Дослідження активації mTORC1 та його субстракту p70S6K, залучених при цукровому діабеті 2 типу та онкогенетичних процесах

Вступ. Новітні дослідження довели вплив патогенетичних факторів цукрового діабету на активність внутрішньоклітинних сигнальних шляхів регуляції онкогенезу іметаболізму, одним з яких є PI3K/Akt/mTORC1. Макрофаги та лімфоцити беруть участь у патогенезі діабету та раку. Надмірна активація компонентів та субстратів PI3K/Akt/mTORC1 в цих клітинах може вказувати на необхідність додаткової корекції метаболічних процесів у хворих на діабет 2 типу з точки зору профілактики онкологічних захворювань. Мета: вивчити активацію mTORC1 шляхом визначення фосфорилювання PRAS40 та p70S6K1 у лейкоцитах хворих на діабет 2-го типу та рак. Матеріали та методи.Жінки, залучені у дослідженні, були поділені на групи: контрольна група, пацієнти з діабетом 2 типу, хворі на рак та пацієнти з поєднанням раку і діабету. Вміст фосфорильованих PRAS40 (фосфо-T246) та p70S6K1 (фосфо-T389) визначали імуноферментним методом, використовуючи лабораторні набори ELISA КНО0421 таELISA 85-86053 фірми Invitrogen (США). Концентрацію білка в лізаті визначали за допомогою набору для аналізу протеїнів BCA Novagen (США). Вимірювання проводилися намікропланшетному зчитувачі (Bio-tek Instruments, США) при довжині хвилі 450 нм.Результати. Виявлений достовірно підвищений вміст фосфорильованих PRAS40 та p70S6K1 у лейкоцитах хворих на цукровий діабет 2-го типу та рак. Кількість позитивних фосфо-PRAS40 проб у хворих на діабет становила 83,3%, а у хворих на рак -66,7%. Виявлений знижений вміст фосфо-PRAS40 в лейкоцитах пацієнтів з поєднанням діабету і раку. Висновки.Підвищений вміст фосфорильованих PRAS40 та p70S6K1 доводить активацію досліджуваного сигнального шляху при цукровому діабеті 2 типу. Зниження їх активаціїпри поєднанні раку та діабету можна пояснити можливими конкуруючими ефектами білків, які впливають на регулятори цих кіназ або на них безпосередньо.ntroduction.Pathogenetic factors of diabetes may affect the activity of intracellular systems of oncogenesis andmetabolismregulation, one of which is PI3K/Akt/mTORC1. Macrophages and lymphocytes are involved in the pathogenesis of diabetes and cancer. Detection of excessive activation of PI3K/Akt/mTORC1 components and substrates in these cells may indicate the need for additional correction of metabolic processes in patients with type 2 diabetes from the point of prevention of cancer. The aim:to study the activation of mTORC1 by determining the phosphorylation of PRAS40 and p70S6K1 in the leukocytes of patients with type 2 diabetes and cancer.Materials and methods. The study included women from the following groups: control group, patients with type 2 diabetes, cancer patients, patients with both diseases. The content of phosphorylated PRAS40 (phospho-T246) and p70S6K1 (phospho-T389) was determined using laboratory kits ELISA KNO0421 and ELISA 85-86053 of Invitrogen (USA). The protein concentration in the lysate was determined using a BCA Novagen protein assay kit (USA). Measurements were performed on a microplate reader (Bio-tek Instruments, USA) at a wavelength of 450 nm. Results.Significantly increased content of phosphorylated PRAS40 and p70S6K1 inleukocytes of patients with type 2 diabetes mellitus and cancer was detected. The number of positive phospho-PRAS40 tests in patients with diabetes was 83.3%, and in cancer patients -66.7%. Was revealedthe reduced content of phospho-PRAS40 in leukocytesof patients with a combination of diabetes and cancer.Conclusions.The increased amount of phosphorylated PRAS40 and p70S6K1 proves the activation of the studied signaling pathway by diabetes mellitus type 2. Its decrease by cancer and diabetes can be explained by the possible competing effects of the proteins that affect upstream regulators of these kinases or them directly

Differential effects of low and high doses of taxol in anaplastic thyroid cancer cells: possible implication of the PIN1 prolyl isomerase

