Structure-based Inhibitor Design for the Antimalarial Target Plasmepsin

Malaria stellt eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten dar und ist nach Tuberkulose und AIDS die bedrohlichste aller Infektionskrankheiten. Heute gibt es eine Reihe von Medikamenten, die auf unterschiedliche Weise gegen Malaria wirken. Durch aufkommende Resistenzentwicklungen in vielen Regionen gegenüber zahlreichen Wirkstoffen, ist es jedoch notwendig geworden, neue Arzneimittel zu entwickeln. Durch die Sequenzierung des Plasmodium falciparum Genoms wurden die Plasmepsine, die Hauptgegenstand dieser Arbeit waren, als neue potentielle Zielstrukturen identifiziert. Zu Beginn der Arbeit waren bereits eine Reihe potenter, peptidomimetischer Inhibitoren und eine Kokristallstruktur von Plasmepsin II in Komplex mit Pepstatin A in der Literatur beschrieben. Um einen Beitrag im Bereich des strukturbasierten Designs von Plasmepsin Inhibitoren leisten zu können, wurden zunächst die erforderlichen Rahmenbedingungen geschaffen. Dazu gehörte die Etablierung eines Expressionssystems für Plasmepsin II und IV, was im Rahmen einer vorausgegangenen Diplomarbeit geschah. Während der Doktorarbeit ist es gelungen einen Assay zu entwickeln, der die Gesetze der Michaelis-Menten Kinetik befolgt. Weiterhin wurde versucht, ein funktionsfähiges Kristallisationssystem für Plasmespin II zu entwickeln, das die Aufklärung von Protein-Ligand-Bindungsmoden mittels Röntgenbeugungsexperimenten ermöglichen sollte. Obwohl die Reproduktion der in der Literatur bekannten Kristallstruktur mit Pepstatin A gelang, erwies es sich im Verlauf der Arbeit als schwierig, Kristalle des Zielproteins in Komplex mit neuartigen Inhibitoren zu erhalten. Nach Etablierung der für das strukturbasierte Liganden-Design erforderlichen Methoden galt es in Zusammenarbeit mit synthetisch arbeitenden Gruppen, Inhibitoren mit neuartigen, nichtpeptidomimetischen Eigenschaften zu entwerfen und zu optimieren. Erste Modelling-Studien ergaben, dass 2,3,4,7-Tetrahydro-1H-Azepin ein geeignetes Grundgerüst für die Entwicklung von Plasmepsin II und IV Inhibitoren darstellen könnte. Durch eine Kombination aus einer Datenbankanalyse mit dem Programm Cavbase und einem kombinatorischen Docking mit FlexXC wurden erste Liganden vorgeschlagen, die sich im Enzymassay als Hemmstoffe für Plasmepsin II und IV mit Ki-Werten im niedrig mikromolaren Bereich erwiesen. Eine ausgiebige Analyse theoretisch möglicher Wechselwirkungen zum Protein führte zu Vorschlägen für weitere Inhibitoren, wodurch die Affinitätsdaten bis in den nanomolaren Bereich verbessert werden konnten. Insgesamt standen die experimentell bestimmten Ki Werte von 13 Inhibitoren gut im Einklang mit der Design Hypothese und die beobachteten Struktur-Wirkbeziehungen stützen dabei den vorhergesagten Bindungsmodus. In einem weiteren Ansatz wurden Pyrrolidin Derivate, die ursprünglich als HIV-1 Protease Inhibitoren synthetisiert wurden, auf Plasmepsin-Hemmung getestet. In der Literatur sind einige Fälle beschrieben, bei denen HIV-1 Protease Inhibitoren gleichzeitig gute Hemmstoffe für Plasmepsine darstellen. Von insgesamt zwölf Molekülen zeigten die affinsten Liganden Ki Werte im nanomolaren Bereich. Für zwei Verbindungsklassen (Pyrrolidin-diol-diester und Pyrrolidindiamide) gelang es, plausible Bindungsmoden zu generieren. Mit den vorhandenen kristallographischen Informationen war es jedoch nicht möglich, einen sinnvollen Bindungsmodus für Pyrrolidindimethylenediamin-Derivate, die die dritte Verbindungsklasse darstellen, vorherzusagen. Da die Plasmepsine als sehr flexible Proteine bekannt sind, wurden Moleküldynamik (MD) Simulationen durchgeführt und mobile Bereiche innerhalb der Bindetasche genauer untersucht. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der MD Simulation konnte so ein Bindungsmodus für den Typ der Pyrrolidindimethylenediamin-Derivate erzeugt werden. Auch bei der Affinitätsdaten-Analyse einer Norstatin-Bibliothek, bei der die Verbindungen sich nur im P1-Substituenten unterschieden, konnten zunächst überraschende Ergebnisse mit Hilfe der MD Simulation erklärt werden. Eine konformative Öffnung der Plasmepsin II S1 Tasche wurde beobachtet, wodurch eine Anpassung an sperrige P1 Substituenten ermöglicht wird. So wurden durch die durchgeführte MD Simulation zahlreiche Erkenntnisse gewonnen, die von Relevanz für das strukturbasierte Wirkstoffdesign sind. Ausgehend von den Azepin Derivaten wurde in dieser Arbeit ein dritter Ansatz verfolgt, Plasmepsin Inhibitoren mit neuartigen Grundgerüsten zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde Ftrees (Feature Trees) verwendet, ein Computerprogramm, das durch seine Funktionsweise einen Übergang von einem Suchmolekül zu strukturell unähnlichen Molekülen „Scaffold Hopping“ ermöglichen soll. Eine Verbindung mit einem Thiophengrundgerüst fiel bei der Auswertung als besonders interessant auf und wurde auf die Plasmepsine getestet. Anfängliche Ki Werte im zweistellig mikromolaren Bereich konnten durch gezieltes Design um den Faktor 110 verbessert werden, was zu ersten Inhibitoren im nanomolaren Bereich führte. Insgesamt gelang es in dieser Arbeit durch unterschiedliche Ansätze Hemmstoffe für Plasmepsin II und IV vorherzusagen, bei denen die Struktur-Wirkbeziehungen mit den erzeugten Bindungsmoden weitestgehend übereinstimmten. Strukturlösungsversuche gelangen nur mit Pepstatin A, Moleküldynamiksimulationen gewährten dennoch einen Einblick in die hohe Flexibilität und stabile Konformationen der Plasmepsine. Daraus wurden Erkenntnisse für das strukturbasierte Wirkstoffdesign gewonnen, was zur Entwicklung neuer Malaria-Medikamente einen Beitrag leisten könnte

