Biosensor para el diagnóstico y seguimiento de inmunodeficiencias

La infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) y el Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) afecta a millones de personas en todo el mundo, y constituye una amenaza a la salud y la vida de muchas otras más, sobre todo en países en vías de desarrollo. Existe un gran interés en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el diagnóstico de dicha enfermedad de forma rápida, económica y fuera del ámbito del laboratorio por personal no especializado. Los biosensores son dispositivos ideales para cubrir esta demanda analítica facilitando la toma de decisiones y permitiendo un uso racional de técnicas analíticas confirmatorias más costosas. Se plantea el diseño de una estrategia magneto-ELISA con detección óptica así como un dispositivo magneto biosensor electroquímico para el diagnóstico de SIDA a través del recuento de células marcadoras de la enfermedad presentes en la sangre. Ambas estrategias se basan en la captura inmunomagnética de linfocitos T CD4+ con partículas magnéticas modificadas con anticuerpos monoclonales específicos (anti-CD3). La detección de las células capturadas se realiza con un anticuerpo primario anti-CD4 marcado con biotina (antiCD4-biotina) y con un conjugado de estreptavidina y de la enzima HRP (peroxidasa de rábano picante). La unión de esta enzima al anticuerpo primario se realiza a través del complejo biotina/estreptavidina. Se proponen dos tipos de sistemas de detección: óptico y electroquímico. Esto se logra mediante la elección adecuada del sustrato para cada sistema planteado. El dispositivo biosensor basados en un transductor electroquímico renovable y magnético acoplado a partículas magnéticas específicas para las células marcadoras de la enfermedad, consigue la simplificación metodológica y facilita la transferencia de la tecnología hacia la fabricación de un biokit diagnóstico en el ámbito clínico. La potencial aplicación de los dispositivos analíticos propuestos en este trabajo tienen un interés social elevado por su idoneidad para realizar análisis, rápidos, económicos y en el ámbito de la propia consulta médica

Diseño y fabricación de micro/nanochips para identificación y actuación en células vivas

Este estudio abarca el diseño, desarrollo tecnológico y fabricación, mediante la utilización de tecnologías de Micro y Nanosistemas, de herramientas en el orden de las micras y los nanómetros. Estos dispositivos serán utilizados en el estudio, identificación e interactuación con células vivas, ya que sus pequeñas dimensiones los hacen idóneos para su aplicación en el campo de la Biología Celular. Estas micro y nanoherramientas pueden usarse para el estudio, identificación o actuación de células vivas desde el exterior. Pero también pueden ser microinyectadas, lipofectadas o fagocitadas por parte de la misma célula, y de esta manera hacer estudios o actuar de forma intracelular

Uso de TiO2 dopado con nitrógeno para la generación de hidrógeno bajo irradiación con luz visible

Se desarrollaron catalizadores de TiO2 dopados con nitrógeno para conseguir actividad fotocatalítica bajo irradiación visible. En este trabajo se reporta la síntesis de TiO2-N, usando urea y nitrato de amonio (NH4NO3) como precursores de nitrógeno, tanto a partir de un TiO2 generado in situ (método sol-gel) como mediante la modificación de un TiO2 comercial. Así mismo, se varió la concentración de urea para encontrar el valor óptimo de nitrógeno, lo cual se comprobó mediante la oxidación fotocatalítica de ácido oxálico bajo irradiación con luz visible. Los materiales sintetizados se caracterizaron por medio de análisis elemental, y por reflectancia difusa UV-visible, encontrándose nitrógeno en todas las muestras, y un valor del ancho de banda prohibida en el rango 2-2,8 eV. Lamentablemente, se detectó una pérdida de nitrógeno cuando los fotocatalizadores eran reutilizados, lo cual causó una disminución de su actividad después de cada reacción, ya sea en presencia de oxígeno, o en ausencia de éste mientras se generaba hidrógeno. Entre los dopantes investigados el NH4NO3 mostro una mejor eficiencia en la producción de hidrógeno. Además, los resultados experimentales revelaron claramente que la deposición de platino en la superficie de los catalizadores TiO2-N desempeña un papel fundamental en el aumento de la generación de hidrógeno. Sin embargo, esta mejora dependía claramente del método de preparación de las muestras, obteniéndose mejores resultados con el TiO2-p25