To study the molecular mechanisms of dose-dependent effects of an anticancer drug, Taxol, on the cell cycle machinery and apoptosis-related proteins in thyroid anaplastic cancer cell lines ARO and KTC-2. Materials and Methods: Western blot analysis was used for the detection of various proteins and of their phosphorylated forms. Results: Low dose of Taxol that cause apoptosis (25 nM) enhanced Rb protein phosphorylation, decreased the expression of cyclin-dependent kinase inhibitors р27KIP1 and p21WAF1, and potentiated the accumulation of phosphorylated p53 and of the prolyl isomerase Pin1. High Taxol doses (100 and 1000 nM) that cause necrosis-like cell death drastically decreased Pin1 level in both cell lines. Conclusion: Low doses of Taxol promoted G1/S transition, thus exhibiting mitogen-like effect. Drug-induced Pin1 accumulation could probably facilitate this transition and in parallel contribute to apoptosis via the p53/p73-dependent mechanism. At higher doses of Taxol, there was a dramatic decrease of Pin1 levels which may be a reason for G2/M cell cycle arrest.Цель: изучить молекулярный механизм дозозависимых эффектов противоопухолевого препарата таксола на клеточный цикл и ассоциированные с апоптозом белки в клетках линий ARO и KTC-2 анапластического рака щитовидной железы. Материалы и методы: для количественного анализа содержания различных белков и их фосфорилированных форм использовали Вестерн блоттинг. Результаты: при действии таксола в дозе 25 нмоль/л, которая вызывает апоптоз клеток ARO и KTC-2, отмечается усиление фосфорилирования белка Rb, снижение экспрессии ингибиторов циклинзависимых киназ р27KIP1 и p21WAF1, а также накопление фосфорилированного р53 и пролил-изомеразы Pin1. Высокие дозы таксола (100 и 1000 нмоль/л), вызывающие некрозоподобную гибель клеток, заметно снижают уровень Pin1 в обеих клеточных линиях. Выводы: низкие дозы таксола способствуют переходу из G1 в S-фазу клеточного цикла, что свидетельствует о митогенподобном действии препарата. Индуцированное таксолом накопление изомеразы Pin1, возможно, облегчает этот переход и параллельно участвует в апоптотических процессах через p53/p73-зависимый механизм. При более высоких дозах препарата отмечают существенное снижение уровня Pin1, что может быть одной из причин задержки клеточного цикла на стадии G2 /M

Effect of combined treatment with insulin and metformin on 5′AMPactivated protein kinase activity in lymphocytes of diabetic patients

The activity of 5′adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), controlling the energy balance of a cell, in blood cells at the combined treatment of patients with type 2 diabetes with metformin and insulin was determined by enzyme immunoassay. It has been shown that metformin increases threefold the AMPK activity in lymphocytes of patients with type 2 diabetes, compared with patients before treatment. Insulin and its analog reduced the activity of the protein kinase stimulated by metformin in the blood cells, acting as metformin antagonists. The mechanisms of drug interaction and the consequences of their antagonism are discussed.Методом імуноферментного аналізу визначали активність 5′аденозинмонофосфатактивованої протеїнкінази (AMPK), що контролює енергетичний баланс клітини, в клітинах крові при комбінованому лікуванні хворих на діабет 2-го типу метформіном і інсуліном. Показано, що метформін утричі підвищує активність AMPK у лімфоцитах хворих на діабет 2-го типу в порівнянні з пацієнтами до лікування. Інсулін і його аналог знижували стимульовану метформіном активність протеїнкінази в клітинах крові, виступаючи антагоністами метформіну. Обговорюються механізми взаємодії препаратів та наслідки їх антагонізму.Методом иммуноферментного анализа определяли активность 5′аденозинмонофосфатактивируемой протеинкиназы (АМРК), контролирующей энергетический баланс клетки, в клетках крови при комбинированном лечении больных диабетом 2-го типа метформином и инсулином. Показано, что метформин в три раза повышает активность АМРК в лимфоцитах больных диабетом 2-го типа по сравнению с пациентами до лечения. Инсулин и его аналог снижали стимулируемую метформином активность протеинкиназы в клетках крови, выступая антагонистами метформина. Обсуждаются механизмы взаимодействия препаратов и последствия их антагонизма

