Phylogenomics investigation of sparids (Teleostei: Spariformes) using high-quality proteomes highlights the importance of taxon sampling

Sparidae (Teleostei: Spariformes) are a family of fish constituted by approximately 150 species with high popularity and commercial value, such as porgies and seabreams. Although the phylogeny of this family has been investigated multiple times, its position among other teleost groups remains ambiguous. Most studies have used a single or few genes to decipher the phylogenetic relationships of sparids. Here, we conducted a thorough phylogenomic analysis using five recently available Sparidae gene-sets and 26 high-quality, genome-predicted teleost proteomes. Our analysis suggested that Tetraodontiformes (puffer fish, sunfish) are the closest relatives to sparids than all other groups used. By analytically comparing this result to our own previous contradicting finding, we show that this discordance is not due to different orthology assignment algorithms; on the contrary, we prove that it is caused by the increased taxon sampling of the present study, outlining the great importance of this aspect in phylogenomic analyses in general

The Gene Toolkit Implicated in Functional Sex in Sparidae Hermaphrodites: Inferences From Comparative Transcriptomics

Sex-biased gene expression is the mode through which sex dimorphism arises from a nearly identical genome, especially in organisms without genetic sex determination. Teleost fishes show great variations in the way the sex phenotype forms. Among them, Sparidae, that might be considered as a model family displays a remarkable diversity of reproductive modes. In this study, we sequenced and analyzed the sex-biased transcriptome in gonads and brain (the tissues with the most profound role in sexual development and reproduction) of two sparids with different reproductive modes: the gonochoristic common dentex, Dentex dentex, and the protandrous hermaphrodite gilthead seabream, Sparus aurata. Through comparative analysis with other protogynous and rudimentary protandrous sparid transcriptomes already available, we put forward common male and female-specific genes and pathways that are probably implicated in sex-maintenance in this fish family. Our results contribute to the understanding of the complex processes behind the establishment of the functional sex, especially in hermaphrodite species and set the groundwork for future experiments by providing a gene toolkit that can improve efforts to control phenotypic sex in finfish in the ever-increasingly important field of aquaculture

Muscle and liver transcriptome characterization and genetic marker discovery in the farmed meagre, Argyrosomus regius

Meagre (Argyrosomus regius), a teleost fish of the family Sciaenidae, is part of a group of marine fish species considered new for Mediterranean aquaculture representing the larger fish cultured in the region. Meagre aquaculture started ~ 25 years ago in West Mediterranean, and the supply of juveniles has been dominated by few hatcheries. This fact has raised concerns on possible inbreeding, urging the need for genetic information on the species and for an assessment of the polymorphisms found in the genome. To that end we characterized the muscle and liver transcriptome of a pool of meagre individuals, from different families and phenotypic size, to obtain a backbone that can support future studies regarding physiology, immunology and genetics of the species. The assembled transcripts were assigned to a wide range of biological processes including growth, reproduction, metabolism, development, stress and behavior. Then, to infer its genetic diversity and provide a catalogue of markers for future use, we scanned the reconstructed transcripts for polymorphic genetic markers. Our search revealed a total of 42,933 high quality SNP and 20,581 STR markers. We found a relatively low rate of polymorphism in the transcriptome that may indicate that inbreeding has taken place. This study has led to a catalogue of genetic markers at the expressed part of the genome and has set the ground for understanding growth and other traits of interest in meagre.info:eu-repo/semantics/acceptedVersio

Transcriptome analysis of flathead grey mullet (Mugil cephalus) ovarian development induced by recombinant gonadotropin hormones

Background: Treatment with recombinant gonadotropin hormones (rGths), follicle-stimulating hormone (rFsh) and luteinizing hormone (rLh), was shown to induce and complete vitellogenesis to finally obtain viable eggs and larvae in the flathead grey mullet (Mugil cephalus), a teleost arrested at early stages of gametogenesis in intensive captivity conditions. This study aimed to investigate the transcriptomic changes that occur in the ovary of females during the rGths-induced vitellogenesis. Methods: Ovarian samples were collected through biopsies from the same five females at four stages of ovarian development. RNASeq libraries were constructed for all stages studied, sequenced on an Illumina HiSeq4000, and a de novo transcriptome was constructed. Differentially expressed genes (DEGs) were identified between stages and the functional properties of DEGs were characterized by comparison with the gene ontology and Kyoto Encyclopedia. An enrichment analysis of molecular pathways was performed. Results: The de novo transcriptome comprised 287,089 transcripts after filtering. As vitellogenesis progressed, more genes were significantly upregulated than downregulated. The rFsh application induced ovarian development from previtellogenesis to early-to-mid-vitellogenesis with associated pathways enriched from upregulated DEGs related to ovarian steroidogenesis and reproductive development, cholesterol metabolism, ovarian growth and differentiation, lipid accumulation, and cell-to-cell adhesion pathways. The application of rFsh and rLh at early-to-mid-vitellogenesis induced the growth of oocytes to late-vitellogenesis and, with it, the enrichment of pathways from upregulated DEGs related to the production of energy, such as the lysosomes activity. The application of rLh at late-vitellogenesis induced the completion of vitellogenesis with the enrichment of pathways linked with the switch from vitellogenesis to oocyte maturation. Conclusion: The DEGs and enriched molecular pathways described during the induced vitellogenesis of flathead grey mullet with rGths were typical of natural oogenesis reported for other fish species. Present results add new knowledge to the rGths action to further raise the possibility of using rGths in species that present similar reproductive disorders in aquaculture, the aquarium industry as well as the conservation of endangered species.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

The sex-specific transcriptome of the hermaphrodite sparid sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo)