Robust microbial construction and efficient processes for recombinant enzymes production in Escherichia coli

Encara que els gens de resistència a antibiòtics són una eina important per a la selecció i manteniment de plàsmids recombinants, les autoritats reguladores consideren el seu ús inacceptable en diverses àrees dins la indústria biotecnològica, sobretot quan el producte serà utilitzat amb finalitat terapèutica. Un sistema d'expressió basat en el vector pQE (Quiagen) amb un marcador de selecció plasmídic alternatiu (basat en l'auxotròfia de glicina) va ser desenvolupat prèviament (Vidal et al., 2008). El sistema d'expressió pQE es basa en el promotor T5, induïble per IPTG. La no-­- estabilitat del promotor en absència d'inductor pot provocar una inestabilitat estructural del vector, que portarà a nivells baixos d'expressió deguts, per exemple, a fenòmens de recombinació a la regió del promotor T5. El repressor lac, codificat pel gen lacI, s'uneix molt fortament al promotor, interferint en la transcripció del gen d'interès. Així doncs, els nivells transcripcionals del gen lacI tenen un paper crític en els sistemes d'expressió basats en el promotor T5, influenciant els nivells basals de transcripció i la concentració d'inductor. Encara que la sobreexpressió de la proteïna d'interès és un factor important en quant a càrrega metabòlica, també cal tenir en compte la contribució deguda a l'expressió d'altres gens plasmídics. En aquest sentit, per tal de millorar la robustesa del sistema i minimitzar la càrrega metabòlica relacionada amb els gens codificats als plàsmids, s'han eliminat tots els gens de resistència a antibiòtics i s'han afinat els nivells d'expressió del marcador auxotròfic (glyA) i del repressor lac (lacI). En aquest treball s'han construït uns cassettes d'expressió on els gens lacI i glyA estan sota el control d'un seguit de promotors constituents sintètics, per tal d'obtenir suficient inhibidor lacI per evitar la "no-­-estabilitat del promotor" i assegurar el nivell mínim de transcripció de glyA necessaris tant per al manteniment del plàsmid com per al correcte creixement del cultiu en medi definit. A més, el gen de resistència a antibiòtic en el vector d'expressió va ser reemplaçat per la construcció glyA-­-lacI, obtenint un sistema totalment lliure de gens per a la resistència a antibiòtic. Finalment, s'ha estudiat la capacitat per a la sobreexpressió de FucA recombinant a diferents escales (flascons agitats i bioreactor) i en diversos modes d'operació (discontinu i discontinu alimentat) per tal d'obtenir alts nivells d'expressió. Per últim, per tal d'analitzar la població bacteriana a nivell de cèl·∙lules individuals, els canvis morfològics (FSC i SSC) i les característiques físiques i bioquímiques de les diferents cèl·∙lules dins la població bacteriana, s'han realitzat anàlisis de citometria de fluxWhile antibiotic resistance marker genes are a powerful system for selection and maintenance of recombinant plasmids in hosts such as E. coli, its use has been considered unacceptable in many areas of biotechnology by regulatory authorities, particularly when the recombinant product will be used in the therapeutic field. Previously, we have developed an expression system based on the pQE vector series (Qiagen) with an alternative plasmid selection marker based on glycine auxotrophy complementation (Vidal et al., 2008). The pQE expression system is based on the IPTG-­-induced T5 promoter. Promoter leakiness in inducer absence may lead to structural instability of the expression vector, resulting in reduced expression levels, e.g. due to recombination events in the T5 promoter region. The lac repressor, encoded by the lacI gene, binds very tightly to the promoter, interfering with the transcription of the gene of interest. Therefore, lacI transcriptional level plays a key role in T5 promoter-­-based expression systems, influencing the basal transcriptional levels and the concentration of inducer. Furthermore, although the overexpression of the plasmid-­-encoded protein of interest is a major factor in the metabolic burden, expression of other plasmid-­-genes may also contribute. Thus, in order to improve the system robustness, all the antibiotic resistance genes have been removed and the expression levels of the auxotrophic marker (glyA) and the lac repressor (lacI) genes have been fine-­-tuned, in order to minimize the metabolic burden related to plasmid-­-encoded genes. In this study, an expression cassette has been constructed where the lacI and glyA genes have been placed under the control of selected synthetic constitutive promoters in order to obtain the sufficient lacI inhibitor ensuring lack of "promoter leakiness" and the minimal glyA transcriptional levels needed for plasmid maintenance and optimal cell growth in defined media. Moreover, in the expression vector the antibiotic resistance gene was replaced by the lacI-­-glyA cassette, thus yielding a completely antibiotic resistance gene free system. Finally, in order to obtain high expression levels of the protein of interest, the capacity for recombinant FucA overexpression has been investigated at different scales (shake flasks and bioreactors) and operation modes, batch and fed-­-batch. Lastly, flow cytometry analyses were performed in order to analyze the bacterial populations at the single-­-cell level: changes in morphology (FSC and SSC) and physical and biochemical characteristics of individual cells within a bacterial population