Effect of combined treatment with insulin, metformin, and gliclazide on the expression and activity of Akt, mTOR, and p70S6K protein kinases in lymphocytes of diabetic patients

The expression of the main effector protein kinase Akt of the PI3K signaling pathway and the activities of mTOR and p70S6K protein kinases in lymphocytes of patients with diabetes mellitus are determined at the combination treatment with insulin and hypoglycemic drugs. It is shown that the Akt expression is reduced in blood mononuclear cells of patients with diabetes of the 2nd and, to a less extent, type 1. The activities of mTOR and p70S6K are also reduced in lymphocytes of patients with type 2 diabetes. Possible mechanisms of inhibiting the expression and activity of protein kinases are discussed.Визначали експресію основної ефекторної протеїнкінази сигнального шляху PI3K Akt та активність протеїнкіназ mTOR і p70S6K в лімфоцитах хворих на цукровий діабет при комбінованому лікуванні інсуліном і цукрознижувальними препаратами. Показано, що експресія Akt знижена в мононуклеарах крові хворих на діабет 2-го і, меншою мірою, 1-го типу. Активність mTOR і p70S6K також знижена в лімфоцитах хворих на діабет 2-го типу. Обговорюються можливі механізми пригнічення експресії і активності протеїнкіназ.Определяли экспрессию основной эффекторной протеинкиназы сигнального пути PI3K Akt и активность протеинкиназ mTOR и p70S6K в лимфоцитах больных сахарным диабетом при комбинированном лечении инсулином и сахароснижающими препаратами. Показано, что экспрессия Akt снижена в мононуклеарах крови больных диабетом 2-го и, в меньшей степени, 1-го типа. Активность mTOR и p70S6K также снижена в лимфоцитах больных диабетом 2-го типа. Обсуждаются возможные механизмы подавления экспрессии и активности протеинкиназ

Association of 5’AMP-activated protein kinase activity with disease duration and HbA1c content in leukocytes in diabetic patients

Background. 5’AMP-activated protein kinase (AMPK) is an enzyme that controls the cell energy ba­lance. With energetic stress in the cell and an increase in the AMP concentration, ATP is replaced by AMP in the exchange centers, resulting in the allosteric activation of AMPK by phosphorylation of 172 threonine within alpha subunit of LKB1 complex in response to changes in cell energy or CAMKKβ, which activates intracellular Ca2+. The purpose was to study the activity of the main energy sensor of cells — AMPK in leukocytes in patients taking insulin preparations, metformin, and other hypoglycemic drugs in association with disease duration and glycated hemoglobin content. Materials and methods. The diabetic patients receiving single-drug or combined therapy with insulin and its analogues, metformin, dapagliflozin and sulfonylureas were randomized into 5 groups: the first group — with an HbA1c level close to the norm — 6.9–7.6 %; the second group — 7.6–9.0 %; the third group — > 9 %; the fourth group > 10 %; the fifth group — > 11 %. To determine the amount of phospho-AMPK (p-Thr172), ELISA kits were used. To get the calibration curve for the AMPK determination, a kidney cell culture HEK293T of the human embryonic kidney was used, which is recommended by manufacturer as a positive control. Results. It was shown that with increase of blood HbA1c, the level of AMPK activity in leukocytes gradually decreased. With increase of blood HbA1c, the level of AMPK activity in leukocytes gradually decreased. The activity of AMPK in leukocytes of patients with HbA1c > 11 % was more than 3.5-fold lower compared to the group with 6.9–7.6 % of HbA1c; AMPK activity in leukocytes in patients with disease duration of 20 years was 3-fold lower. Thus, the AMPK activity in leukocytes may be an indicator of diabetic compensation in diabetic patients. Conclusions. With increase of blood HbA1c, the level of p-AMPK in leukocytes gradually decreased. AMPK activity in leukocytes in diabetes patients with disease duration of 20 years was 3-fold lower than in patients with 10-year experience

Вплив гіпо- та гіпертермії на вміст нуклеїнових кислот у рослин з різними типами екологічних стратегій