Background: Teleosts are characterized by a remarkable breadth of sexual mechanisms including various forms of hermaphroditism. Sparidae is a fish family exhibiting gonochorism or hermaphroditism even in closely related species. The sparid Diplodus puntazzo (sharpsnout seabream), exhibits rudimentary hermaphroditism characterized by intersexual immature gonads but single-sex mature ones. Apart from the intriguing reproductive biology, it is economically important with a continuously growing aquaculture in the Mediterranean Sea, but limited available genetic resources. Our aim was to characterize the expressed transcriptome of gonads and brains through RNA-Sequencing and explore the properties of genes that exhibit sex-biased expression profiles. Results: Through RNA-Sequencing we obtained an assembled transcriptome of 82,331 loci. The expression analysis uncovered remarkable differences between male and female gonads, while male and female brains were almost identical. Focused search for known targets of sex determination and differentiation in vertebrates built the sex-specific expression profile of sharpsnout seabream. Finally, a thorough genetic marker discovery pipeline led to the retrieval of 85,189 SNPs and 29,076 microsatellites enriching the available genetic markers for this species. Conclusions: We obtained a nearly complete source of transcriptomic sequence as well as marker information for sharpsnout seabream, laying the ground for understanding the complex process of sex differentiation of this economically valuable species. The genes involved include known candidates from other vertebrate species, suggesting a conservation of the toolkit between gonochorists and hermaphrodites

Linkage mapping, comparative genome analysis, and QTL detection for growth in a non-model teleost, the meagre Argyrosomus regius, using ddRAD sequencing

Meagre (Argyrosomus regius), is a benthopelagic species rapidly emerging in aquaculture, due to its low food to biomass conversion rate, good fillet yield and ease of production. Tracing a species genomic background along with describing the genetic basis of important traits can greatly influence both conservation strategies and production perspectives. In this study, we employed ddRAD sequencing of 266 fish from six F1 meagre families, to construct a high-density genetic map comprising 4529 polymorphic SNP markers. The QTL mapping analysis provided a genomic appreciation for the weight trait identifying a statistically significant QTL on linkage group 15 (LG15). The comparative genomics analysis with six teleost species revealed an evolutionarily conserved karyotype structure. The synteny observed, verified the already well-known fusion events of the three-spine stickleback genome, reinforced the evidence of reduced evolutionary distance of Sciaenids with the Sparidae family, reflected the evolutionary proximity with Dicentrarchus labrax, traced several putative chromosomal rearrangements and a prominent putative fusion event in meagre’s LG17. This study presents novel elements concerning the genome evolutionary history of a non-model teleost species recently adopted in aquaculture, starts to unravel the genetic basis of the species growth-related traits, and provides a high-density genetic map as a tool that can help to further establish meagre as a valuable resource for research and production.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Community Parameters and Genome-Wide RAD-Seq Loci of Ceratothoa oestroides Imply Its Transfer between Farmed European Sea Bass and Wild Farm-Aggregating Fish

Wild fish assemblages that aggregate within commercial marine aquaculture sites for feeding and shelter have been considered as a primary source of pathogenic parasites vectored to farmed fish maintained in net pens at an elevated density. In order to evaluate whether Ceratothoa oestroides (Isopoda, Cymothoidae), a generalist and pestilent isopod that is frequently found in Adriatic and Greek stocks of farmed European sea bass (Dicentrarchus labrax), transfers between wild and farmed fish, a RAD-Seq (restriction-site-associated DNA sequencing)-mediated genetic screening approach was employed. The double-digest RAD-Seq of 310 C. oestroides specimens collected from farmed European sea bass (138) and different wild farm-aggregating fish (172) identified 313 robust SNPs that evidenced a close genetic relatedness between the “wild” and “farmed” genotypes. ddRAD-Seq proved to be an effective method for detecting the discrete genetic structuring of C. oestroides and genotype intermixing between two populations. The parasite prevalence in the farmed sea bass was 1.02%, with a mean intensity of 2.0 and mean abundance of 0.02, while in the wild fish, the prevalence was 8.1%; the mean intensity, 1.81; and the mean abundance, 0.15. Such differences are likely a consequence of human interventions during the farmed fish’s rearing cycle that, nevertheless, did not affect the transfer of C. oestroides

Λειτουργικό φύλο, γονιδιακά δίκτυα και μεταγραφωματικές διαφορές αρσενικών και θηλυκών σε πέντε είδη της οικογένειας Sparidae (Τελεόστεοι ιχθύες)

