Structural dissection of human translation elongation factor 1Bγ (eEF1Bγ): expression of full-length protein and its truncated forms

Aim. To gain more insights into properties of the human translation elongation factor eEF1Bγ and its interaction with partners we intended to produce the full-length protein and its truncated forms. Methods. cDNAs encoding truncated forms of eEF1Bγ were generated by PCR amplification with respective primers and cloned into vectors providing polyhistidine, glutathione S-transferase or maltose binding protein tags. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. An aggregation state of the proteins was analyzed by analytical gel filtration. Results. The expression, purification and storage conditions for the full-length recombinant His-eEF1Bγ were optimized. Several truncated forms of eEF1Bγ were also expressed and purified to homogeneity. Two short variants of C-terminal domain comprising amino acids 263–437 or 228–437 were obtained in monomeric state. Two short variants of N-terminal domain comprising amino acids 1–33 or 1–230, fused with glutathione S-transferase, were obtained and estimated to be dimers by gel filtration. The mutants of N-terminal domain comprising amino acids 1–93 or 1–165, fused with maltose binding protein, were obtained as soluble high molecular weight aggregates only. Conclusions. The purified recombinant His-eEF1Bγ and several truncated forms of the protein were obtained and characterized. These protein variants will be used for further studies on the protein-protein interaction.Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.Цель. Для более детального изучения свойств человеческого фактора элонгации трансляции eEF1Bγ и его взаимодействия с партнерами оптимизировать експрессию кДНК полноразмерного белка, а также его усеченных форм. Методы. кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bγ, генерировали методом ПЦР-амплификации с соответствующими праймерами и клонировали в векторы, содержащие в качестве аффинной метки полигистидиновую последовательность, глутатион S-трансферазу или белок, связывающий мальтозу. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериях и очищали аффинной хроматографией. Агрегатное состояние полученных белков анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Результаты. Оптимизированы экспрессия, очистка и условия хранения полноразмерного рекомби- нантного His-eEF1Bγ. Также експрессированы и очищены до гомогенного состояния несколько усеченных форм eEF1Bγ. Две укороченные формы С-концевого домена, содержащие аминокис- лотные остатки 263–437 и 228–437, получены в виде растворимых мономерных белков. Две укороченные формы N-концевого домена, содержащие аминокислотные остатки 1–33 и 1–230, слитые с глутатион S-трансферазой, получены в виде димеров по результатам гель-фильтрации. Другие делеционные мутанты, содержащие аминокислотные остатки 1–93 и 1–165 N-концевого домена и слиты с белком, связывающим мальтозу, могут быть получены только в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов. Выводы. Получены и охарактеризованы рекомбинантный фактор элонгации трансляции His-eEF1B и его четыре усеченные формы, которые в дальнейшем будут использованы для изу- чения белково-белковых взаимодействий

Structural dissection of human translation elongation factor 1Bγ (eEF1Bγ): expression of full-length protein and its truncated forms

Aim. To gain more insights into properties of the human translation elongation factor eEF1Bγ and its interaction with partners we intended to produce the full-length protein and its truncated forms. Methods. cDNAs encoding truncated forms of eEF1Bγ were generated by PCR amplification with respective primers and cloned into vectors providing polyhistidine, glutathione S-transferase or maltose binding protein tags. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. An aggregation state of the proteins was analyzed by analytical gel filtration. Results. The expression, purification and storage conditions for the full-length recombinant His-eEF1Bγ were optimized. Several truncated forms of eEF1Bγ were also expressed and purified to homogeneity. Two short variants of C-terminal domain comprising amino acids 263–437 or 228–437 were obtained in monomeric state. Two short variants of N-terminal domain comprising amino acids 1–33 or 1–230, fused with glutathione S-transferase, were obtained and estimated to be dimers by gel filtration. The mutants of N-terminal domain comprising amino acids 1–93 or 1–165, fused with maltose binding protein, were obtained as soluble high molecular weight aggregates only. Conclusions. The purified recombinant His-eEF1Bγ and several truncated forms of the protein were obtained and characterized. These protein variants will be used for further studies on the protein-protein interaction.Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.Цель. Для более детального изучения свойств человеческого фактора элонгации трансляции eEF1Bγ и его взаимодействия с партнерами оптимизировать експрессию кДНК полноразмерного белка, а также его усеченных форм. Методы. кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bγ, генерировали методом ПЦР-амплификации с соответствующими праймерами и клонировали в векторы, содержащие в качестве аффинной метки полигистидиновую последовательность, глутатион S-трансферазу или белок, связывающий мальтозу. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериях и очищали аффинной хроматографией. Агрегатное состояние полученных белков анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Результаты. Оптимизированы экспрессия, очистка и условия хранения полноразмерного рекомби- нантного His-eEF1Bγ. Также експрессированы и очищены до гомогенного состояния несколько усеченных форм eEF1Bγ. Две укороченные формы С-концевого домена, содержащие аминокис- лотные остатки 263–437 и 228–437, получены в виде растворимых мономерных белков. Две укороченные формы N-концевого домена, содержащие аминокислотные остатки 1–33 и 1–230, слитые с глутатион S-трансферазой, получены в виде димеров по результатам гель-фильтрации. Другие делеционные мутанты, содержащие аминокислотные остатки 1–93 и 1–165 N-концевого домена и слиты с белком, связывающим мальтозу, могут быть получены только в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов. Выводы. Получены и охарактеризованы рекомбинантный фактор элонгации трансляции His-eEF1B и его четыре усеченные формы, которые в дальнейшем будут использованы для изу- чения белково-белковых взаимодействий

Profiles de microhabitats dans des hêtraies primaires d'Europe

International audienceTree-related microhabitats (TreMs) are important features for the conservation of biodiversity in forest ecosystems. Although other structural indicators of forest biodiversity have been extensively studied in recent decades, TreMs have often been overlooked, either due to the absence of a consensual definition or a lack of knowledge. Despite the increased number of TreM studies in the last decade, the role of drivers of TreM profile in primary forests and across different geographical regions is still unknown. To evaluate the main drivers of TreM density and diversity, we conducted the first large-scale study of TreMs across European primary forests. We established 146 plots in eight primary forests dominated by European beech (Fagus sylvatica L.) in the Carpathian and Dinaric mountain ranges. Generalized linear mixed effect models were used to test the effect of local plot characteristics and spatial variability on the density and diversity (alpha, beta, and gamma) of TreMs. Total TreM density and diversity were significantly positively related with tree species richness and the proportion of snags. Root mean square tree diameters were significantly related to alpha and gamma diversity of TreMs. Both regions reached similarly high values of total TreM densities and total TreM densities and diversity were not significantly different between the two regions; however, we observed between the two regions significant differences in the densities of two TreM groups, conks of fungi and epiphytes. The density and diversity of TreMs were very high in beech-dominated mountain primary forests, but their occurrence and diversity was highly variable within the landscapes over relatively short spatial gradients (plot and stand levels). Understanding these profile provides a benchmark for further comparisons, such as with young forest reserves, or for improving forest management practices that promote biodiversity