Electrochemically promoted carbon-halide bond cleavage in 4-nitrobenzyl halides

This manuscript reports the study of the carbon-halide bond cleavage in 4-nitrobenzyl halides, taking special attention to the iodide and fluoride derivatives. The electrochemical reduction mechanism has been disclosed for both compounds by terms of cyclic voltammetry and controlled potential electrolysis. In the case of 4-nitrobenzyl iodide, a first one electron irreversible wave leads to the corresponding 4-nitrobenzyl radical and iodide. However, in the case of 4-nitrobenzyl fluoride, a first one-electron reversible wave appears at -1.02 vs. SCE followed by one electron irreversible wave. In this second electron transfer process, the cleavage of the C-F bond is taking place, so the bond cleavage reaction occurs at the dianion level. To disclose and understand the electrochemical reduction mechanisms that allows to obtain important thermodynamic and kinetic data that would help in the understanding of C-X bond cleavage. This type of bond dissociation reactions are involved in the metabolism pathways of the human body

Desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el control de procesos y productos industriales : aplicación de la espectroscopia NIR y la espectrometría de movilidad iónica (IMS) /

La industria en general, y particularmente la química y la farmacéutica, necesita mejorar la eficiencia de los procesos de producción, para asegurar la obtención de productos con una elevada calidad y a la vez reducir consumos, lo que redundará en una mejora de la productividad. Esta demanda precisa del desarrollo de metodologías analíticas simples, rápidas, fiables y de bajo coste, que puedan ser utilizadas en rutina y por personal poco cualificado, que posibiliten realizar un seguimiento de todo el proceso de producción, y si es necesario aplicar las medidas correctivas necesarias, con el objeto de obtener productos de elevada calidad. Con el objetivo de proporcionar a la industria nuevas metodologías de análisis que permitan cumplir con estos objetivos, en esta tesis se han realizado diversos estudios basados en la espectroscopia NIR y la espectrometría de movilidad iónica (IMS). En el primer estudio de la tesis se ha aplicado la espectroscopia NIR para la monitorización in-line de un proceso de esterificación enzimática de glicerina con ácido esteárico en presencia de una lipasa de Candida Antarctica, mediante la inmersión de una sonda NIR en el reactor. En los diferentes procesos realizados, la reacción enzimática conduce a la formación de diestearato y monoestearato de glicerina; no se observa la formación de triestearato. Se han desarrollado modelos de calibración PLS para cada uno de los componentes, usando los espectros registrado y los valores obtenidos por cromatografía de permeación en gel; los modelos son simples y presentan una correcta capacidad predictiva. Los métodos desarrollados se han aplicado al seguimiento de otros procesos obteniendo resultados que demuestran la utilidad del NIR en la monitorización in-line de la reacción de esterificación enzimática estudiada. El siguiente estudio ha consistido en el desarrollo de un método NIR para la determinación de los componentes de una mezcla adyuvante para un herbicida que se aplica por pulverización de una suspensión. La gran semejanza de los espectros de algunos componentes ha exigido la aplicación de un diseño experimental para la preparación de muestras, que tiene por objeto asegurar la robustez del modelo de calibración. La aplicación de los modelos construidos a muestras de lotes de producción, mostró la buena capacidad predictiva de los modelos construidos y su utilidad para controlar la composición de este tipo de mezclas. En un tercer trabajo se desarrollaron bibliotecas espectrales para la identificación de formulaciones lubricantes, que presentan espectros muy similares. El método desarrollado basado en la construcción de bibliotecas en cascada o sub-bibliotecas permite asegurar la especificidad necesaria para la discriminación entre productos que la biblioteca general identifica ambiguamente. Utilizando criterios de diferenciación más estrictos la biblioteca permite la diferenciación de formulaciones lubricantes que contienen o no aditivos en un porcentaje relativamente pequeño (0.05-0.7%). En este trabajo también se construyeron modelos PLS para la determinación de composición y viscosidad de los lubricantes. En esta tesis se han desarrollado métodos analíticos utilizando la técnica IMS, por primera vez en nuestro grupo de investigación, con el objeto de complementar algunos aspectos analíticos que no se pueden resolver mediante NIR y que