Mitochondria and PGC-1α in Aging and Age-Associated Diseases

Aging is the most significant risk factor for a range of degenerative disease such as cardiovascular, neurodegenerative and metabolic disorders. While the cause of aging and its associated diseases is multifactorial, mitochondrial dysfunction has been implicated in the aging process and the onset and progression of age-associated disorders. Recent studies indicate that maintenance of mitochondrial function is beneficial in the prevention or delay of age-associated diseases. A central molecule seems to be the peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator α (PGC-1α), which is the key regulator of mitochondrial biogenesis. Besides regulating mitochondrial function, PGC-1α targets several other cellular processes and thereby influences cell fate on multiple levels. This paper discusses how mitochondrial function and PGC-1α are affected in age-associated diseases and how modulation of PGC-1α might offer a therapeutic potential for age-related pathology

MTO1 mediates tissue specificity of OXPHOS defects via tRNA modification and translation optimization, which can be bypassed by dietary intervention

Mitochondrial diseases often exhibit tissue-specific pathologies, but this phenomenon is poorly understood. Here we present regulation of mitochondrial translation by the Mitochondrial Translation Optimization Factor 1, MTO1, as a novel player in this scenario. We demonstrate that MTO1 mediates tRNA modification and controls mitochondrial translation rate in a highly tissue-specific manner associated with tissue-specific OXPHOS defects. Activation of mitochondrial proteases, aberrant translation products, as well as defects in OXPHOS complex assembly observed in MTO1 deficient mice further imply that MTO1 impacts translation fidelity. In our mouse model, MTO1-related OXPHOS deficiency can be bypassed by feeding a ketogenic diet. This therapeutic intervention is independent of the MTO1-mediated tRNA modification and involves balancing of mitochondrial and cellular secondary stress responses. Our results thereby establish mammalian MTO1 as a novel factor in the tissue-specific regulation of OXPHOS and fine tuning of mitochondrial translation accurac

Kypho-IORT - a novel approach of intraoperative radiotherapy during kyphoplasty for vertebral metastases

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Instable and painful vertebral metastases in patients with progressive visceral metastases present a common therapeutic dilemma. We developed a novel approach to deliver intraoperative radiotherapy (IORT) during kyphoplasty and report the first treated case.</p> <p>Methods/Results</p> <p>60 year old patient with metastasizing breast cancer under chemotherapy presented with a newly diagnosed painful metastasis in the 12^ththoracic vertebra. Under general anaesthesia, a bipedicular approach into the vertebra was chosen with insertion of specially designed metallic sleeves to guide the electron drift tube of the miniature X-ray generator (INTRABEAM, Carl Zeiss Surgical, Oberkochen, Germany). This was inserted with a novel sheet designed for this approach protecting the drift tube. A radiation dose of 8 Gy in 5 mm distance (50 kV X-rays) was delivered. The kyphoplasty balloons (KyphX, Kyphon Inc, Sunnyvale) were inflated after IORT and polymethylmethacrylate cement was injected. The whole procedure lasted less than 90 minutes.</p> <p>Conclusion</p> <p>In conclusion, this novel, minimally invasive procedure can be performed in standard operating rooms and may become a valuable option for patients with vertebral metastases providing immediate stability and local control. A phase I/II study is under way to establish the optimal dose prescription.</p

Combined kyphoplasty and intraoperative radiotherapy (Kypho-IORT) versus external beam radiotherapy (EBRT) for painful vertebral metastases - a randomized phase III study