The differences between sexes and the concept of sex determination have always fascinated, yet troubled philosophers and scientists. Among the animals that reproduce sexually, teleost fishes show a very wide repertoire of reproductive modes. Except for the gonochoristic species, fish are the only vertebrates in which hermaphroditism appears naturally. Hermaphroditism refers to the capability of an organism to reproduce both as male and female in its life cycle and there are various forms of it. In sequential hermaphroditism, an individual begins as female first and then can change sex to become male (protogyny), or vice versa (protandry). The diverse sex-phenotypes of fish are regulated by a variety of sex determination mechanisms, along a continuum of environmental and heritable factors. The vast majority of sexually dimorphic traits result from the differential expression of genes that are present in both sexes. To date, studies regarding the sex-specific differences in gene expression have been conducted mainly in sex determination systems of model fish species that are well characterized at the genomic level, with distinguishable heteromorphic sex chromosomes, exhibiting genetic sex determination and gonochorism. Among teleosts, the Sparidae family is considered to be one of the most diversified families regarding its reproductive systems, and thus is a unique model for comparative studies to understand the molecular mechanisms underlying different sexual motifs. In this study, using RNA sequencing, we studied the transcriptome from gonads and brains of both sexes in five sparid species, representatives of four different reproductive styles. Specifically, we explored the sex-specific expression patterns of a gonochoristic species: the common dentex Dentex dentex, two protogynous hermaphrodites: the red porgy Pagrus pagrus and the common pandora Pagellus erythrinus, the rudimentary hermaphrodite sharpsnout seabream Diplodus puntazzo, and the protandrous gilthead seabream Sparus aurata. We found minor sex-related expression differences indicating a more homogeneous and sexually plastic brain, whereas there was a plethora of sex biased gene expression in the gonads. The functional divergence of the two gonadal types is reflected in their transcriptomic profiles, in terms of the number of genes differentially expressed, as well as the expression magnitude (i.e. fold-change differences). The observation of almost double the number of up-regulated genes in males compared to females indicates a male-biased expression tendency. Focusing on the pathways and genes implicated in sex determination/differentiation, we aimed to unveil the molecular pathways through which these non-model fish species develop a masculine or a feminine character. We observed the implicated pathways and major gene families (e.g. Wnt/b-catenin pathway and Retinoic-acid signaling pathway, Notch, TGFβ) behind sex-biased expression and the recruitment of known sex-related genes either to male or female type of gonads in these fish. (e.g Dmrt1, Sox9, Sox3, Cyp19a, Filgla, Ctnnb1, Gsdf9, Stra6 etc.). We also carefully investigated the presence of genes reported to be involved in sex determination/differentiation mechanisms in other vertebrates and fish and compared their expression patterns in the species under study. The expression profiling exposed known candidate molecular-players/genes establishing the common female (Cyp19a1, Sox3, Figla, Gdf9, Cyp26a, Ctnnb1, Dnmt1, Stra6) and male identity (Dmrt1, Sox9, Dnmt3aa, Rarb, Raraa, Hdac8, Tdrd7) of the gonad in these sparids. Additionally, we focused on those contributing to a species-specific manner either to female (Wnt4a, Dmrt2a, Foxl2 etc.) or to male (Amh, Dmrt3a, Cyp11b etc.) characters, and discussed the expression patterns of factors that belong to important pathways and/or gene families in the SD context, in our species gonadal transcriptomes. Taken together, most of the studied genes form part of the cascade of sex determination, differentiation, and reproduction across teleosts. In this study, we focused on genes that are active when sex is established (sex-maintainers), revealing the basic “gene-toolkit” & gene-networks underlying functional sex in these five sparids. Comparing related species with alternative reproductive styles, we saw different combinations of genes with conserved sex-linked roles and some “handy” molecular players, in a “partially- conserved” or “modulated” network formulating the male and female phenotype. The knowledge obtained in this study and tools developed during the process have set the groundwork for future experiments that can improve the sex control of this species and help the in-deep understanding the complex process of sex differentiation in the more flexible multi-component systems as these studied here.