Screening a protein kinase inhibitor library against <i>Plasmodium falciparum</i>

Abstract Background Protein kinases have been shown to be key drug targets, especially in the area of oncology. It is of interest to explore the possibilities of protein kinases as a potential target class in Plasmodium spp., the causative agents of malaria. However, protein kinase biology in malaria is still being investigated. Therefore, rather than assaying against individual protein kinases, a library of 4731 compounds with protein kinase inhibitor-like scaffolds was screened against the causative parasite, Plasmodium falciparum. This approach is more holistic and considers the whole kinome, making it possible to identify compounds that inhibit more than one P. falciparum protein kinase, or indeed other malaria targets. Results As a result of this screen, 9 active compound series were identified; further validation was carried out on 4 of these series, with 3 being progressed into hits to lead chemistry. The detailed evaluation of one of these series is described. Discussion This screening approach proved to be an effective way to identify series for further optimisation against malaria. Compound optimisation was carried out in the absence of knowledge of the molecular target. Some of the series had to be halted for various reasons. Mode of action studies to find the molecular target may be useful when problems prevent further chemical optimisation. Conclusions Progressible series were identified through phenotypic screening of a relatively small focused kinase scaffold chemical library

Mutagenesis and Functional Studies with Succinate Dehydrogenase Inhibitors in the Wheat Pathogen Mycosphaerella graminicola

A range of novel carboxamide fungicides, inhibitors of the succinate dehydrogenase enzyme (SDH, EC 1.3.5.1) is currently being introduced to the crop protection market. The aim of this study was to explore the impact of structurally distinct carboxamides on target site resistance development and to assess possible impact on fitness