Background: The spine is the most frequent location of bone metastases. Local treatment aims at palliation of pain and, given the increased likelihood of long-term cancer survival, at local control. Kyphoplasty and intraoperative radiotherapy (Kypho-IORT) provided instantaneous pain relief in 70% of patients at the first day after the intervention and resulted in local control rates of &gt; 93% at 1 year in a recently conducted phase I/II trial. To assess its clinical value, we designed a phase III trial which tests Kypho-IORT against the most widespread standard-of-care, external beam radiotherapy (EBRT), in patients with painful vertebral metastases. Methods: This phase III study includes patients ≥50 years of age with up to 4 vertebral metastases and a pain score of at least 3/10 points on the visual/numeric analogy scale (VAS). Patients randomized into the experimental arm (A) will undergo Kypho-IORT (Kyphoplasty plus IORT with 8 Gy prescribed to 13 mm depth). Patients randomized into the control arm (B) will receive EBRT with either 30 Gy in 10 fractions or 8 Gy as a single dose. The primary end point is pain reduction defined as at least − 3 points on the VAS compared to baseline at day 1. Assuming that 40% of patients in the Kypho-IORT arm and 5% of patients in the control arm will achieve this reduction and 20% will drop out, a total of 54 patients will have to be included to reach a power of 0.817 with a two-sided alpha of 0.05. Secondary endpoints are evaluation of the percentage of patients with a pain reduction of at least 3 points at 2 and 6 weeks, local tumor control, frequency of re-intervention, secondary fractures/sintering, complication rates, skin toxicity/wound healing, progression-free survival (PFS), overall survival (OS) and quality of life. Discussion: This trial will generate level 1 evidence on the clinical value of a one-stop procedure which may provide instantaneous pain relief, long-term control and shortened intervals to further adjuvant (systemic) therapies in patients with spinal metastases. Trial registration Registered with ClinicalTrials.gov, number: NCT02773966. Registration date: 05/16/2016

Long-term survival in a child with severe encephalopathy, multiple respiratory chain deficiency and GFM1 mutations

BACKGROUND: Mitochondrial diseases due to deficiencies in the mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) can be associated with nuclear genes involved in mitochondrial translation, causing heterogeneous early onset and often fatal phenotypes. CASE REPORT: The authors describe the clinical features and diagnostic workup of an infant who presented with an early onset severe encephalopathy, spastic-dystonic tetraparesis, failure to thrive, seizures and persistent lactic acidemia. Brain imaging revealed thinning of the corpus callosum and diffuse alteration of white matter signal. Genetic investigation confirmed two novel mutations in the GFM1 gene, encoding the mitochondrial translation elongation factor G1 (mtEFG1), resulting in combined deficiencies of OXPHOS. DISCUSSION: The patient shares multiple clinical, laboratory and radiological similarities with the 11 reported patients with mutations involving this gene, but presents with a stable clinical course without metabolic decompensations, rather than a rapidly progressive fatal course. Defects in GFM1 gene confer high susceptibility to neurologic or hepatic dysfunction and this is, to the best of our knowledge, the first described patient who has survived beyond early childhood. Reporting of such cases is essential so as to delineate the key clinical and neuroradiological features of this disease and provide a more comprehensive view of its prognosis

Comprehensive Molecular Characterization of Pheochromocytoma and Paraganglioma

SummaryWe report a comprehensive molecular characterization of pheochromocytomas and paragangliomas (PCCs/PGLs), a rare tumor type. Multi-platform integration revealed that PCCs/PGLs are driven by diverse alterations affecting multiple genes and pathways. Pathogenic germline mutations occurred in eight PCC/PGL susceptibility genes. We identified CSDE1 as a somatically mutated driver gene, complementing four known drivers (HRAS, RET, EPAS1, and NF1). We also discovered fusion genes in PCCs/PGLs, involving MAML3, BRAF, NGFR, and NF1. Integrated analysis classified PCCs/PGLs into four molecularly defined groups: a kinase signaling subtype, a pseudohypoxia subtype, a Wnt-altered subtype, driven by MAML3 and CSDE1, and a cortical admixture subtype. Correlates of metastatic PCCs/PGLs included the MAML3 fusion gene. This integrated molecular characterization provides a comprehensive foundation for developing PCC/PGL precision medicine

Wechselwirkung des Cytochrom-bc1-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mit seinen Substraten sowie mit der Cytochrom-c-Oxidase