Οι διαφορές ανάμεσα στα δύο φύλα και ο καθορισμός του φύλου ανέκαθεν γοήτευαν και την ίδια στιγμή προβλημάτιζαν φιλοσόφους και επιστήμονες. Ο τρόπος με τον οποίο ορίζονται τα δύο φύλα είναι από την παρουσία και το μέγεθος ορισμένων εξειδικευμένων απλοειδών κυττάρων που ονομάζονται γαμέτες. Η αναπαραγωγή με σεξουαλικό τρόπο απαιτεί τουλάχιστον ένα άτομο με μεγάλο γαμέτη (θηλυκό) και ένα άτομο με μικρό γαμέτη (αρσενικό). Στα περισσότερα είδη ζώων αυτά τα απλοειδή κύτταρα παράγονται σε ένα συγκεκριμένο όργανο, την γονάδα. Το αρχικό έναυσμα για το αν ένα έμβρυο θα γίνει αρσενικό ή θηλυκό και η επακόλουθη διαμόρφωση της αδιαφοροποίητης γονάδας σε όρχη ή ωοθήκη είναι οι δύο κύριες διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την ανάπτυξη του φύλου. Το έναυσμα για το αν η πρώιμη και αδιαφοροποίητη γονάδα θα γίνει όρχεις ή ωοθήκες συνηθίζεται να αποκαλείται φυλοκαθορισμός (Sex Determination) και η διαδικασία που ακολουθεί τον φυλοκαθορισμό και κατευθύνει την ανάπτυξη των όρχεων ή των ωοθηκών, αποκαλείται διαφοροποίηση του φύλου (Sex Differentiation). Οι μηχανισμοί για τον καθορισμό του φύλου, ποικίλουν εξαιρετικά μεταξύ των οργανισμών. Οι παραλλαγές αυτές και τα διάφορα συστήματα φυλοκαθορισμού δεν συνηθίζεται να ομαδοποιούνται μέσα στην ίδια εξελικτική γραμμή (π.χ. σε είδη μιας οικογένειας), αλλά βρίσκονται διασκορπισμένα στο φυλογενετικό δέντρο, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτοί οι μηχανισμοί έχουν εξελιχθεί επανειλημμένα. Επιπλέον, πολύ συγγενικά είδη έχουν αναπτύξει διαφορετικούς μηχανισμούς φυλοκαθορισμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει χαμηλό εμπόδιο στις μεταβάσεις μεταξύ των συστημάτων.Μεταξύ των ψαριών, η οικογένεια Sparidae θεωρείται, όσον αφορά τους διαφορετικούς τρόπους αναπαραγωγής, μια από τις πιο ποικιλόμορφες οικογένειες καθώς σε αυτήν απατώνται σχεδόν όλα τα γνωστά αναπαραγωγικά μοτίβα που συναντάμε στον κλάδο των τελεόστεων. Αποτελεί έτσι μια οικογένεια - μοντέλο για συγκριτικές μελέτες σχετικές με τους μοριακούς μηχανισμούς πίσω από τα διάφορα αναπαραγωγικά μοτίβα και συστήματα. Παρά τις εκτεταμένες φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ των φύλων, τα θηλυκά και τα αρσενικά είναι σχεδόν ταυτόσημα γενετικά. Στα περισσότερα είδη, τα αρσενικά και θηλυκά γονιδιώματα διαφέρουν μόνο σε μερικά γονίδια που βρίσκονται στα φυλετικά χρωμοσώματα. Ενώ σε είδη χωρίς γενετικό φυλοκαθορισμό, τα γονιδιώματα είναι τελείως όμοια. Έτσι, η συντριπτική πλειοψηφία των φυλετικών διμορφικών χαρακτηριστικών προκύπτει από τη διαφορική έκφραση των γονιδίων που υπάρχουν και στα δύο φύλα. Πολλά γονίδια μεταγράφονται σε μεγαλύτερο βαθμό στο ένα φύλο από ότι στο άλλο. Αυτή η διαφορά στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ των δύο φύλων είναι και ο μηχανισμός με τον οποίο κληρονομήσιμες διαφορές μεταξύ των φύλων (αυτό που καλούμε φυλετικό διμορφισμό) μπορούν να προκύψουν από ένα κατά το πλείστον πανομοιότυπο γονιδίωμα. Τα γονίδια με διμορφική έκφραση στα δύο φύλα συχνά αναφέρονται ως “sex-biased” γονίδια, αν και δεν είναι τα ίδια τα γονίδια που είναι “sex-biased”, αλλά η έκφρασή τους. Οι γνώσεις σχετικά με τις διαφορές των δύο φύλων σε μοριακό επίπεδο έχουν προκύψει από μελέτες στον άνθρωπο, σε μοντέλα οργανισμούς όπως το ποντίκι, την κότα και τον Αφρικανικό ονυχοφόρο βάτραχο. Ομοίως στα ψάρια, μελέτες που αφορούν την διαφορική έκφραση γονιδίων στα δύο φύλα έχουν διεξαχθεί κυρίως σε: συστήματα φυλοκαθορισμού μοντέλων ιχθύων, τις περισσότερες φορές καλά χαρακτηρισμένων σε γενωμικό επίπεδο, με διακριτά ετερομορφικά φυλετικά χρωμοσώματα, που έχουν γενετικό σύστημα φυλοκαθορισμού και είναι γονοχωριστικά. Τέτοια γονίδια περιλαμβάνουν: το DmY/Dmrt1bY στα Oryzias latipes και Oryzias curvinotus, το Gsdf στο Oryzias luzonensis, το Amhy στο Odontesthes hatcheri, το Amhr2 στα Takifugu rubripes, Takifugu pardalis και Takifugu poecilonotus και το SdY στην ιριδίζουσα πέστροφα, Oncorhynchus mykiss. Προσφάτως αναγνωρίστηκε ένα απομακρυσμένο cis-ρυθμιστικό στοιχείο του Sox3 γονιδίου, υπεύθυνο για την ανάπτυξη του αρσενικού φαινοτύπου στην Oryzias