Structure-based Inhibitor Design for the Antimalarial Target Plasmepsin

Malaria stellt eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten dar und ist nach Tuberkulose und AIDS die bedrohlichste aller Infektionskrankheiten. Heute gibt es eine Reihe von Medikamenten, die auf unterschiedliche Weise gegen Malaria wirken. Durch aufkommende Resistenzentwicklungen in vielen Regionen gegenüber zahlreichen Wirkstoffen, ist es jedoch notwendig geworden, neue Arzneimittel zu entwickeln. Durch die Sequenzierung des Plasmodium falciparum Genoms wurden die Plasmepsine, die Hauptgegenstand dieser Arbeit waren, als neue potentielle Zielstrukturen identifiziert. Zu Beginn der Arbeit waren bereits eine Reihe potenter, peptidomimetischer Inhibitoren und eine Kokristallstruktur von Plasmepsin II in Komplex mit Pepstatin A in der Literatur beschrieben. Um einen Beitrag im Bereich des strukturbasierten Designs von Plasmepsin Inhibitoren leisten zu können, wurden zunächst die erforderlichen Rahmenbedingungen geschaffen. Dazu gehörte die Etablierung eines Expressionssystems für Plasmepsin II und IV, was im Rahmen einer vorausgegangenen Diplomarbeit geschah. Während der Doktorarbeit ist es gelungen einen Assay zu entwickeln, der die Gesetze der Michaelis-Menten Kinetik befolgt. Weiterhin wurde versucht, ein funktionsfähiges Kristallisationssystem für Plasmespin II zu entwickeln, das die Aufklärung von Protein-Ligand-Bindungsmoden mittels Röntgenbeugungsexperimenten ermöglichen sollte. Obwohl die Reproduktion der in der Literatur bekannten Kristallstruktur mit Pepstatin A gelang, erwies es sich im Verlauf der Arbeit als schwierig, Kristalle des Zielproteins in Komplex mit neuartigen Inhibitoren zu erhalten. Nach Etablierung der für das strukturbasierte Liganden-Design erforderlichen Methoden galt es in Zusammenarbeit mit synthetisch arbeitenden Gruppen, Inhibitoren mit neuartigen, nichtpeptidomimetischen Eigenschaften zu entwerfen und zu optimieren. Erste Modelling-Studien ergaben, dass 2,3,4,7-Tetrahydro-1H-Azepin ein geeignetes Grundgerüst für die Entwicklung von Plasmepsin II und IV Inhibitoren darstellen könnte. Durch eine Kombination aus einer Datenbankanalyse mit dem Programm Cavbase und einem kombinatorischen Docking mit FlexXC wurden erste Liganden vorgeschlagen, die sich im Enzymassay als Hemmstoffe für Plasmepsin II und IV mit Ki-Werten im niedrig mikromolaren Bereich erwiesen. Eine ausgiebige Analyse theoretisch möglicher Wechselwirkungen zum Protein führte zu Vorschlägen für weitere Inhibitoren, wodurch die Affinitätsdaten bis in den nanomolaren Bereich verbessert werden konnten. Insgesamt standen die experimentell bestimmten Ki Werte von 13 Inhibitoren gut im Einklang mit der Design Hypothese und die beobachteten Struktur-Wirkbeziehungen stützen dabei den vorhergesagten Bindungsmodus. In einem weiteren Ansatz wurden Pyrrolidin Derivate, die ursprünglich als HIV-1 Protease Inhibitoren synthetisiert wurden, auf Plasmepsin-Hemmung getestet. In der Literatur sind einige Fälle beschrieben, bei denen HIV-1 Protease Inhibitoren gleichzeitig gute Hemmstoffe für Plasmepsine darstellen. Von insgesamt zwölf Molekülen zeigten die affinsten Liganden Ki Werte im nanomolaren Bereich. Für zwei Verbindungsklassen (Pyrrolidin-diol-diester und Pyrrolidindiamide) gelang es, plausible Bindungsmoden zu generieren. Mit den vorhandenen kristallographischen Informationen war es jedoch nicht möglich, einen sinnvollen Bindungsmodus für Pyrrolidindimethylenediamin-Derivate, die die dritte Verbindungsklasse darstellen, vorherzusagen. Da die Plasmepsine als sehr flexible Proteine bekannt sind, wurden Moleküldynamik (MD) Simulationen durchgeführt und mobile Bereiche innerhalb der Bindetasche genauer untersucht. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der MD Simulation konnte so ein Bindungsmodus für den Typ der Pyrrolidindimethylenediamin-Derivate erzeugt werden. Auch bei der Affinitätsdaten-Analyse einer Norstatin-Bibliothek, bei der die Verbindungen sich nur im P1-Substituenten unterschieden, konnten zunächst überraschende Ergebnisse mit Hilfe der MD Simulation erklärt werden. Eine konformative Öffnung der Plasmepsin II S1 Tasche wurde beobachtet, wodurch eine Anpassung an sperrige P1 Substituenten ermöglicht wird. So wurden durch die durchgeführte MD Simulation zahlreiche Erkenntnisse gewonnen, die von Relevanz für das strukturbasierte Wirkstoffdesign sind. Ausgehend von den Azepin Derivaten wurde in dieser Arbeit ein dritter Ansatz verfolgt, Plasmepsin Inhibitoren mit neuartigen Grundgerüsten zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde Ftrees (Feature Trees) verwendet, ein Computerprogramm, das durch seine Funktionsweise einen Übergang von einem Suchmolekül zu strukturell unähnlichen Molekülen „Scaffold Hopping“ ermöglichen soll. Eine Verbindung mit einem Thiophengrundgerüst fiel bei der Auswertung als besonders interessant auf und wurde auf die Plasmepsine getestet. Anfängliche Ki Werte im zweistellig mikromolaren Bereich konnten durch gezieltes Design um den Faktor 110 verbessert werden, was zu ersten Inhibitoren im nanomolaren Bereich führte. Insgesamt gelang es in dieser Arbeit durch unterschiedliche Ansätze Hemmstoffe für Plasmepsin II und IV vorherzusagen, bei denen die Struktur-Wirkbeziehungen mit den erzeugten Bindungsmoden weitestgehend übereinstimmten. Strukturlösungsversuche gelangen nur mit Pepstatin A, Moleküldynamiksimulationen gewährten dennoch einen Einblick in die hohe Flexibilität und stabile Konformationen der Plasmepsine. Daraus wurden Erkenntnisse für das strukturbasierte Wirkstoffdesign gewonnen, was zur Entwicklung neuer Malaria-Medikamente einen Beitrag leisten könnte