The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.Der Cytochrom-bc1-Komplex ist eines der Schlüsselenzyme in der Zellatmung und der Photosynthese. Charakteristisch für die Atmungskette und dem photosynthetischen Apparat ist eine supramolekulare Assoziation der individuellen Enzyme, an der auch der Cytochrombc1- Komplex beteiligt ist (z.B. Schägger and Pfeiffer, 2000, 2001). Der membranständige, aus mehreren Untereinheiten bestehende Enzymkomplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubichinol zum löslichen Cytochrom c. Dieser Elektronentransfer ist an eine Protonentranslokation zum Aufbau einen Protonengradienten über die Membran, in der das Enzym lokalisiert ist, gekoppelt. Der Mechanismus des Proteins wird durch den Q-Zyklus beschrieben, der auf getrennten aktiven Zentren zur Ubichinol Oxidation (P-Bindungsstelle) und Ubichinon Reduktion (N-Bindungstelle) basiert. Grundlegend für den Q-Zyklus ist eine Gabelung des Elektronentransfers am Zentrum P. Der molekulare Mechanismus des Enzyms ist noch nicht im Detail verstanden. Kontrolle und zeitlicher Ablauf des sich teilenden Elektronenflusses an der P-Bindungstelle und eventuelle Bildung eines instabilen Semichinons werden vielfältig diskutiert (z.B. Crofts, 2004; Rich, 2004). Weiterhin sind Substratbindung sowie Stabilität der Intermediate und Protonentransfer an beiden Bindungsstellen noch nicht klar erfasst. Die Kristallstruktur des Hefe Komplexes zeigt, dass beide aktive Zentren keinen direkten Zugang zum wässrigen Solvens haben, um einen direkten Protonenabgabe bzw. –aufnahme zu ermöglichen. Basierend auf der Struktur wurden Aminosäurereste identifiziert, die möglicherweise an den genannten Prozessen beteiligt sind (Hunte, et al., 2000; Lange, et al., 2002; Palsdottir, et al., 2003). In der vorliegende Arbeit wurde die Bindung von Ubichinol und Ubichinon sowie die postulierten Protonentransferwege an beiden aktiven Zentren mittels zielgerichterer Mutagenese und anschließender Charakterizierung der modifizierten Enzyme untersucht. Weiterhin wurde die Interaktion von Cytochrom c mit dem Cytochrom-bc1-Komplex analysiert. Als dritter Aspekt wurde die supramolekulare Assoziation zwischen Cytochrom-bc1- Komplex und der Cytochrome-c-Oxidase untersucht. An der P-Bindungstelle wurde die Bedeutung der Aminosäurereste E272, Y312 and F129 der katalytischen Untereinheit Cytochrom b untersucht. Es wird angenommen, dass E272 als primärer Ligand für Ubichinol und als Protonenakzeptor fungiert. Basierend auf Kristallstrukturen, die eine leere oder eine mit einem spezifischen Inhibitor besetzte P-Bindungsstelle aufweisen, wurde postuliert, dass sich die protonierte Seitenkette von E272 von dem oxidierten Substrat durch eine Rotation zu einem Netzwerk aus Wassermolekülen hinbewegt, die einen Transfer des Protons zum wässrigen Solvens ermöglichen (Hunte, et al., 2003; Crofts, 1999b). Y132 beteiligt sich möglicherweise durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken an der Stabilisierung dieses Netzwerkes (Hunte, et al., 2000). F129 interagiert vermutlich mit dem hydrophoben Teil des gebundenen Substrates und trägt so möglicherweise zur Stabilisierung eines eventuellen Intermediates bei (Ding, et al., 1995ab) Varianten des mitochondrial kodierten Cytochrom b wurden durch biolistisches Bombardement konstruiert. Die Variante Y132F zeigte eine um ~50% erniedrigte katalytische Aktivität. Zusammen mit einer kaum veränderten Dopplungszahl auf respiratorischen Medien deutet dies darauf hin, dass Y132 keine entscheidende Funktion in der Katalyse einnimmt. Es zeigte sich, dass die Substitution von E272 durch Glutamin oder Aspartat respiratorisches Wachstum und enzymatische Funktion des modifizierten Cytochrom-bc1-Komplexes zwar verlangsamen, aber nicht komplett verhinderen. In der ladungsneutralisierten Variante E272Q, die nicht mehr am Protonentransport beteiligt sein sollte, konnte eine