dancena (XX/XY σύστημα φυλοκαθορισμού), ενώ το Dmrt1 έχει προταθεί ως ρυθμιστικό γονίδιο του φύλου στο είδος γλώσσας Cynoglossus semilaevis (ZZ/ZW σύστημα φυλοκαθορισμού). Η πρώτη εργασία πάνω σε φυλο-εξαρτώμενη γονιδιακή έκφραση σε είδη της οικογένειας Sparidae ήταν στο στοιχειώδες (rudimentary)* ερμαφρόδιτο μυτάκι, Diplodus puntazzo. Οι στόχοι αυτής της εργασίας κατηγοριοποιούνται σε τρία βασικά θέματα: 1) Πρώτος στόχος ήταν να μελετήσουμε τις διαφορές σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων μεταξύ αρσενικών και θηλυκών σε 5 είδη της οικογένειας Sparidae. Πιο συγκεκριμένα, θέλαμε να ερευνήσουμε διαφορές στην γονιδιακή έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών γονάδων και εγκεφάλων, ιστών με τον πιο κυρίαρχο ρόλο στην διαφοροποίηση του φύλου και στην αναπαραγωγή. 2) Να μελετήσουμε τα γονιδιακά δίκτυα (δηλ. γονίδια και τα μονοπάτια) που εμπλέκονται στον φαινότυπο του φύλου στα είδη αυτά. Με απώτερο σκοπό την αναζήτηση μοριακών καθοριστών του φύλου. Και έτσι, 3) να αποκτήσουμε μια όσο το δυνατόν συνολικότερη εικόνα για το σύστημα φυλοκαθορισμού σε αυτούς τους οργανισμούς που εμφανίζουν τόσο ιδιαίτερα αναπαραγωγικά μοτίβα. Στην παρούσα μελέτη, εξερευνήσαμε τις διαφορές μεταξύ των δύο φύλων σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων, σε 5 είδη της οικογένειας Sparidae, αντιπροσώπων τεσσάρων διαφορετικών αναπαραγωγικών μοτίβων: Η γονοχωριστική συναγρίδα Dentex dentex, τα πρωτόγυνα λυθρίνι Pagellus erythrinus και φαγκρί Pagrus pagrus, το στοιχειώδες ερμαφρόδιτο μυτάκι Diplodus puntazzo και η πρώτανδρη τσιπούρα Sparus aurata. Μεσω της αλληλούxησης του RNA, αναλύσαμε και συγκρίναμε διαφορές μεταξύ των μεταγραφωμάτων σε αρσενικά και θηλυκά άτομα των ειδών μελέτης. Πιο συγκεκριμένα, ερευνήσαμε διαφορές στην γονιδιακή έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών γονάδων και εγκεφάλων, ιστών με τον πιο κυρίαρχο ρόλο στην διαφοροποίηση του φύλου και στην αναπαραγωγή. Πετύχαμε να έχουμε μια συνολική εικόνα της φυλο-εξαρτώμενης έκφρασης γονιδίων στον εγκέφαλο και στις γονάδες. Μέσω συγκριτικής ανάλυσης αποκαλύφθηκαν ειδικά για τα αρσενικά (male-biased) και ειδικά για τα θηλυκά (female-biased) γονίδια και μονοπάτια, μεταξύ των οργανισμών μελέτης. Μέσω εκτενούς βιβλιογραφικής μελέτης, συλλέξαμε και παρατηρήσαμε τα μοτίβα έκφρασης γνωστών υποψήφιων γονιδίων, βασικών συντελεστών στον φυλοκαθορισμό και την διαφοροποίηση του φύλου σε άλλα ψάρια και σπονδυλωτά, αποκαλύπτοντας έτσι την γονιδιακή εργαλειοθήκη που ευθύνεται για την εγκαθίδρυση του φύλου (του αρσενικού και θηλυκού φαινοτύπου) στους 5 αυτούς ιχθύες. Η συνολική εικόνα του προτύπου έκφρασης (expression pattern) στον εγκέφαλο και στις γονάδες για όλα τα δείγματα των ειδών που αναλύθηκαν αποτυπώνεται με την μορφή PCA (Principal Component Analysis) γραφημάτων και heatmap plots (για την δημιουργία αυτών των PCA διαγραμμάτων χρησιμοποιήθηκαν όλα τα γονίδια που εξετάστηκαν για διαφορική έκφραση ανάμεσα σε αρσενικά και θηλυκά). Για όλα τα είδη, τα διαγράμματα που προέκυψαν δείχνουν την ύπαρξη τριών διαφορετικών ομάδων: τους εγκεφάλους (αρσενικοί και θηλυκοί μαζί), τις αρσενικές και τις θηλυκές γονάδες. Ενώ οι δύο τύποι γονάδων ομαδοποιούνται ξεχωριστά δείχνοντας μια αξιοσημείωτη διαφοροποίηση μεταξύ των δύο φύλων, oι εγκέφαλοι αρσενικών και θηλυκών ομαδοποιούνται μαζί, δείχνοντας πολύ όμοια πρότυπα έκφρασης. Η ανάλυση αποκαλύπτει μικρές διαφορές στην έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών στον εγκέφαλο. Γενικά, τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια στον εγκέφαλο είναι και σχετικά λίγα στον αριθμό αλλά και η ένταση διαφορικής έκφρασης τους μικρή, όπως αποκαλύπτεται από τις λογαριθμικές διαφορές. Παρά τις μικρές διαφορές έκφρασης μεταξύ των δύο φύλων στο εγκέφαλο, βρήκαμε κάποια γονίδια άξια σχολιασμού: Όπως ο "early growth response factor 1 και 4" και το "proto-oncogene c-Fos" που βρέθηκαν να υπερεκφράζονται στους εγκεφάλους των θηλυκων πρωτόγυνων (red porgy & common pandora). Αυτά τα γονίδια που χαρακτηρίζονται ως immediate-early genes, σχετίζονται με διαφορές στην εγκεφαλική δραστηριότητα και με αντίστοιχες γενωμικές αποκρίσεις σε κοινωνικά σήματα, συμπεριφορικά σήματα, σήματα που ανταλλάσσονται κατά το ζευγάρωμα. Επίσης, στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων της τσιπούρας βρήκαμε να υπερ-εκφράζονται τα "vasotocin-neurophysin VT 1-like" και "isotocin-neurophysin IT 1-like" γονίδια που σχετίζονται με κοινωνικές στερεοτυπικές συμπεριφορές των αρσενικών σε διάφορα είδη σπονδυλωτών. Χαρακτηριστική αρσενική έκφραση σε όλα τα είδη που μελετήθηκαν είχαν δύο παράγοντες: Prkce (Protein kinase C epsilon type) και EphA4 (Ephrin type-A receptor 4)· και οι δύο αυτοί παράγοντες εμπλέκονται και σηματοδοτούν μονοπάτια διαφόρων κινασών, που ο ρόλος αυτών των μονοπατιών έχει βρεθεί σε μελέτες θηλαστικών να παίζει σημαντικό ρόλο στον φυλοκαθορισμό.