Milieux urbains et exposition aux Actinobactéries pathogènes : cas particulier des bassins d’infiltration

In cities, runoff waters are collected and directed toward infiltration basins. They collect during flooding and soils or roofs leaching diverse pollutants: hydrocarbons, organic matter, heavy metals. These accumulated particles on the infiltration basins surface constitute a layer of urban sediments rich in pollutants that constitute a new ecological niche for opportunistic pathogens. Pathogenic Actinobacteria whose Nocardia cyriacigeorgica are found here. For the moment, physiopathological studies performed on this species were done only on clinical strains and don’t take into consideration environmental isolates. Main objectives of this thesis were to assess the spatial-temporal biodiversity of Actinobacteria present in the sediments of the infiltration basin with a more specific focus on Nocardia pathogenic species, and to establish phylogenetic links between strains from an urban environment and the ones arising from French patients affected by nocardiosis and so determine the hazardousness of these environmental clones. Three sampling campaigns were performed in the infiltration basin of the Lyon east area (Django-Reinhardt) during spring, summer and autumn. The actinobacterial biodiversity was described for the first time by next generation sequencing (NGS) tools with the hsp65 marker. The infraspecific diversity of the environmental isolates of N. cyriacigeorgica arising from the infiltration basin et clinical strains provided by the French Observatory of Nocardiosis was quantified by a multilocus analysis (rrs-hsp65-sodA-secA1). The virulence of the two model strains urban EML446 and clinical GUH-2 of N. cyriacigeorgica was assessed by comparative genomics on the virulence genes of the two genomes, then by animal testing on a murine model of transient immunoparalysis CLP 30 %. Results highlight the variability of the spatial-temporal diversity of the pathogenic and indigenous Actinobacteria species dominated by around 80 % of the genus Mycobacterium and Nocardia present too in the sediments of the Django-Reinhardt infiltration basin. Mercury, copper and humidity seem to favor the development of pathogenic species. The urban strain EML446, that doesn’t be part of the highly pathogenic GUH-2 phylogroup, harbors an important pathogenicity on the murine model of transient immunoparalysis at a dose of 1,0x106 CFU/mice, as well as a similar virulence genes content. To conclude, this thesis highlights the microbial risk due to the presence of the N. cyriacigeorgica pathogenic species in a polluted urban environment linked to the runoff water management. It also opens new perspectives on the N. cyriacigeorgica taxonomic reorganization and a potential split in three distinct species that could impact the virulence and antibiotic resistance, as well as the use of new tools for the fine identification of clinic or environmental isolates of Nocardia bacterial communities by hsp65 metabarcoding or by MALDI-ToF MSEn ville, les eaux pluviales sont collectées et dirigées vers des bassins d’infiltration. Elles amassent lors du ruissellement et du lessivage des sols et des toitures des polluants divers : hydrocarbures, matières organiques, métaux lourds. Ces particules accumulées à la surface des bassins d’infiltration forment une couche de sédiments urbains riches en polluants qui représentent une nouvelle niche écologique pour des bactéries pathogènes opportunistes. On retrouve des Actinobactéries pathogènes dont Nocardia cyriacigeorgica. Pour l’heure, les études réalisées sur cette espèce en terme de physiopathologie l’ont été uniquement sur des souches cliniques et ne prennent pas compte les isolats environnementaux. Les principaux objectifs de ces travaux de thèse étaient d’évaluer la biodiversité spatio-temporelle des Actinobactéries présentes dans les sédiments d’un bassin d’infiltration avec un focus sur les espèces pathogènes du genre Nocardia, mais également d’établir des liens phylogénétiques entre des souches isolées d’un environnement urbain et des souches provenant de patients français atteints de nocardiose, et ainsi déterminer la dangerosité de ces clones environnementaux. Trois campagnes d’échantillonnage ont été réalisées dans un bassin d’infiltration de l’Est lyonnais (Django-Reinhardt) au printemps, en été et en automne. La biodiversité des communautés d’Actinobactéries a été décrite pour la première fois par méthode de séquençage nouvelle génération à l’aide du marqueur hsp65. La diversité infraspécifique des isolats environnementaux de N. cyriacigeorgica provenant du bassin d’infiltration et de souches cliniques fournies par l’Observatoire Français des Nocardioses a été quantifiée par une analyse multiloci (rrs-hsp65-sodA-secA1). La virulence des deux souches modèles urbaine EML446 et clinique GUH-2 de N. cyriacigeorgica a été évaluée par génomique comparative en étudiant le contenu en gènes de virulence des deux génomes, puis par expérimentation animale sur modèle murin d’immunoparalysie transitoire CLP 30 %. Les résultats de ce travail mettent en évidence la variabilité de la diversité spatio-temporelle des espèces pathogènes et indigènes d’Actinobactéries dominées par environ 80 % de bactéries du genre Mycobacterium mais également de Nocardia dans les sédiments du bassin d’infiltration Django-Reinhardt. Le mercure, le cuivre et une forte humidité semblent favoriser le développement des espèces pathogènes. La souche urbaine EML446, n’appartenant pas au phylogroupe contenant la souche hautement pathogène GUH-2, présente tout de même un fort pouvoir pathogène sur modèle murin d’immunoparalysie transitoire à une dose de 1,0x106 UFC/souris ainsi que des contenus en gènes de virulence semblables. En conclusion, cette thèse a mis en évidence un risque microbiologique lié à la présence de l’espèce pathogène N. cyriacigeorgica dans un environnement urbain pollué en lien avec la gestion des eaux pluviales. Elle ouvre ainsi des perspectives sur la réorganisation taxonomique de N. cyriacigeorgica et une potentielle scission en trois espèces distinctes, pouvant avoir un impact en terme de virulence ou d’antibiorésistance, mais également sur l’utilisation de nouveaux outils permettant l’identification fine aussi bien clinique que dans l’environnement d’isolats ou de communautés bactériennes de Nocardia par métabarcoding à l’aide du marqueur hsp65 et par MALDI-ToF M

