Antisense protein of HTLV-2 (APH-2) associates with PML nuclear bodies: molecular determinants and functional implications

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Exclusion from the Golgi and very low levels of HTLV-2 Tax ubiquitination do not prevent IKK-gamma/NEMO relocalization and NF-κB activation

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Gem-Induced Cytoskeleton Remodeling Increases Cellular Migration of HTLV-1-Infected Cells, Formation of Infected-to-Target T-Cell Conjugates and Viral Transmission

International audienceEfficient HTLV-1 viral transmission occurs through cell-to-cell contacts. The Tax viral transcriptional activator protein facilitates this process. Using a comparative transcriptomic analysis, we recently identified a series of genes up-regulated in HTLV-1 Tax expressing T-lymphocytes. We focused our attention towards genes that are important for cytoskeleton dynamic and thus may possibly modulate cell-to-cell contacts. We first demonstrate that Gem, a member of the small GTP-binding proteins within the Ras superfamily, is expressed both at the RNA and protein levels in Tax-expressing cells and in HTLV-1-infected cell lines. Using a series of ChIP assays, we show that Tax recruits CREB and CREB Binding Protein (CBP) onto a cAMP Responsive Element (CRE) present in the gem promoter. This CRE sequence is required to drive Tax-activated gem transcription. Since Gem is involved in cytoskeleton remodeling, we investigated its role in infected cells motility. We show that Gem co-localizes with F-actin and is involved both in T-cell spontaneous cell migration as well as chemotaxis in the presence of SDF-1/CXCL12. Importantly, gem knock-down in HTLV-1-infected cells decreases cell migration and conjugate formation. Finally, we demonstrate that Gem plays an important role in cell-to-cell viral transmission

Low levels of HTLV-2 Tax conjugation to ubiquitin and SUMO do not impede Tax-mediated activation of NF-κB

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Dendritic cells promote the spread of human T-cell leukemia virus type 1 via bidirectional interactions with CD4+ T cells

Human T-cell leukemia virus type-1 (HTLV-1) propagates within and between individuals via cell-to-cell transmission, and primary infection typically occurs across juxtaposed mucosal surfaces during breastfeeding and sexual intercourse. It is therefore likely that dendritic cells (DCs) are among the first potential targets for HTLV-1. However, it remains unclear how DCs contribute to virus transmission and dissemination in the early stages of infection. We show that an HTLV-1-infected cell line (MT-2) and naturally-infected CD4+ T-cells transfer p19+ viral particles to the surface of allogeneic DCs via cell-to-cell contacts. Similarly organized cell-to-cell contacts facilitate DC-mediated transfer of HTLV-1 to autologous CD4+ T-cells. These findings shed light on the cellular structures involved in anterograde and retrograde transmission, and suggest a key role for DCs in the natural history and pathogenesis of HTLV-1 infection

Molecular and functional characterization of primate retrovirus nonstructural proteins

Le genre des Deltaretrovirus est composé des virus de la leucose bovine (BLV) et des virus T-lymphotropes de primates (PTLV-1, -2, -3 et -4) qui regroupent les virus humains T-lymphotropes (HTLV-1, -2, -3 et -4) et les virus simiens apparentés (STLV-1, -2, -3 et -4). Seules les infections par les PTLV-1 et BLV sont associées à des pathologies : une lymphoprolifération maligne appelée ATLL chez l'homme et le singe ou une maladie neurologique appelée HAM/TSP chez l'homme infectés par les PTLV-1 et une lymphoproliferation maligne chez les bovins infectés par BLV. L'infection par HTLV-2 n'est associée qu'à une lymphocytose et le pouvoir pathogène d'HTLV-3 n'est pas caractérisé à ce jour. Les lentivirus, parmi lesquels on trouve les agents étiologiques du SIDA VIH-1 et VIH-2, et les Deltaretrovirus, sont des rétrovirus complexes. Ils codent donc, en plus des protéines structurales et enzymatiques, pour des protéines régulatrices ainsi que pour des protéines auxiliaires qui seront au centre des travaux présentés. Chez HTLV-1 et BLV, les protéines auxiliaires jouent un rôle primordial dans l'infectiosité in vivo. Or ces protéines n'avaient pas encore été décrites chez les PTLV-3. Leur caractérisation composait donc le premier objectif de ces travaux de thèse. Nous avons ainsi identifié les ARN messagers codant 3 nouvelles protéines putatives in vitro. Nous avons étudié les caractéristiques de ces protéines, notamment leur rôle dans le cycle des PTLV-3 in vitro et leur expression in vivo. Dans un second travail, nous avons essayé de comprendre si les différents domaines fonctionnels déjà identifiés dans la protéine Vpx, une protéine auxiliaire de VIH-2 influençaient sa capacité à interagir avec le facteur de restriction cellulaire SAMHD-1. Nous avons voulu déterminer le compartiment cellulaire dans lequel Vpx induisait la dégradation de SAMHD-1 et la cinétique de ce phénomène, qui permet à ce virus de se répliquer dans les lignées myéloïdes. Ces travaux apportent des éléments nouveaux dans la compréhension du rôle des protéines auxiliaires sur la régulation fine du cycle rétroviral et l'échappement au système immunitaire innéDeltaretroviruses include bovine leukemia viruses (BLV) and primate Tlymphotropic viruses (PTLV-1, -2, -3 and -4) which are composed of human Tlymphotropic (HTLV-1, -2, -3 and -4) and of their simian counterparts (STLV-1, -2, -3 and -4). PTLV-1 and BLV are the only ones associated to pathologies: a lymphoproliferative disorder named ATLL in humans and non human primates and a neurological disorder named HAM/TSP in humans in the case of PTLV-1 and a Bmalignant lymphoproliferation in BLV infected cattle. HTLV-2 has not been associated with any disease so far and the pathogenic potential of HTLV-3 remains unknown. Lentiviruses, including HIV-1 and -2 the AIDS etiological agents, and Deltaretroviruses, are complex retroviruses. Therefore, in addition to structural and enzymatic proteins they encode regulatory proteins and also auxiliary proteins, the main subject of this work. HTLV-1 and BLV auxiliary proteins play key roles in viral infection in vivo. Whether the genome of PTLV-3 encodes such proteins was not determined yet. Therefore their characterization was the first goal of my PhD work. We identified in vitro messenger RNAs encoding 3 new putative proteins. Their impact on the PTLV-3 viral life cycle in vitro and their expression in vivo were then investigated. As a second part of this work, we examined the relationship existing between the Vpx HIV-2 auxiliary protein and its ability to interact with a restriction factor named SAMHD-1. Vpx induces SAMHD-1 degradation and the kinetic of such degradation allows the virus to replicate in myeloid cells. Altogether, these projects provide new insights into the understanding of the roles played by retroviral auxiliary proteins in connection with a tight regulation of viral life cycle and an escape from innate immunit