Οι γονάδες είναι ο ιστός που διαφέρει περισσότερο μεταξύ των δύο φύλων. Παρά την ευελιξία του γοναδικού ιστού στα είδη που αναστρέφουν το φύλο, και παρά το γεγονός ότι οι όρχεις και οι ωοθήκες προέρχονται από τον ίδιο πρόδρομο ιστό, όταν το φύλο έχει εγκαθιδρυθεί πρόκειται για δύο εντελώς διαφορετικούς λειτουργικά τύπους ιστού. Η λειτουργική και όχι μόνο απόκλιση των δύο τύπων ιστού αντικατοπτρίζεται και στα μεταγραφωματικά τους προφίλ. Η παρατήρηση του σχεδόν διπλάσιου αριθμού γονιδίων που υπερ-εκφράζονται στους όρχεις σε σχέση με αυτά στις ωοθήκες υποδηλώνει μια “male-biased” τάση έκφρασης στις γονάδες. Όλο και περισσότερες έρευνες που μελετούν φυλο-ειδικές/φυλο-εξαρτώμενες διαφορές έκφρασης στα ψάρια υπογραμμίζουν αυτήν την τάση. Στην περίπτωση των ψαριών που μελετώνται εδώ, τα οποία δεν έχουν φυλετικά χρωμοσώματα και δεν εμφανίζουν κάποιο σταθερό σύστημα καθαρά γενετικού φυλοκαθορισμού, αυτή η τάση πρέπει να μελετηθεί εις βάθος καθώς ενδέχεται να εξηγεί πολλά για την διαμόρφωση και διατήρηση της αρσενικής ή θηλυκής ταυτότητας της γονάδας.Θέλοντας να εστιάσουμε σε συγκεκριμένα γονίδια και μονοπάτια που εμπλέκονται στον φυλοκαθορισμό και την διαφοροποίηση του φύλου στις γονάδες, συνδυάσαμε την πληροφορία από την ανάλυση εμπλουτισμού και την στοχευμένη ανάλυση του μεταγραφώματος (enrichment and targeted analysis) καθώς και την υπάρχουσα βιβλιογραφική πληροφορία για να καταλήξουμε σε μια λίστα 114 γνωστών γονιδίων που σχετίζονται με την αναπαραγωγή, τον φυλοκαθορισμό και τη διαφοροποίηση του φύλου όπως έχει βρεθεί σε άλλα είδη ψαριών, σπονδυλωτών και θηλαστικών. Στη συνέχεια, μελετήσαμε τα πρότυπα έκφρασης αυτών των γονιδίων στις γονάδες των οργανισμών μελέτης. Εκτός των συγκεκριμένων γονιδίων που προέκυψαν από την “χειροκίνητη” θα λέγαμε ανάλυση, κοιτάξαμε τη διαφορική έκφραση γονιδίων στις γονάδες σε μια συγκριτική προσέγγιση όλου του μεταγραφώματος (“whole-transcriptome”). Αφού βρήκαμε τα ορθόλογα γονίδια στα μεταγραφώματα των 5 οργανισμών, εισαγάγαμε την πληροφορία έκφρασης καθώς και τον βιολογικό χαρακτηρισμό (πληροφορία που προέκυψε από τον λειτουργικό σχολιασμό του μεταγραφώματος) και βρήκαμε 1418 ορθόλογα γονίδια να υπερ-εκφράζονται στους όρχεις και 1665 ορθόλογα γονίδια να υπερ-εκφράζονται στις ωοθήκες και των 5 οργανισμών. Γονίδια που φαίνεται να έχουν εναν συντηρημένο ρόλο στο να ορίζουν την αρσενική ή θηλυκή ταυτότητα της γονάδας σε αυτή την οικογένεια τελεόστεων. Ξεκινώντας από την διαμόρφωση και εγκαθίδρυση του θηλυκού φαινότυπου, που από πολλούς θεωρείται και το “προεπιλεγμένο” φύλο (τουλάχιστον στα θηλαστικά), το γονίδιο της αρωματάσης των γονάδων (gonadal aromatase gene, Cyp19a1a), είναι ίσως το γονίδιο με τον πιο πρωταγωνιστικό ρόλο για την τύχη της γονάδας. Στην εργασία αυτή, βρίσκουμε μιας υψηλής έντασης υπερ-εκφραση του γονιδίου της αρωματάσης στις ωοθήκες, στα άτομα όλων των ειδών που εξετάστηκαν. Στα ψάρια, η αρωματάση επιτελεί έναν σημαντικότατο ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των ωοθηκών. Η χαρακτηριστική θηλυκή έκφραση της έχει αναφερθεί σε πολλά γονοχωριστικά άλλα και ερμαφρόδιτα είδη, γεγονός που υπογραμμίζει την εμπλοκή της στην διαφοροποίηση των γονάδων αλλά και στην αναστροφή του φύλου. Η αρωματάση μαζί με τα οιστρογόνα ρυθμίζουν και ελέγχουν όχι μόνο την διαφοροποίηση των ωοθηκών αλλά και με αντίστροφο τρόπο των όρχεων. Έχοντας μια κεντρική θέση στο δίκτυο γονιδίων υπεύθυνων για το φύλο, η αρωματάση συνδέει πολλαπλά μονοπάτια μέσα στο δίκτυο και πολλοί κλασικοί μεταγραφωματικοί παράγοντες ελέγχουν και επηρεάζουν την έκφραση της (πχ. αυτόν της Foxl2). Εκτός αυτού όμως, η έκφραση της ελέγχεται και από επιγενετικούς παράγοντες. Αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης στον εκκινητή της αρωματάσης, ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης της σε θερμο-εξαρτώμενα συστήματα φυλοκαθορισμού. Η αρωματάση η οποία μοιάζει να αποτελεί μια συγκλίνουσα ανάγνωση που υποδηλώνει την δέσμευση στο θηλυκό μονοπάτι τόσο στα ψάρια όσο και στα ερπετά, αντιπροσωπεύει έναν μοριακό συνδετικό κρίκο μεταξύ περιβάλλοντος και του μοριακού συστήματος φυλοκαθορισμού. Ένας παράγοντας του θηλυκού μονοπατιού, φαίνεται να είναι επίσης ο Figla (factor in germ-line alpha), καθώς εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στις ωοθήκες όλων των ειδών της παρούσας μελέτης. Το γονίδιο Figla κωδικοποιεί έναν μεταγραφικό παράγοντα που ρυθμίζει την έκφραση ειδικών γονιδίων των ωοκυττάρων “zona pellucida genes” και συνεπώς ρυθμίζει την ωοθυλακιογένεση. Εκτός από τον ευρέως αποδεκτό του ρόλο στο να προωθεί την ανάπτυξη των ωοθηκών, έχει επίσης την ικανότητα να καταστέλλει την σπερματογένεση και έτσι να ενεργεί ως ανταγωνιστικός παράγοντας του αρσενικού μονοπατιού. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι ο παράγοντας Figla εμφανίζει μια αντιπαράλληλη κατεύθυνση έκφρασης με το Dmrt1 (πολύ σημαντικό γονίδιο που προωθεί την αρσενική ανάπτυξη) κατά τη μετάβαση από το αρσενικό στο θηλυκό και αντιστρόφως, στο πρώτανδρο Acanthopagrus schlegelii και στο πρωτόγυνο είδος Halichoeres poecilopterus. Η συσχέτιση του γονιδίου Figla με επιγενετικούς μηχανισμούς μέσω εναλλακτικού ματίσματος στο είδος γλώσσας Cynoglossus semilaevis, αποτελεί παράδειγμα για το πως συντηρημένοι γενετικοί παράγοντες σε σταθερά συστήματα γενετικού καθορισμού του φύλου (GSD) μπορούν να χρησιμοποιηθούν από συστήματα περιβαλλοντικού καθορισμού του φύλου (ESD). Στην θηλυκή “ομάδα” βρήκαμε επίσης ένα βασικό παράγοντα του Wnt/b-catenin μονοπατιού, το γονίδιο της Catenin-beta 1. Στα θηλαστικά, το μονοπάτι αυτό έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη ωοθηκών, ενώ στα ψάρια η σύνδεση αυτού του μονοπατιού με το θηλυκό στοιχείο, δεν είναι κανόνας. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει ότι το Wnt / b-catenin μονοπάτι έχει ενεργό ρόλο στη διαφοροποίηση της γονάδας σε όλα τα είδη που μελετήσαμε, με βάση την ανάλυση εμπλουτισμού. Ωστόσο, μόνο η Ctnnb1 έδειξε ένα σταθερό μοτίβο, υπερ-έκφρασης στις θηλυκές γονάδες σε όλα τα είδη. Αυτό καταδεικνύει τον συντηρημένο και σημαντικό ρόλο της Ctnnb1 προς την διατήρηση της θηλυκής ταυτότητας της γονάδας, τουλάχιστον σε αυτή την ομάδα ιχθύων. Το γονίδιο της Wnt4 βρέθηκε να εκφράζεται στις θηλυκές γονάδες του γονοχωριστικού είδους (συναγρίδα, Dentex dentex) αλλά και στα δύο πρωτόγυνα (φαγκρί, Pagrus pagrus και λυθρίνι Pagellus erythrinus), ενώ δεν βρέθηκε στο μεταγράφωμα του μυτακιού, Diplodus puntazzo αλλά και της τσιπούρας, Sparus aurata. Επιπλέον, το Rspo1 δεν εμφάνισε διαφορές στην έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών γονάδων σε όλα τα είδη εκτός της συναγρίδας που βρέθηκε να υπερ-εκφράζεται στους όρχεις. Το γονίδιο της Ctnnb1 είναι πιο “downstream” γονίδιο στο WNT-μονοπάτι στα θηλαστικά και τα Wnt4 και Rspo1 ενεργούν μέσω αυτού, χρησιμοποιώντας το ως μεσολαβητή. Αυτό το γεγονός, εγείρει την πιθανότητα ο ρόλος του Ctnnb1 στην θηλυκή ανάπτυξη, σε αυτή την ομάδα ψαριών να είναι περισσότερο συντηρημένος σε σχέση με τους πιο upstream παράγοντες Wnt4 και Rspo1. Παρομοίως με το Wnt/b-catenin μονοπάτι, ο ρόλος του μονοπατιού ρετινοϊκού οξέος στον φυλοκαθορισμό και ειδικά στην διαφοροποίηση των θηλυκών γονάδων έχει επισημανθεί πολλές φορές. Επιβεβαιώνεται επίσης και από τα ευρήματα του παρόντος διδακτορικού. Ο ρόλος αυτού του μονοπατιού είναι σημαντικός στην διαφοροποίηση των ωοθηκών διότι το ρετινοϊκό οξύ ελέγχει την έναρξη της μείωσης των γεννητικών κυττάρων. Δύο μέλη αυτού του μονοπατιού, η Cyp26a και το Stra6 έδειξαν να υπερ-εκφράζονται στον θηλυκό ιστό και στα 5 είδη που μελετήσαμε. Προσφάτως, μελέτη στην τιλάπια του Νείλου, Oreochromis niloticus έδειξε ότι ο ομοιοστατικός μηχανισμός που ενεργοποιείται από το retinoic acid gene 8 (Stra8), και εμπλέκει την Cyp26a1 και τη Aldh1a2, μεσολαβεί για να εισέλθουν τα γεννητικά κύτταρα στην μείωση. Ενώ το Stra8 απουσιάζει από τα μεταγραφώματα όλων των ειδών που μελετήσαμε εδώ, το Stra6 ήταν παρόν και μάλιστα υπερ-εκφράζονταν στις θηλυκές γονάδες. Ενας ακόμη μεταγραφικός παράγοντας που τάσσεται υπέρ της θηλυκής πλευράς, είναι ο Gdf9 (growth differentiation factor-9). Ο Gdf9 βρέθηκε να υπερ-εκφράζεται στις ωοθήκες όλων των ειδών που εξετάστηκαν. Ευρήματα σε συμφωνία με αυτά στο πρωτόγυνο είδος Λαβρύδων, Thalassoma bifasciatum. Αυτό το μέλος της υπερ-οικογένειας των TGFβ παραγόντων, είναι ένας χαρακτηριστικός θηλυκός παράγοντας που συσχετίζεται με τα ωοκύτταρα και την θηλυκή γονάδα σε διάφορα σπονδυλωτά συμπεριλαμβανομένων των θηλαστικών, την κότα, και το zebrafish. Ως αναπτυξιακός παράγοντας, είναι υπεύθυνος για ω