Wechselzahl von ~13% des nativen Enzyms festgestellt werden. Dies zeigt eindeutig, dass E272 eine wichtige, jedoch keine essentielle Bedeutung für die Katalyse hat. Dies wurde auch durch eine unveränderte H+/e-- Stöchiometrie im Vergleich zum nativen Enzyme demonstriert. E272D und E272Q zeigten Resistenz gegenüber Stigmatellin, welches spezifisch in der distalen Domäne bindet. Die beobachtete Resistenz von E272D gegenüber dem Inhibitor zeigt, dass die Bindung von Stigmatellin sensitiv gegenüber der Seitenkettenlänge in dieser Position ist. Die im Reaktionszentrum beschriebene Bindung von Stigmatellin soll der Bindung eines Semichinons oder eines Chinolanions gleichen (Lancaster und Michel, 1997). Die Resistenz gegenüber Stigmatellin für E272D and E272Q weist somit vermutlich auf eine schwächere Bindung des Substrates oder eine weniger effiziente Ausbildung des aktiven Enzym-Substrat- Komplexes hin. In Übereinstimmung dazu zeigten Reduktionskinetiken, dass für E272D und E272Q der Elektronentransfer über das Rieske Protein zu Cytochrom c1 verlangsamt war. Die Reduktionskinetiken deuten darauf hin, dass die Ladung an Position 272 den Elektronentransfer zu Cytochrom b beeinflusste, wohingegen die Länge der Seitenkette eine stabile Wechselwirkung zwischen der P-Bindungstasche, Ubichinol und dem Rieske Protein ermöglichte. Die Ergebnisse der E272 Varianten deuten darauf hin, dass es einen zweiten alternativen Protontransferpfad geben muss, der selbst in E272Q eine korrekte, wenn auch verlangsamte Wirkungsweise des Enzyms ermöglicht. Derzeitige Untersuchungen widmen sich der strukturellen Analyse dieser Variante. Y132F zeigte eine Reduktion von Cytochrom c1 vergleichbar zur Situation im nativen Enzym, während Reduktion von Cytochrom b von einer schnellen Re-Oxidationsphase geprägt war. Dies erlaubt den Schluß, dass Y132 keinen Einfluß auf den ersten Elektronenübertragungsschritt nimmt, sondern vielmehr die Reduktion von Cytochrom b beeinflusst. Varianten von F129, F129K und F129R, zeigten kein Wachstum auf respiratorischen Medien. Dies weist auf eine elementare Bedeutung dieses Restes für die Katalyse hin. Zusätzlich zeigte F129 eine erniedrigte H+/e--Stöchiometrie im Vergleich zum nativen Enzym. Beide Varianten zeigten erniedrigte katalytische Aktivität. Durch die Substitutionen in den Varianten bedingte strukturelle Veränderungen in der P-Bindungstasche wurden durch Inhibitortitrationen und der Bestimmung des Km-Wertes für Decylubichinol untersucht. Für die Varianten Y132F und F129R/K konnte ein erhöhter Km-Wert festgestellt werden. Die beobachtete Resistenz von Y132F gegenüber Myxothiazol, einem Inhibitor der Domäne proximal zum Häm bL, und Resistenz von F129K/R gegenüber Inhibitoren beider, proximaler und distaler, Domänen deutet auf eine geschwächte Bindung des Substrates oder des eventuell auftretenden Intermediates hin. Die in F129R/K eingeführte Ladung stört möglicherweise die Interaktion dieses Restes mit dem hydrophoben Teil des Inhibitors bzw. des Substrates. Für F129K zeigte sich eine verlangsamte Cytochrom b Reduktion und eine schnelle Reoxidation der Hochpotentialkette. Dies deutet auf eine Veränderung des Redoxpotentials von Chinol/Semichinol/Chinon in der Bindungstasche hin. Eine Destabiliserung des Intermediates, die zu Seitenreaktionen führen kann, ist ebenfalls denkbar. Diese würde die beobachtete erhöhte Superoxidproduktion in F129K erklären und die vorgeschlagene Funktion von F129 in Koordination und Stabilisation des Substrates untermauern. In der N-Bindungsstelle, dem Ort der Ubichinon Reduktion, liegen die postulierten CL/K und E/R Protonentransferwege an gegenüberliegenden Seiten des gebundenen Substrates (Lange, et al., 2002). Im E/R Pfad wurde E52, das den möglichen Eintritt der Protonen in die Bindungstasche vermittelt, sowie R218 und N208 untersucht. Die beiden letztgenannten Reste sollen das Proton zu dem gebundenen Substrat leiten. Im