Functional analysis of the relationship between Vpx and the restriction factor SAMHD1.

International audienceSAMHD1 is a newly identified restriction factor that targets lentiviruses in myeloid cells and is countered by the SIV(SM)/HIV-2 Vpx protein. By analyzing a large panel of Vpx mutants, we identify several residues throughout the 3-helix bundle predicted for Vpx that impair both its functionality and its ability to degrade SAMHD1. We determine that SAMHD1 is a strictly non-shuttling nuclear protein and that as expected WT Vpx localizes with it in the nucleus. However, we also identify a functional Vpx mutant with predominant cytoplasmic distribution that colocalizes with SAMHD1 in this location, suggesting that Vpx may also retain SAMHD1 in the cell cytoplasm, prior to its entry into the nucleus. Several mutations in Vpx were shown to affect the stability of Vpx, as well as Vpx:Vpx interactions. However, no strict correlation was observed between these parameters and the functionality of Vpx, implying that neither properties is absolutely required for this function and indicating that even unstable Vpx mutants may be very efficient in inducing SAMHD1 degradation. Overall, our analysis identifies several Vpx residues required for SAMHD1 degradation and points to a very efficient and plastic mechanism through which Vpx depletes this restriction factor

Détection de différents rétrovirus chez des primates non-humains infectés par STLV-1 ou SFV et pathologie viro-induite