Urban field and exposure to pathogenic Actinobacteria : particular case of infiltration basins

En ville, les eaux pluviales sont collectées et dirigées vers des bassins d’infiltration. Elles amassent lors du ruissellement et du lessivage des sols et des toitures des polluants divers : hydrocarbures, matières organiques, métaux lourds. Ces particules accumulées à la surface des bassins d’infiltration forment une couche de sédiments urbains riches en polluants qui représentent une nouvelle niche écologique pour des bactéries pathogènes opportunistes. On retrouve des Actinobactéries pathogènes dont Nocardia cyriacigeorgica. Pour l’heure, les études réalisées sur cette espèce en terme de physiopathologie l’ont été uniquement sur des souches cliniques et ne prennent pas compte les isolats environnementaux. Les principaux objectifs de ces travaux de thèse étaient d’évaluer la biodiversité spatio-temporelle des Actinobactéries présentes dans les sédiments d’un bassin d’infiltration avec un focus sur les espèces pathogènes du genre Nocardia, mais également d’établir des liens phylogénétiques entre des souches isolées d’un environnement urbain et des souches provenant de patients français atteints de nocardiose, et ainsi déterminer la dangerosité de ces clones environnementaux. Trois campagnes d’échantillonnage ont été réalisées dans un bassin d’infiltration de l’Est lyonnais (Django-Reinhardt) au printemps, en été et en automne. La biodiversité des communautés d’Actinobactéries a été décrite pour la première fois par méthode de séquençage nouvelle génération à l’aide du marqueur hsp65. La diversité infraspécifique des isolats environnementaux de N. cyriacigeorgica provenant du bassin d’infiltration et de souches cliniques fournies par l’Observatoire Français des Nocardioses a été quantifiée par une analyse multiloci (rrs-hsp65-sodA-secA1). La virulence des deux souches modèles urbaine EML446 et clinique GUH-2 de N. cyriacigeorgica a été évaluée par génomique comparative en étudiant le contenu en gènes de virulence des deux génomes, puis par expérimentation animale sur modèle murin d’immunoparalysie transitoire CLP 30 %. Les résultats de ce travail mettent en évidence la variabilité de la diversité spatio-temporelle des espèces pathogènes et indigènes d’Actinobactéries dominées par environ 80 % de bactéries du genre Mycobacterium mais également de Nocardia dans les sédiments du bassin d’infiltration Django-Reinhardt. Le mercure, le cuivre et une forte humidité semblent favoriser le développement des espèces pathogènes. La souche urbaine EML446, n’appartenant pas au phylogroupe contenant la souche hautement pathogène GUH-2, présente tout de même un fort pouvoir pathogène sur modèle murin d’immunoparalysie transitoire à une dose de 1,0x106 UFC/souris ainsi que des contenus en gènes de virulence semblables. En conclusion, cette thèse a mis en évidence un risque microbiologique lié à la présence de l’espèce pathogène N. cyriacigeorgica dans un environnement urbain pollué en lien avec la gestion des eaux pluviales. Elle ouvre ainsi des perspectives sur la réorganisation taxonomique de N. cyriacigeorgica et une potentielle scission en trois espèces distinctes, pouvant avoir un impact en terme de virulence ou d’antibiorésistance, mais également sur l’utilisation