Determination of the physical state of hpv-16 genome: association with the grade of cervical malignancy and Identification of hpv-16 integration sites into the cellular chromosome

Human Papillomaviruses (HPVs) are non enveloped, epitheliotropic, double stranded, circular DNA viruses that infect cutaneous and/or mucosal epithelia. Over 150 different HPV types have been characterized, and approximately 40 of them are detected in the cervical epithelia and are classified as members of the genus Alphapapillomavirus. Epidemiological studies have revealed that persistent infection with high-risk human papillomavirus is the main risk factor for the development of high grade precancerous lesions and cervical carcinoma, with HPV16 and HPV18 types being the most frequently identified HPV types in invasive cervical cancer cases worldwide. Cancer progression is associated with persistent high-risk HPV infection and with deregulated expression of viral oncogenes E6 and E7. The E6 and E7 oncoproteins mediate mitogenic and antiapoptotic stimuli by interacting with numerous regulatory proteins of the host cell that control the cell cycle. As a consequence, HPV infection causes excessive cell proliferation, deficient DNA repair, and the accumulation of genetic damages in the infected cell.Persistent infection with high-risk ΗPV types is associated with an increasing risk of genome integration into the host cell chromosome and progression to cancer. Viral integration deregulates the expression of the E6 and E7 proteins in the high-risk HPVs types. As a consequence, the virus stimulates cell cycle entry, providing selective growth advantage to the infected cells. In addition, the extensive proliferation of the infected epithelial cells is directly responsible for the accumulation of genetic errors, and genome destabilization that result in cancer development.The present thesis, focused on the molecular analysis of HPV16 DNA. Moreover, the HPV16 DNA physical state and the HPV16 integration sites into the cellular chromosome were determined. The study was carried out in HPV16 positive cervical samples derived from Greek population, that were diagnosed as high grade, low grade squamous intraepithelial lesions and cervical cancer cases. Nucleotide and phylogenetic analysis of HPV16 DNA, showed that the prototype stain and the European variant are both prevalent in Greek population, while non European variants are circulating among Greek women. To the best of our knowledge, novel sequence variations were reported for the first time within Ε1, Ε2, Ε4, Ε6 and Ε7 genes, as well as duplications and intratypic recombination events among distinct ΗPV16 variants were also reported. However, molecular evolutionary analysis proposed that different genes at the early region of ΗPV16 genome are dominated by different selective pressure and that might be associated with the essential role of viral proteins in the productive viral life cycle.In addition, the present thesis studied the physical state of HPV16 DNA, considering that the key importance for the progression of cervical intraepithelial neoplasias (CIN) to invasive cervical cancer is the integration of HPV into the host genome. The physical state of viral genome was determined, taking into consideration the most frequently disrupted sites of HPV16 DNA, revealing that the viral integration is an early event in the viral life cycle. Finally, according to integration sites analysis, rearrangements within HPV16 genome were determined. In particular, a model of looping was proposed by which viral - host DNA concatatemers - mediate replication and recombination resulting to rearrangements in inverted orientation. According to this hypothesis, after HPV16 integration into the host chromososome, the virus promotes genome destabilization leading to cancer development. In conclusion, the extensive mapping analysis of disruption sites of E1 and E2 genes, in combination with the nucleotide analysis of E1, E2 and E6 genes, and the detection of HPV16 genome rearrangements, is a prerequisite in order to further understand and analyze the physical state of HPV16 DNA form in cancer progression.Οι Ιοί των Θηλωμάτων του ανθρώπου (HPV) είναι μικροί, δίκλωνοι κυκλικοί DNA ιοί, χωρίς εξωτερικό περίβλημα και προσβάλουν το επιθήλιο του δέρματος ή το επιθήλιο του βλεννογόνου. Περισσότεροι από 150 HPV τύποι έχουν ανιχνευτεί, ενώ πάνω από 40 τύποι συνδέονται με αλλοιώσεις του ουρογεννητικού συστήματος και διαχωρίζονται στους τύπους χαμηλού (low-risk) και υψηλού κινδύνου (high-risk). Επιδημιολογικές μελέτες έχουν προτείνει ότι ''επίμονη'' μόλυνση με HPV τύπους υψηλού κινδύνου, είναι σημαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη προκαρκινικών και καρκινικών αλλοιώσεων με τους HPV16 και HPV18 να εντοπίζονται σε περισσότερο από το 72% των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας παγκοσμίως. Η εμφάνιση καρκίνου συνδέεται με μόλυνση με HPV τύπους υψηλού κινδύνου και με την απορύθμιση της έκφρασης των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7. Η ανεξέλεγκτη έκφραση των ογκογονιδίων οδηγεί στον εκτεταμένο πολλαπλασιασμό των μολυσμένων κυττάρων, στην ατελή επιδιόρθωση του DNA και στη συσσώρευση μεταλλάξεων στα μολυσμένα κύτταρα.Η ''επίμονη'' υψηλού βαθμού αλλοίωση συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο ενσωμάτωσης του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα και την πρόοδο της αλλοίωσης σε καρκίνο. Η ενσωμάτωση του ιού στο κυτταρικό γονιδίωμα αποσταθεροποιεί την έκφραση των γονιδίων Ε6 και Ε7. Το γεγονός αυτό δίνει την δυνατότητα στον ιό να διεγείρει έντονα τον κυτταρικό κύκλο και την διαρκή είσοδο του κυττάρου στη φάση της μίτωσης, δίνοντας στα μολυσμένα κύτταρα ισχυρό αναπτυξιακό πλεονέκτημα. Σε δεύτερη φάση μετά τον συνεχή πολλαπλασιασμό των μολυσμένων κυττάρων προκαλείται συσσώρευση γενετικών λαθών και αποσταθεροποίηση του γονιδιώματος του ξενιστή με αποτέλεσμα την δημιουργία καρκινικών αλλοιώσεων.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του γονιδιώματος του HPV16, ενώ παράλληλα επιχειρήθηκε ο προσδιορισμός της μορφής του γονιδιώματος του ιού και ο προσδιορισμός των θέσεων ενσωμάτωσης του HPV16 στο κυτταρικό χρωμόσωμα.. Η μελέτη______________________________________________________________________ΕΚΤ | www.didaktorika.gr | 5πραγματοποιήθηκε σε κλινικά δείγματα τραχήλου της μήτρας που απομονώθηκαν από τον Ελληνικό πληθυσμό, θετικά για μόλυνση με τον ιό. Η νουκλεοτιδική και φυλογενετική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι το πρότυπο στέλεχος του HPV16 καθώς και η Ευρωπαϊκή παραλλαγή του γονιδιώματος του ιού επικρατούν στον Ελληνικό πληθυσμό, ενώ παράλληλα παρατηρήθηκε ότι μη Ευρωπαϊκές παραλλαγές του HPV16 DNA κυκλοφορούν στον Ελληνικό πληθυσμό. Ακόμη εντοπίστηκαν καινούργιες μεταλλάξεις εντός των γονιδίων Ε1, Ε2, Ε4, Ε6 και Ε7 που δεν έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία καθώς επίσης και φαινόμενα διπλασιασμού και ενδοτυπικού ανασυνδυασμού μεταξύ διαφορετικών παραλλαγών του HPV16 DNA. Τέλος, οι διαφορετικές περιοχές της πρώιμης περιοχής του γονιδιώματος του HPV16 DNA εξελίσσονται με διαφορετικό τρόπο και αυτό ίσως να σχετίζεται με τις διαφορετικές λειτουργίες που επιτελούν οι ιικές πρωτεΐνες στο κύκλο ζωής του ιού.Παράλληλα, προσδιορίστηκε η μορφή του HPV16 DNA, χαρτογραφώντας τις πιο συχνές θέσεις ρήξης του ιικού DNA. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε, ότι η ενσωμάτωση του HPV16 είναι ένα φαινόμενο το οποίο συμβαίνει νωρίς στο κύκλο ζωής του ιού. Τέλος, από τον προσδιορισμό των θέσεων ενσωμάτωσης του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα εντοπίστηκαν φαινόμενα αναδιάταξης του HPV16 DNA προτείνοντας ένα μοντέλο, σύμφωνα με το οποίο ενσωματωμένα μόρια DNA σε μορφή αλυσομερών HPV16 DNΑ - κυτταρικό DNA έρχονται σε αντιπαράλληλο προσανατολισμό και ανασυνδυάζονται μεταξύ τους μέσω μιας δομής θηλιάς. Το φαινόμενο αυτό προκαλεί διαρκώς αποσταθεροποίηση του κυτταρικού χρωμοσώματος, γεγονός που δηλώνει, ότι ακόμη και μετά την ενσωμάτωση του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα ο ιός συνεχίζει να προκαλεί διαρκώς φαινόμενα αποσταθεροποίησης του κυτταρικού DNA. Συμπερασματικά, η χαρτογράφηση των συνηθέστερων θέσεων ρήξης των Ε1 και Ε2 γονιδίων σε συνδυασμό με τη νουκλεοτιδική ανάλυση των γονιδίων Ε1, Ε2 και Ε6 του HPV16 και τον προσδιορισμό γεγονότων αναδιάταξης του HPV16 DNA θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη για τον προσδιορισμό της μορφής του γονιδιώματος των διαφορετικών HPV16 στελεχών και της περαιτέρω κατανόησης των γεγονότων τα οποίο εμπλέκουν τον HPV16 στην ογκογένεση