son asequibles a la espectrometría de Movilidad Iónica (IMS). Esta es una nueva técnica nueva que ha sido escasamente utilizada en la industria química y farmacéutica. Se han estudiado, desarrollado y validado dos nuevos métodos analíticos, para la determinación de amina residual a lo largo del proceso de fabricación de amidoaminas y fosfolípidos, y otro para la determinación de dos principios activos (en una baja concentración) de un preparado farmacéutico. En ambos casos se han estudiado la influencia de los factores instrumentales en la respuesta IMS y realizando una optimización del método de cuantificación para conseguir la mejor respuesta instrumental y sensibilidad. Se han construido modelos multivariables que permiten la determinación de las especies de interés. Los métodos desarrollados se han aplicado al control analítico de los preparados estudiados.The industry, and particularly chemistry and pharmaceuticals, needs to improve the efficiency of production processes to ensure obtaining the products in high quality while reducing consumption, what will result in improving productivity. This demand requires the development of analytical methodologies in simple, fast, reliable and low cost manner, which can be used in routine and by unskilled labor, which enable to track the entire production process, and if necessary, apply corrective actions, to obtain high quality products. In order to provide the industry these new methods of analysis to achieve these objectives, in this thesis there have been carried out several studies based on NIR spectroscopy and ion mobility spectrometry (IMS). In the first study of the thesis, NIR spectroscopy has been applied for in-line monitoring of enzymatic esterification process of glycerol with stearic acid in the presence of a lipase from Candida Antarctica, with a NIR immersion probe in the reactor. In the processes performed, the enzymatic reaction leads to the formation of glycol distearate and glycerol monostearate; not being observed the formation of tristearate. It has been developed PLS calibration models for each of the components, using the spectra recorded and the values obtained by gel permeation chromatography; the models were simple and had a correct prediction. The developed methods have been applied to monitoring processes, obtaining results that demonstrate the usefulness of NIR in-line monitoring of the enzymatic esterification reaction studied. The next study involved the development of a NIR method for determining components of a mixture adjuvant in an herbicide product, which was applied for spraying a suspension. The great similarity of the components spectra has required the implementation of an experimental design for sample preparation, which aim is to ensure robustness of the calibration model. The application of the models built to samples of production batches showed good predictive ability of the models constructed, and their utility for checking the composition of such mixtures. In a third work, spectral libraries were developed for the identification of lubricant formulations, which had very similar spectra. The developed method based on the construction of libraries or sub-cascading libraries, ensures the necessary specificity for discrimination between products that were unambiguously identified in the general library. Using more stringent criteria of differentiation, the library allows the differentiation between lubricant formulations which contain or not additives in a relatively small amount (0.05 to 0.7%). In this work, PLS models were also constructed for the determination of composition and viscosity of lubricants. In the present thesis, we have developed analytical methods using IMS technique for the first time in our research group, in order to complement some analytical issues that cannot be resolved by NIR and that are amenable to IMS. This is a new technique that has been rarely used in the chemical and pharmaceutical industries. There have been studied, developed and validated two new analytical methods for determination of residual amine during the manufacturing process of amidoamines and phospholipids, and one for the determination of two active principles ingredients (in low concentration) of a pharmaceutical preparation. In both cases, we have studied the influence of instrumental factors in the IMS response and we have performed an optimization of the quantification method to get the best instrumental response and sensitivity. Multivariate models were constructed which allowed the determination of the species of interest. The developed methods have been applied to analytical control of the preparations studied