de nouveaux outils permettant l’identification fine aussi bien clinique que dans l’environnement d’isolats ou de communautés bactériennes de Nocardia par métabarcoding à l’aide du marqueur hsp65 et par MALDI-ToF MSIn cities, runoff waters are collected and directed toward infiltration basins. They collect during flooding and soils or roofs leaching diverse pollutants: hydrocarbons, organic matter, heavy metals. These accumulated particles on the infiltration basins surface constitute a layer of urban sediments rich in pollutants that constitute a new ecological niche for opportunistic pathogens. Pathogenic Actinobacteria whose Nocardia cyriacigeorgica are found here. For the moment, physiopathological studies performed on this species were done only on clinical strains and don’t take into consideration environmental isolates. Main objectives of this thesis were to assess the spatial-temporal biodiversity of Actinobacteria present in the sediments of the infiltration basin with a more specific focus on Nocardia pathogenic species, and to establish phylogenetic links between strains from an urban environment and the ones arising from French patients affected by nocardiosis and so determine the hazardousness of these environmental clones. Three sampling campaigns were performed in the infiltration basin of the Lyon east area (Django-Reinhardt) during spring, summer and autumn. The actinobacterial biodiversity was described for the first time by next generation sequencing (NGS) tools with the hsp65 marker. The infraspecific diversity of the environmental isolates of N. cyriacigeorgica arising from the infiltration basin et clinical strains provided by the French Observatory of Nocardiosis was quantified by a multilocus analysis (rrs-hsp65-sodA-secA1). The virulence of the two model strains urban EML446 and clinical GUH-2 of N. cyriacigeorgica was assessed by comparative genomics on the virulence genes of the two genomes, then by animal testing on a murine model of transient immunoparalysis CLP 30 %. Results highlight the variability of the spatial-temporal diversity of the pathogenic and indigenous Actinobacteria species dominated by around 80 % of the genus Mycobacterium and Nocardia present too in the sediments of the Django-Reinhardt infiltration basin. Mercury, copper and humidity seem to favor the development of pathogenic species. The urban strain EML446, that doesn’t be part of the highly pathogenic GUH-2 phylogroup, harbors an important pathogenicity on the murine model of transient immunoparalysis at a dose of 1,0x106 CFU/mice, as well as a similar virulence genes content. To conclude, this thesis highlights the microbial risk due to the presence of the N. cyriacigeorgica pathogenic species in a polluted urban environment linked to the runoff water management. It also opens new perspectives on the N. cyriacigeorgica taxonomic reorganization and a potential split in three distinct species that could impact the virulence and antibiotic resistance, as well as the use of new tools for the fine identification of clinic or environmental isolates of Nocardia bacterial communities by hsp65 metabarcoding or by MALDI-ToF M

Significant transfer of bacteria from runoff to groundwater impacted by alternative stormwater management techniques