We investigated nucleic acid content in plants with different types of ecological strategies. Special features in character of RNA content changes were shown after short time temperature stresses. After heat stress level of RNA in patient Rumex patientia × R. tianshanicus and ruderale with C-4 pathway of photosynthesis Amaranthus caudatus seedlings became lower and in ruderale Brassica campestris seedlings with C-3 pathway of photosynthesis became higher. After short time cold stress content of RNA in all analyzed plants became higher. Content of RNA in violent Festuca pratensis seedlings after temperature stresses was practically stable. Lowest balance RNA/DNA was in patient Rumex patientia × R. tianshanicus seedlings. Ruderale Amaranthus caudatus seedlings had highest balance RNA/DNA.Вивчено вміст нуклеїнових кислот у рослин з різними типами екологічних стратегій. Установлено, що в контрольних умовах найбільший вміст ДНК був у патієнта Rumex patientia × R. tianshanicus і експлерента Amaranthus caudatus. Виявлено особливості зміни вмісту РНК після нетривалої дії температурних стресів. Тепловий стрес спричинив зменшення вмісту РНК у Rumex patientia × R. tianshanicus і Amaranthus caudatus із С-4 типом фотосинтезу та зростання вмісту РНК у експлерента Brassica campestris із С-3 типом фотосинтезу. Всі досліджені рослини реагували на короткочасний холодовий стрес збільшенням вмісту РНК. Рівень РНК у проростках віолента Festuca pratensis після короткочасних температурних стресів змінювався незначно. У Rumex patientia × R. tianshanicus виявлено найменшу величину співвідношення вмісту РНК/ДНК, тоді як у Amaranthus caudatus ця величина була найбільшою

NT-proBNP blood levels in patients with type 2 diabetes mellitus with anemia and after the dapagliflozin treatment

The content of the brain natriuretic peptide (NT-proBNP) in blood plasma and the activity of 5′-adenosine monophosphate- activated protein kinase (AMPK) in lymphocytes of type 2 diabetes patients with anemia and after the treatment with dapagliflozin are determined with enzyme immunoassay. It is shown that the highest level of NTproBNP is observed in patients with severe anemia. At the treatment with dapagliflozin, the peptide level was markedly reduced, which may be explained by an increase in the activity of AMPK as a result of the exposure to a hypoglycemic drug. It is suggested that the treatment with dapagliflozin may have a positive effect on complications of type 2 diabetes associated with cardiovascular pathologies.Методом імуноферментного аналізу визначено вміст мозкового натрійуретичного пептиду (NT-proBNP) у плазмі крові та активність 5′-аденозинмонофосфатактивованої протеїнкінази (АМРК) в лімфоцитах хворих на діабет 2-го типу з анемією і при лікуванні дапагліфлозином. Показано, що найвищий рівень NT-proBNP спостерігається у хворих з важкою формою анемії. При лікуванні дапагліфлозином рівень пептиду помітно знижувався, що, можливо, пояснюється підвищенням активності AMPK у результаті дії гіпоглікемічного препарату. Зроблено припущення, що лікування дапагліфлозином може мати позитивний ефект при ускладненнях діабету 2-го типу, пов’язаних із серцево-судинними патологіями.Методом иммуноферментного анализа определяли содержание мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) в плазме крови и активность 5′-аденозинмонофосфатактивируемой протеинкиназы (АМРК) в лимфоцитах больных диабетом 2-го типа с анемией и при лечении дапаглифлозином. Показано, что наиболее высокий уровень NT-proBNP наблюдается у больных с тяжелой формой анемии. При лечении дапаглифлозином уровень пептида заметно снижался, что, возможно, объясняется повышением активности AMPK в результате воздействия гипогликемического препарата. Сделано предположение, что лечение дапаглифлозином может оказывать положительный эффект при осложнениях диабета 2-го типа, связанных с сердечно-сосудистыми патологиями

Effects of low and high concentrations of antitumour drug taxol in anaplastic thyroid cancer cells