Síntesi i estudi de la capacitat enantiodiferenciadora de nous derivats binaftalènics amb simetria C2, eix i centres estereogènics

L'estereoquímica influeix en les propietats i la reactivitat dels compostos quirals, i això pot resultar molt important quan es considera la seva activitat farmacològica, ja que ambdós enantiòmers poden tenir una activitat biològica o eficàcia diferent. És per aquest motiu que resulta tan interessant disposar de metodologies que permetin determinar la puresa enantiomèrica d'una mostra de manera senzilla i precisa. Aquesta Tesi Doctoral s'emmarca dins d'un projecte dirigit a la síntesi de nous agents de solvatació quiral (CSAs) per a la determinació de la puresa enantiomèrica mitjançant RMN. Concretament, en aquest treball s'han sintetitzat nous CSAs amb una estructura binaftalènica comuna, amb simetria C2 i eix i centres estereogènics. S'han sintetitzat dos compostos dicetònics diferentment substituïts a les posicions α-carboníliques, ambdós amb un esquelet binaftalènic comú, la 1,1'-([1,1'-binaftalen]-2,2'-diil)dietanona i la ([1,1'-binaftalen]-2,2'-diil)bis(fenilmetanona). La reducció d'aquestes dicetones ha estat estudiada tant amb agents reductors aquirals com amb mètodes de reducció enantioselectius amb l'objectiu de sintetitzar els corresponents diols tant racèmics com enantiopurs. Com a resultat d'aquests assajos s'han sintetitzat els sis estereoisòmers del corresponent dimetilalcohol i quatre del difenilalcohol. Finalment, la capacitat enantiodiferenciadora dels anteriors diols amb simetria C2 ha estat estudiada front diversos soluts de referència, aconseguint la formació dels complexos diastereoisomèrics CSA-solut en tots els casos i arribant a poder quantificar la puresa enantiomèrica en alguns dels assajos realitzats.Stereochemistry affects the properties and the reactivity of chiral compounds, and this can be very important when considering the pharmacological activity, because both enantiomers may have different biological activity or effectiveness. This is why it is so interesting to have methodologies that allow the determination of the enantiomeric purity of a sample in a simple and precise way. This Thesis is part of a project that pursues the synthesis of new chiral solvating agents (CSAs) for the determination of enantiomeric purity by NMR. Specifically, new CSAs with a common binaphthalene moiety, C2 symmetry and stereogenic axis and centers have been synthesized in this work. Two diketonic compounds differently substituted in α-position to the carbonyl both with a common binaphthalenic moiety have been synthesized, namely 1,1'-([1,1'-binaphthalene]-2,2'-diyl)diethanone and [1,1'-binaphthalene]-2,2'-diylbis(phenylmethanone). The reduction of these diketones has been studied both with achiral reducing agents and enantioselective reduction methods in order to synthesize the corresponding racemic and enantiopure diols. As a result of these assays, the six stereoisomers of the corresponding dimethylalcohol and four of the diphenylalcohol have been synthesized. Finally, enantiodiferentiation capacity of the above C2 symmetry diols has been studied with various reference solutes, obtaining the formation of diastereoisomeric complexes CSA-solute in all cases and allowing the quantification of the enantiomeric purity in some of the tests performed

Especiación química y distribución de selenio en plantas de trigo : caracterización directa mediante técnicas de sincrotrón/