Les rétrovirus STLV-1 (Simian T Lymphotropic Virus Type 1) et SFV (Simian Foamy Virus) infectent un grand nombre d'espèces de primates non-humains de l'Ancien Monde. STLV-1 est l'équivalent simien du rétrovirus humain HTLV-1 (Human T-cell Lymphotropic Virus Type 1). Tandis que l'infection par SFV est asymptomatique, STLV-1, comme HTLV-1 est l'agent étiologique de la Leucémie/Lymphome T de l'adulte. L'ATL est une maladie de sombre pronostic avec une médiane de survie de 6 mois dans la forme aiguë. Une lymphocytose associée à une charge provirale (PVL ou nombres de copies du génome viral, intégrées dans la cellule hôte) élevée et à une prolifération monoclonale de cellules infectées constituent des marqueurs de la maladie. Les virus STLV-1 et SFV peuvent être transmis de façon zoonotique du singe à l’homme mais seuls les virus HTLV-1 ont une transmission interhumaine. Il est communément établi que l'ADN proviral de SFV peut être détecté par PCR dans les cellules du sang circulant et dans la salive, tandis que celui de STLV-1 est généralement recherché uniquement dans les cellules mononucléées du sang périphérique. La colonie du centre de primatologie de Rousset comporte des Papio papio suivis depuis plusieurs années. 45 sont infectés par STLV-1, tandis que la prévalence de SFV n'était pas établie avant cette étude. Notre travail visait (1) à étudier la potentielle transmission zoonotique des virus STLV-1 et SFV par morsure en quantifiant la présence de ces virus par PCR en temps réel (STLV-1) ou par nested-PCR (SFV et STLV-1) dans la salive et dans le sang (contrôle), (2) à développer un protocole de traitement des animaux développant un ATL. Résultats : (A) 11 animaux positifs pour SFV et STLV-1 en sérologie ont été testés par PCR en temps réel ou en nested-PCR. SFV a été détecté chez 10 animaux dans le sang et chez 8 animaux dans la salive. STLV-1 a été détecté chez 7 animaux dans les échantillons de cellules issues du sang et dans seulement 2 échantillons de salive. De façon intéressante, ces 2 échantillons provenaient d'animaux ayant une charge provirale très importante. Une seconde étude est actuellement en cours afin de déterminer si la détection de STLV-1 dans des échantillons de salive est corrélée à une PVL importante dans le sang circulant. (B) Une femelle âgée de 11 ans a développé un ATL au cours de notre étude. La NFS indiquait une lymphocytose marquée (10,9 giga/litre) avec une absence d'hypercalcémie. L'anatomo-pathologie du ganglion inguinal révéla une hémopathie maligne avec un marquage CD25 fort. Des lésions de la peau évocatrices de celles retrouvées chez les patients ATL étaient observées. Le diagnostic d'ATL lymphomateux fut posé. Un traitement expérimental associant Combivir (AZT) et viraferon (interféron-alpha) et qui est utilisé chez les patients ATL chronique ou aiguë fut proposé. Après 4 mois de traitement et en absence d'amélioration des symptômes et d'une diminution de la PVL, le singe fut euthanasié. Une PVL élevée était retrouvée dans plusieurs organes : ganglions, rate, poumon et les analyses anatomopathologiques montrent un dysmorphisme marqué des différents tissus lymphoïdes secondaires, confirmant le diagnostique lymphomateux. Les résultats de la clonalité virale dans les différents organes sont actuellement en cours d'analyse. Conclusion : le Papio papio naturellement infecté par SFV et STLV-1 constitue un excellent modèle des infections humaines par ces 2 rétrovirus. [Les auteurs déclarent une contribution égale de Jocelyn Turpin et Sandrine Alais à ce travail.

Diversity of β-retroviruses causing respiratory cancers in small ruminants

International audienceENTV (Enzootic Nasal Tumor Virus) and JSRV (Jaagsiekte Sheep Retrovirus) are β-retroviruses inducing respiratory cancers. JSRV infects sheep, ENTV-1 and ENTV-2 respectively infect sheep and goats. These viruses and the induced cancers are endemic in many countries and the disease can be observed as isolated cases or as disease outbreaks. The envelope (Env), specifically the intracytoplasmic domain of the transmembrane glycoprotein, is oncogenic, transforming cells in vitro and in vivo.We analyzed the genetic features of the sheep and goat β-retrovirus (29 JSRV and 23 ENTV-2 strains) circulating in France to identify molecular signatures linked to the severity of the disease in given flocks. We focused on the env gene, encoding the oncogenic viral envelope, and on the LTR (Long Terminal Repeat), the non-coding region of the integrated provirus controlling viral replication. As in other mammals, multiples copies of β-endogenous retroviruses resulting from ancestral infections of germinal cells during evolution, are present in the small ruminants genomes. As endogenous and exogenous retroviruses are genetically highly related (over 95 % of nt sequence similarity), a highly specific strategy had to be developed to selectively amplified the exogenous ENTV and JSRV genomes, based on limited discriminating motifs along their genomes. As an intern quality control, all the ENTV-2 and JSRV sequences displayed a YXXM motif in the cytoplasmic tail of the transmembrane protein coding sequence, described as an Akt docking motif involved in cell transformation and oncogenicity, known as a specific feature of the exogenous β-retroviruses.Based on French isolates, ENTV-2 strains were globally less diverse (0.4% nucleotide variability) than JSRV strains (4.8%). Longitudinal study in JSRV infected flock showed highly stable strains with no env and LTR variability over the course of 4 years. For 8/9 flocks studied with several samples available, the nucleotide variability of env was below 1.5% highlighting a high genomic stability of the viruses within a flock. The phylogenetic reconstruction based on the LTR and env regions are suggesting that a major strain is circulating on the French territory for ENTV-2 while not clustering with already published Spanish nor Chinese strains. On the contrary, JSRV strains circulating in French ovine flocks were distributed in 2 distinct genetic subtypes, clustering with already published sequences originated from North America, Africa and United-Kingdom. Specific motifs in the LTRs and in the intracytoplasmic domain of the envelope were spotted between the two genetic subtypes. In the U3 region of the LTR, sequences associated with JSRV cancer outbreaks showed a duplication of the CREB binding site, involved in modulating transcription, and the presence of an E2F-1 binding site, involved in modulating cell proliferation. Their impact on disease severity remains to be established. Ongoing sequencing of the entire provirus will complete the analysis by investigating the diversity of gag pro and pol genes among the different strains.This is the first report on French strains of oncogenic β-retroviruses responsible for cancers in sheep and goats. We identified genetic signatures associated with severity of disease that will be tested for the oncogenic properties in an in vitro system