International audienceLes processus d'infiltration des eaux pluviales présentent un intérêt croissant dans les pays développés, car ils contribuent à réduire les phénomènes d'inondation et d'érosion, et permettent de préserver les réserves en eau. Cependant, le ruissellement des eaux pluviales en milieu urbain remobilise divers contaminants dont des microorganismes pouvant présenter un risque pour la santé humaine. Pour évaluer l'incidence des transferts bactériens sur la qualité des eaux souterraines, nous avons effectué une méta-analyse de banques de séquences codant l'ARN ribosomique 16S issus du système d'infiltration des eaux pluviales d'une zone industrielle (Chassieu, France). Les jeux de données analysés englobent plus de 100 échantillons, comprenant des eaux de ruissellement, des dépôts du bassin de rétention, des sols du bassin d'infiltration ainsi que des eaux et biofilms prélevés dans l'aquifère connecté. Une approche Bayésienne permettant le suivi des sources bactériennes avec ces données a révélé que les communautés bactériennes libres dans l'aquifère étaient peu ou modérément affectées par l'infiltration des eaux pluviales. En revanche, les eaux de ruissellement du bassin versant et les dépôts du bassin de rétention ont été identifiés comme les principaux contributeurs de bactéries formant des biofilms à la surface de billes d'argile incubées dans les eaux souterraines. Des genres bactériens potentiellement pathogènes ont été détectés à la fois en surface et dans l'aquifère. ABSTRACT Stormwater infiltration processes are of increasing interest in developed countries as they reduce urban floods and soil erosion, and alleviate water shortages. However, while flowing over impervious urban surfaces, stormwaters remobilize diverse contaminants and become a source of nonpoint pollution. Among urban contaminants, microbial pathogens reaching underground waters are one of the most serious threats to human health. To gain insights on the incidence of bacterial transfers on the quality of underground waters, a meta-analysis of bacterial 16S rRNA gene libraries from a model stormwater infiltration system (SIS) of an industrial area (Chassieu, France) was performed. The DNA datasets came from more than 100 samples, including watershed runoff, detention basin deposits, infiltration basin soils as well as waters and biofilms taken from the connected aquifer. A Bayesian bacterial source tracking approach using such DNA datasets revealed that free-living bacterial communities in groundwater were slightly affected by bacteria from the upper parts of the SIS and the watershed. In contrast, bacteria from runoffs and detention basin deposits were found to be the main groups developing as biofilms over clay beads exposed to groundwaters. Potentially pathogenic bacterial genera found in the surface samples were detected in the aquifer samples

Study of the spontaneous formation of organic layers on carbon and metal surfaces from diazonium salts.

International audienc

Comparison of Actinobacteria communities from human‐impacted and pristine karst caves

International audienceActinobacteria are important cave inhabitants, but knowledge of how anthropization and anthropization-related visual marks affect this community on cave walls is lacking. We compared Actinobacteria communities among four French limestone caves (Mouflon, Reille, Rouffignac, and Lascaux) ranging from pristine to anthropized, and within Lascaux Cave between marked (wall visual marks) and unmarked areas in different rooms (Sas-1, Passage, Apse, and Diaclase). In addition to the 16S rRNA gene marker, 441 bp fragments of the hsp65 gene were used and an hsp65-related taxonomic database was constructed for the identification of Actinobacteria to the species level by Illumina-MiSeq analysis. The hsp65 marker revealed higher resolution for species and higher richness (99% operational taxonomic units cutoff) versus the 16S rRNA gene; however, more taxa were identified at higher taxonomic ranks. Actinobacteria communities varied between Mouflon and Reille caves (both pristine), and Rouffignac and Lascaux (both anthropized). Rouffignac displayed high diversity of Nocardia, suggesting human inputs, and Lascaux exhibited high Mycobacterium relative abundance, whereas Gaiellales were typical in pristine caves and the Diaclase (least affected area of Lascaux Cave). Within Lascaux, Pseudonocardiaceae dominated on unmarked walls and Streptomycetaceae (especially Streptomyces mirabilis) on marked walls, indicating a possible role in mark formation. A new taxonomic database was developed. Although not all Actinobacteria species were represented, the use of the hsp65 marker enabled species-level variations of the Actinobacteria community to be documented based on the extent of anthropogenic pressure. This approach proved effective when comparing different limestone caves or specific conditions within one cave