El selenio (Se) es un elemento esencial debido a la gran variedad de selenoproteínas que tienen funciones de vital importancia para los seres humanos, los animales y las plantas. Al igual que otros nutrientes, la principal fuente de selenio para los seres humanos son los alimentos. Por este motivo, la utilización de alimentos ricos en selenio, especialmente en zonas con suelos pobres en este elemento, es una necesidad para la salud. Las plantas sintetizan selenoproteínas a partir del selenio que incorporan del suelo, donde se encuentra generalmente en forma inorgánica. El trigo (Triticum aestivum) y sus productos derivados son una de las fuentes de selenio más importantes. Así pues, es fundamental controlar el proceso mediante el cual se enriquecen los cultivos con selenio, especialmente los de trigo, sobre lo que versan los estudios que se presentan en esta tesis. Con el objetivo de evaluar estos procesos de biofortificación se lleva a cabo un cultivo hidropónico de trigo que se enriquece con distintas especies de selenio, concretamente, con selenito, selenato o una mezcla de ambas especies. Sobre las plantas que así se obtienen, se evalúa el efecto de la especiación del selenio suministrado al trigo (selenito, selenato o sus mezclas) a las formas que adopta el selenio en la planta así como la distribución de estas formas en la misma, para entender mejor los mecanismos de absorción y transporte del selenio y poder asesorar en la mejora de los procesos de cultivo relativos al enriquecimiento con selenio. Los principales resultados obtenidos en este estudio implican que la forma de selenio con que se enriquece el cultivo inicialmente (selenito, selenato o ambas en cultivo mixto) y la cantidad total de selenio inicial en el medio hidropónico, definen los efectos del selenio en los parámetros fisiológicos y en la acumulación de selenio, micronutrientes y macronutrientes. Otro de los estudios realizados, se ha dirigido a evaluar los posibles efectos beneficiosos de la utilización de selenio en medios de cultivo contaminados con mercurio. En este estudio, los resultados más significativos corresponden a la disminución significativa de absorción de mercurio en presencia de una concentración de selenio de 1 µM en forma de selenito, siendo esta especie potencialmente beneficiosa para las plantas de trigo. Por el contrario, el selenato da lugar a efectos fitotóxicos al incrementar notablemente la absorción de mercurio. Por otro lado, se han aplicado con éxito técnicas basadas en radiación sincrotrón para la caracterización directa de la adsorción de selenio por las plantas. Concretamente se ha aplicado la técnica XANES, para estudiar la especiación de selenio en las distintas partes del trigo enriquecido y, µ-XAS imaging, para evaluar la distribución de selenio, mercurio y otros elementos de interés nutricional de las muestras procedentes de los estudios en presencia de mercurio. Los resultados de este estudio han permitido establecer la forma de sintonizar químicamente la producción de selenoaminoácidos específicos en las plantas de trigo. Esta sintonización, objeto de una patente, nos permitiría controlar la producción de selenoproteínas en la planta de trigo lo que conllevaría superar la deficiencia de estabilidad y reproducibilidad de dichos cultivos.Selenium (Se) is an essential element due to the wide variety of selenoproteins with vital functions for humans, animals and plants. As other nutrients, the most important human source of selenium is food. For this reason, the use of foods rich in selenium, is important for health care especially in areas where soils are selenium deficient. Plants synthesize selenoproteins by the uptake of selenium from soils, where is usually found as inorganic forms. Wheat (Triticum aestivum) and its derivatives are one of the most important sources of selenium proteins. It is essential to control the process by which crops are enriched with selenium, especially concerning wheat, the cereal of concern in the present studies. In order to evaluate these processes, a biofortification hydroponic culture of wheat is performed by enrichment with inorganic species of selenium, specifically, selenite, selenate or a mixture of both species. In the related harvested plants, the effect of selenium speciation (selenite, selenate or mixtures) was evaluated by determining the selenium forms and its distribution in plants. Therefore, a better understanding of the absorption mechanisms and transport of selenium in wheat will result on most appropriate assessment concerning processes of selenium enrichment. The main results obtained in this study reveal the form of selenium present in the growth medium (either selenite, selenate or both when using mixtures) and its initial concentration to determine the selenium effects in physiological parameters and selenium, micro and macronutrients accumulation. A separate study included herein was focused to evaluate the potential benefits of selenium in mercury contaminated culture media. With reference to this study, the most highlighting results correspond to the significant decrease in mercury absorption in the presence of 1 µM selenium as selenite, being this selenium specie potentially beneficial to wheat plants. By contrast, selenate showed phytotoxic effects significantly increasing mercury absorption. On the other hand, synchrotron based techniques were successfully applied for the direct characterization of selenium absorption by plants. Specifically, XANES technique was applied to study the speciation of selenium in different parts of fortified wheat and μ-XAS imaging, to evaluate the distribution of selenium, mercury and other nutrients in samples from the experiments were mercury was present. In this way, it has been established a way to chemically tune selenoaminoacids production in wheat plants. This tuning is the subject of a patent on how to control selenoproteins production in wheat to overcome the stability deficiency and reproducibility of wheat crops

