cells were viable and could fuse in three-dimensional (3D) functional myotubes throughout the scaffold. In conclusion, we fabricated a biocompatible and customizable scaffold for 3D cell culture suitable for a wide range of applications such as organ-on-a-chip, drug screening, transplantation and disease modelling

Composite biomaterials as long-lasting scaffolds for 3D bioprinting of highly aligned muscle tissue

New biocompatible materials have enabled the direct 3D printing of complex functional living tissues, such as skeletal and cardiac muscle. Gelatinmethacryloyl (GelMA) is a photopolymerizable hydrogel composed of natural gelatin functionalized with methacrylic anhydride. However, it is difficult to obtain a single hydrogel that meets all the desirable properties for tissue engineering. In particular, GelMA hydrogels lack versatility in their mechanical properties and lasting 3D structures. In this work, a library of composite biomaterials to obtain versatile, lasting, and mechanically tunable scaffolds are presented. Two polysaccharides, alginate and carboxymethyl cellulose chemically functionalized with methacrylic anhydride, and a synthetic material, such as poly(ethylene glycol) diacrylate are combined with GelMA to obtain photopolymerizable hydrogel blends. Physical properties of the obtained composite hydrogels are screened and optimized for the growth and development of skeletal muscle fibers from C2C12 murine cells, and compared with pristine GelMA. All these composites show high resistance to degradation maintaining the 3D structure with high fidelity over several weeks. Altogether, in this study a library of biocompatible novel and totally versatile composite biomaterials are developed and characterized, with tunable mechanical properties that give structure and support myotube formation and alignment