The effects of plant nutritional strategy on soil microbial denitrification activity through rhizosphere primary metabolites

The aim of this study was to determine (i) whether plant nutritional strategy affects the composition of primary metabolites exuded into the rhizosphere and (ii) the impact of exuded metabolites on denitrification activity in soil. We answered this question by analysing primary metabolite content extracted from the root-adhering soil (RAS) and the roots of three grasses representing different nutrient management strategies: conservative (Festuca paniculata), intermediate (Bromus erectus) and exploitative (Dactylis glomerata). We also investigated the impact of primary metabolites on soil microbial denitrification enzyme activity without carbon addition, comparing for each plant RAS and bulk soils. Our data show that plant nutritional strategy impacts on primary metabolite composition of root extracts or RAS. Further we show, for the first time, that RAS-extracted primary metabolites are probably better indicators to explain plant nutrient strategy than root-extracted ones. In addition, our results show that some primary metabolites present in the RAS were well correlated with soil microbial denitrification activity with positive relationships found between denitrification and the presence of some organic acids and negative ones with the presence of xylose. We demonstrated that the analysis of primary metabolites extracted from the RAS is probably more pertinent to evaluate the impact of plant on soil microbial community functioning

Genome Sequences of Three Nocardia cyriacigeorgica Strains and One Nocardia asteroides Strain

International audienceWe report four draft genome sequences of Nocardia spp. The strains are the Nocardia cyriacigeorgica DSM 44484 pathogenic type strain; two environmental isolates, Nocardia cyriacigeorgica EML446 and EML1456; and the Nocardia asteroides ATCC 19247 nonpathogenic type strain, with estimated genome sizes of 6.3 to 6.8 Mb. The study of these isolates will provide insight into physiology, evolution, and pathogenicity of Nocardia spp

Assessment of VITEK MS IVD database V3.0 for identification of Nocardia spp. using two culture media and comparing direct smear and protein extraction procedures

We assessed the performance of the VITEK MS IVD V3.0 matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry (MALDI-ToF MS) V3.0 database for the identification of Nocardia spp. as compared with targeted DNA sequencing. A collection of 222 DNA sequence-defined Nocardia spp. strains encompassing 18 different species present or not in the database was tested. Bromocresol purple agar (BCP) and Columbia agar +5% sheep's blood (COS) culture media were used together with two different preparation steps: direct smear and a "3 attempts" procedure that covered (1) spotting of an extract, (2) new spotting of the same extract, and (3) spotting of a new extract. The direct smear protocol yielded low correct identification rates (<= 15% for both media) whereas protein extraction yielded correct identification results (\\textgreater 67% regardless of the media used.). The use of 2 additional attempts using repeat or new extracts increased correct identification rates to 87% and 91% for BCP and COS, respectively. When using the 3 attempts procedure, the best identification results, independent of media types, were obtained for N. farcinica and N. cyriacigeorgica (100%). Identification attempts 2 and 3 allowed to increase the number of correct identifications (BCP, +20%; COS, +13%). The enhancement in performance during attempts 2 and 3 was remarkable for N. abscessus (81% for both media) and low prevalence species (BCP, 70%; COS, 85%). Up to 3.4% and 2.4% of the strains belonging to species present in the database were misidentified with BCP and COS media, respectively. In 1.9% of the cases for BCP and 1.4% for COS, these misidentifications concerned a species belonging to the same phylogenetic complex. Concerning strains that are not claimed in the V3.0 database, N. puris and N. goodfellowi generated "No identification" results and 100% of the strains belonging to N. arthritidis, N.cerradoensis, and N. altamirensis yielded a misidentification within the same phylogenetic complex. Vitek MS IVD V3.0 is an accurate and useful tool for identification of Nocardia spp