Synthesis and computational studies of nucleoside analogues as antiviral agents

Els anàlegs de nucleòsid han estat àmpliament utilitzats en les teràpies antivíriques desenvolupades en els últims trenta anys. Les deficiències terapèutiques que presenten la majoria dels medicaments en ús ha motivat la cerca de nous agents antivírics. En aquest camp, els anàlegs carbocíclics de nucleòsid han rebut especial atenció, donat que l'absència de l'enllaç N-glicosídic els confereix una major estabilitat in vivo. Una altra família de derivats d'interès ha estat la dels L-nucleòsids, ja que alguns d'ells presenten una bona activitat antivírica, una major estabilitat metabòlica i una toxicitat inferior que els seus homòlegs de configuració natural.D'altra banda, les tècniques de modelització molecular constitueixen una de les pedres angulars en el disseny i l'optimització de compostos amb activitat terapèutica. En particular, les tècniques que simulen la interacció entre una molècula orgànica i una macromolècula (docking) han demostrat ser eines de gran utilitat. En el cas dels anàlegs de nucleòsids, els quals es comercialitzen com a profàrmacs, el docking permet l'estudi del seu procés d'activació així com de la posterior interacció amb la seva diana terapèutica, la polimerasa vírica corresponent.Així doncs, la present tesi s'ha centrat en l'estudi de nous anàlegs carbocíclics de nucleòsids com a agents antivírics, des del punt de vista tant sintètic com teòric. En concret, s'ha sintetitzat una família de nous anàlegs ciclobutènics i ciclobutànics d'L-nucleòsids i se n'ha estudiat el seu mecanisme d'acció per mitjà de càlculs de docking. La informació extreta dels càlculs s'ha utilitzat posteriorment per realitzar un disseny racional de nous anàlegs.En primer lloc s'ha dut a terme la síntesi estereoselectiva de cinc nous anàlegs ciclobutènics i ciclobutànics d'L-nucleòsid, els quals presenten bases nitrogenades tant púriques com pirimidíniques, mitjançant una estratègia sintètica divergent. L'etapa clau ha consistit en la fotocicloaddició [2+2] de la (S)-5-pivaloïloximetil-2(5H)-furanona a (Z)-1,2-dicloroetilè i posterior eliminació reductiva dels cicloadductes clorats amb Zn per formar l'anell ciclobutènic. L'activitat dels anàlegs preparats ha estat avaluada enfront d'un ampli rang de virus (com per exemple el virus de l'herpes simplex, VHS). Cap dels anàlegs ha mostrat una activitat antivírica apreciable. A nivell molecular, l'activitat antivírica dels nucleòsids no només depèn de la seva capacitat d'inhibició de l'enzim víric corresponent, sinó també dels processos anabòlics d'activació que impliquen tres etapes successives per convertir el nucleòsid o anàleg en el derivat trifosforilat. Així, en segon lloc s'ha estudiat el procés d'activació i la posterior interacció amb la transcriptasa inversa del VIH d'un conjunt de nucleòsids conformacionalment restringits per un anell ciclobutànic prèviament sintetitzats al nostre grup de recerca. Aquest estudi s'ha realitzat mitjançant l'aplicació de tècniques de docking, amb l'objectiu de racionalitzar els resultats d'activitat anti-VIH prèviament obtinguts. Els càlculs duts a terme han revelat que la presència de l'anell ciclobutànic fusionat en aquests anàlegs en limita la seva correcta unió a la cadena d'ADN creixent, causant així l'absència d'activitat observada.En tercer lloc s'ha realitzat un estudi teòric equivalent a l'anterior per tal de racionalitzar la baixa activitat anti-VHS mostrada pels anàlegs ciclobutènics i ciclobutànics d'L-nucleòsid inicialment preparats. Aquest estudi ha demostrat que el procés d'activació de tres dels cinc anàlegs no està afavorit, limitant-ne així la seva activitat antivírica. En contraposició, no s'ha detectat cap limitació en la conversió dels dos anàlegs de nucleòsid restants en els seus derivats trifosforilats, de manera que la seva falta d'activitat podria estar relacionada amb la interacció amb l'ADN polimerasa del VHS.Finalment, s'ha dut a terme un disseny racional de cinc nous anàlegs ciclobutànics i ciclobutènics d'L-nucleòsid com a agents anti-VHS, en base a les dades dels estudis anteriors. Anàlogament, s'han dissenyat cinc altres anàlegs d'estructura ciclohexènica i biciclo[4.1.0]heptànica.Nucleoside analogues have been widely used in the antiviral therapies developed over the last three decades. Therapeutic deficiencies shown by the majority of the drugs currently in use have prompted the search for novel antiviral agents. In this context, carbocyclic nucleoside analogues have received extraordinary attention, since the absence of the N-glycosidic linkage in these derivatives results in an increased metabolic stability in vivo. L-nucleosides have been also broadly studied, since some of them feature good antiviral activity, higher metabolic stability and lower toxicity than their natural D-counterparts.On the other hand, molecular modelling techniques have been one of the cornerstones in the design and optimization of therapeutic compounds. In particular, molecular docking techniques, used to simulate the interaction between an organic molecule and a macromolecule, have proved to be a very useful tool. In the field of nucleoside analogues, which are commercialized as prodrugs, docking techniques may be applied to simulate both their activation process as well as their subsequent interaction with t.