Aim: To study the changes of cell cycle, mitochondrial membrane potential and caspase activation in response to an antitumour drug Taxol in ARO and KTC-2 cell lines of anaplastic thyroid carcinoma. Methods: Experiments were done on thyroid anaplastic cancer cell lines ARO and KTC-2 using Western blotting, flow cytometry, light and fluorescent microscopy. Results: Taxol significantly activated caspases in ARO cells starting from drug concentration of 5 nM. Maximum activation was observed at 25 nM and further increase of Taxol concentration to 100 nM resulted in a reduction of caspase activation. Concomitant to caspase activation, a loss of mitochondrial membrane potential was observed. At Taxol concentration of 100 nM, most cells lost their mitochondrial membrane potential. Low Taxol concentrations (10 nM) caused changes in the cell cycle that are typical for apoptosis without cell cycle arrest. Higher drug doses starting from 50 nM arrested cell cycle in G2/M phase. In KTC-2 cell line Taxol concentration as low as 1 nM induced apoptosis. 6–15 nM of the drug caused massive (75–83%) cell death. Upon Taxol action, the increase in the number of cells displaying manifestations of accelerated senescence was insignificant. Conclusion: Taxol induces bona fide apoptosis in thyroid cancer cell cultures at low (1–25 nM) concentrations. Higher drug doses cause the loss of mitochondrial membrane potential and possibly lead to other types of cell death. No accelerated senescence at different Taxol concentrations was observed. The significance of subG1 and G2/M cell populations at low and high doses of Taxol is discussed

Effects of Paclitaxel and combination of the drug with radiation therapy in an in vivo model of anaplastic thyroid carcinoma

Aim of this article is to study the effects of Paclitaxel (Ptx), γ-irradiation (IR) and their combination on the growth of xenografted tumors derived from undifferentiated thyroid cancer cells

Multiwavelength observations of 3C 454.3. III. Eighteen months of agile monitoring of the "crazy diamond"

We report on 18 months of multiwavelength observations of the blazar 3C 454.3 (Crazy Diamond) carried out in the period 2007 July-2009 January. In particular, we show the results of the AGILE campaigns which took place on 2008 May-June, 2008 July-August, and 2008 October-2009 January. During the 2008 May-2009 January period, the source average flux was highly variable, with a clear fading trend toward the end of the period, from an average γ-ray flux F E>100 MeV ≳ 200 × 10-8photonscm -2s-1 in 2008 May-June, to F E>100 MeV 80 × 10-8photonscm-2s-1 in 2008 October-2009 January. The average γ-ray spectrum between 100 MeV and 1 GeV can be fit by a simple power law, showing a moderate softening (from ΓGRID ∼ 2.0 to ΓGRID ∼ 2.2) toward the end of the observing campaign. Only 3σ upper limits can be derived in the 20-60 keV energy band with Super-AGILE, because the source was considerably off-axis during the whole time period. In 2007 July-August and 2008 May-June, 3C 454.3 was monitored by Rossi X-ray Timing Explorer (RXTE). The RXTE/Proportional Counter Array (PCA) light curve in the 3-20 keV energy band shows variability correlated with the γ-ray one. The RXTE/PCA average flux during the two time periods is F 3-20 keV = 8.4 × 10-11ergcm-2s -1, and F 3-20 keV = 4.5 × 10 -11ergcm-2s-1, respectively, while the spectrum (a power law with photon index ΓPCA = 1.65 0.02) does not show any significant variability. Consistent results are obtained with the analysis of the RXTE/High-Energy X-Ray Timing Experiment quasi-simultaneous data. We also carried out simultaneous Swift observations during all AGILE campaigns. Swift/XRT detected 3C 454.3 with an observed flux in the 2-10 keV energy band in the range (0.9-7.5) × 10-11ergcm-2s-1 and a photon index in the range ΓXRT = 1.33-2.04. In the 15-150 keV energy band, when detected, the source has an average flux of about 5mCrab. GASP-WEBT monitored 3C 454.3 during the whole 2007-2008 period in the radio, millimeter, near-IR, and optical bands. The observations show an extremely variable behavior at all frequencies, with flux peaks almost simultaneous with those at higher energies. A correlation analysis between the optical and the γ-ray fluxes shows that the γ-optical correlation occurs with a time lag of τ = -0.4+0.6-0.8 days, consistent with previous findings for this source. An analysis of 15 GHz and 43 GHz VLBI core radio flux observations in the period 2007 July-2009 February shows an increasing trend of the core radio flux, anti-correlated with the higher frequency data, allowing us to derive the value of the source magnetic field. Finally, the modeling of the broadband spectral energy distributions for the still unpublished data, and the behavior of the long-term light curves in different energy bands, allow us to compare the jet properties during different emission states, and to study the geometrical properties of the jet on a time-span longer than one year. © 2010. The American Astronomical Society. All rights reserved