Editorial. Artificial Intelligence: New Opportunities for Chemical Research?

ISSN:0009-429

Finnlines Oyj:n liikuntaluotsitoiminnan kehittäminen

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää Finnlines Oyj:n liikuntavastaavien eli -luotsien toimintaa ja antaa heille konkreettisia työkaluja sekä neuvoja heidän toimintaansa laivaympä-ristössä. Projektin tarkoituksena oli, että luotsit pystyvät toiminnallaan jatkossa tavoittamaan laajemmin merihenkilöstöä sekä auttamaan henkilöstöä motivoitumaan liikkumiseen laivoilla. Tässä projektissa tutkittiin ensiksi kyselyllä merihenkilöstön motiiveja liikkumiseen laivatyö-jaksoilla sekä heidän kokemuksiaan liikuntaluotsien toiminnasta tähän asti. Kyselyyn vastasi yhteensä 83 henkilöä. Tulosten pohjalta suunniteltiin liikuntaluotseille kahden päivän koulutus, johon osallistui kahdeksan henkilöä Finnlines Oyj:n henkilöstöstä. Koulutuksen tavoitteena oli ohjatun oivaltamisen ja ongelmanratkaisujen avulla ohjata luotseja kehittämään yhdessä toimintatapoja merihenkilöstön liikuntamotivaation ja liikunta-aktiivisuuden edistämiseksi. Merihenkilöstöstä 54 % oli laivatyöjaksoilla liikunnallisesti passiivisia ja he motivoituivat liik-kumaan eniten sisäisistä motivaatiotekijöistä, kuten liikunnasta saadusta hyvän olon tunteesta. Vastaajista 43 % ei ollut kuullut liikuntaluotseista ja 83 % eivät olleet ollut luotsien kanssa tekemisissä. Koulutuksen tuloksena liikuntaluotsit suunnittelivat yhdessä laivoille toteutettaviksi konkreettiset liikuntakampanjat, jotka motivoivat laajalti merihenkilöstöä liikkumaan. Lisäksi he kehittivät tapoja tuoda omaa toimintaansa enemmän esille, kuten ilmoitustauluilla luotsien esittely, ja luotsien välisen yhteydenpitokanavan. Liikuntaluotsit ovat innokkaita ja liikunta-asioista kiinnostuneita vapaaehtoisia. He ovat oivaltaneet, että heidän aktiivisuudellaan on mahdollista saada paljon aikaan. Jatkossa luotsien ja heidän yhteyshenkilöidensä välinen yhteydenpito sekä suunniteltujen toimintojen toteuttaminen ovat merkittävässä asemassa luotsien toiminnan sekä motivaation ylläpitämiseksi