Determinació d'hidrocarburs aromàtics policíclics (PAHs) en mostres de sòls per cromatografia de gasos acoblada a l'espectrometria de masses (GC/MS)

La importància dels Hidrocarburs Aromàtics Policíclics (PAHs) com a contaminants ha estat sempre en debat. Des del moment en què no compleixen els requeriments de persistència, toxicitat i transport a llargues distàncies, no es consideren contaminants orgànics persistents (POPs). En conseqüència, no es troben inclosos dins la llista dels dirty dozen de la Convenció d'Estocolm sobre POPs. A més, ja que el seu alliberament no és intencionat, algunes veus han plantejat la possibilitat d'eliminar o reduir la quantitat d'aquests compostos a l'atmosfera i que arriben també, per deposició, al sòl, sediments, aigües, etc. Tanmateix, segons el Protocol firmat pel Comitè Estats Units-Europa (UNECE), els PAHs haurien d'haver estat inclosos a aquesta llista ja que són productes químics les emissions dels quals haurien de ser minimitzades o previngudes. És per això i l'interès pel medi ambient que dins el projecte Estudi de la influència de contaminants orgànics (BTEX i PAHs) en la mobilitat de metalls pesants en sòls, al qual es vol entendre quin és el mecanisme de transport dels metalls pesants en presència d'aquests contaminants, enfocat sobretot als marges de les carreteres per la combustió de gasolines i l'exhaust dels vehicles, que es justifica aquest treball de recerca. Aquest treball de recerca es basa en la posta a punt d'un mètode d'anàlisi de PAHs mitjançant la Cromatografia de Gasos acoblada a l'Espectrometria de Masses (GC/MS). Cadascun dels mètodes seguits estan reportats a la Environmental Protection Agency dels Estats Units (US EPA), però tot i així cal fer la optimització, realitzant o no, lleus modificacions d'aquests per ajustar-nos a les nostres necessitats específiques. En aquest treball de recerca s'exposen els diferents passos a realitzar un cop feta la presa de mostra fins l'expressió final dels resultats un cop identificats i quantificats els PAHs d'interès presents en una matriu de sòl. Això comprèn la seva extracció inicial mitjançant el Soxhlet, un cleanup posterior a partir tant de l'extracció en fase sòlida (SPE) amb una fase C18 com la cromatografia en columna utilitzant gel de sílice com a adsorbent. Finalment, s'han determinat els paràmetres influents en la separació, identificació i quantificació dels PAHs amb relació a la cromatografia de gasos i la seva detecció per espectrometria de masses