CL/K Pfad wurde die Bedeutung der Cardiolipin- und der benachbarten PE-Bindungstasche untersucht. Es wird vermutet, dass beide Phospholipide den Eintritt der Protonen in das Protein für die Ubichinonreduktion vermitteln. Zusätzlich wurde der Einfluß von Substitutionen des Restes H85 untersucht. H85 stabilisiert ein Wassernetzwerk in der Bindungstasche des Chinons, das Zugang zum wässrigen Solvenz erlaubt. Die beiden Varianten R218M und R128K zeigten eine erniedrigte finale Wachstumsausbeute auf respiratorischen Medium im Vergleich zum Wildtyp. Dies deutet auf eine partiell entkoppelte Atmung hin, was durch eine erniedrigte H+/e- Stöchiometrie für R218M im Vergleich zum nativen Enzyme belegt wurde. Zusätzlich zeigte R218 nur ~20% der Wildtyp Wechselzahl. Dies deutet auf eine grundlegende Rolle von R218 im Katalysezyklus hin. N208V, eine weitere Variante im E/R Pfad, wies einen Rückgang in der katalytischen Aktivität von ~25% auf, was einer essentiellen Funktion dieses Restes widerspricht. Die Variante im CL-Bindungsmotiv (Substitution dreier Lysine durch Methionin) resultierte in Verlust der enzymatischen Aktivität des modifizierten Cytochrom-bc1-Komplexes und daher erfolgte kein Wachstum auf respiratorischen Medien. Die Variante des Restes E82Q welcher das PE-Molekül in der Nähe der Bindungstasche koordiniert, zeigte einen Verlust der enzymatischen Aktivität von über 80%. Diese Beobachtungen weisen eindeutig darauf hin, dass die Phospholipidbindungsstellen in der Nähe des aktiven Zentrums eine entscheidende Bedeutung für die Katalyse des Enzymkomplexes haben. Die grundlegende Rolle von E82 wurde durch die erniedrigte H+/e- Stöchiometrie in der Variante E82Q untermauert. Titrationen mit dem Inhibitor Antimycin, der spezifisch über die N-Bindungstelle wirkt, zeigten eine verringerte Sensitivität für alle untersuchten Varianten. Eine mögliche Erklärung zielt darauf hin, dass in allen Varianten die Bindungstasche im Vergleich zum nativen Enzym strukturell stark verändert vorliegt. Diese könnte die Bindung des Inhibitors negativ beeinflussen. Ähnlich kann es sich mit der Stabiliserung des intermediären Semichinonanions verhalten. Auf eine mögliche Destabilisierung des Intermediates weist auch eine Erhöhung der Km–Wertes für alle Varianten hin. Zusätzlich konnte eine Verlangsamung im Elektronentransfer in der N-Bindungstasche für alle Varianten beobachtet werden. Interessanterweise zeigten die untersuchten Modifikationen in der N-Bindungsstelle auch eine Beeinflussung der Kinetiken im Zentrum P. Bei allen Varianten zeigte sich eine Verlangsamung der Reduktion der Hochpotentialkette. Als besonders bemerkenswert ist N208V hervorzuheben. Diese Variante zeigte ein erhöhtes Reduktionniveau für Cytochrom b in Kombination mit einer Reoxidation von Cytochrom c1. Dies zeigt eine Einflussnahme dieses Restes auf die Elektronengabelung im aktiven Zentrum P auf. Möglicherweise wird die Kontrolle dieses aktiven Zentrums durch einen Aminosäurerest in der N-Bindungstasche dadurch bedingt, dass dieser Rest das Redoxpotential der b-Häme und damit den Elektronenfluß zwischen den beiden aktiven Zentren steuern. Untersuchungen zur Veränderungen in den Redoxpotentialen werden zur Zeit ausgeführt. Eine Einflussnahme der Substitutionen auf die Stabilisierung des Semichinon-Intermediates wird durch EPRspektroskopische Experimente untersucht. Der Elektronentransfer durch die Hochpotentialkette wird durch Reduktion des Elektronakzeptors Cytochrom c abgeschlossen. Kristallographische Untersuchungen zeigen eine kationische Pi-Interaktion zwischen F230 der Cytochrom c1 Untereinheit und R19 von Cytochrom c (Lange und Hunte, 2002). Zur Analyse der Funktion dieses Restes in Bindung und Reduktion von Cytochrom c wurden die beiden Varianten F230L und F230W untersucht. Beide Varianten zeigen eine erhöhte Dopplungszahl beim Wachstum auf respiratorischen Medium einhergehend mit einer auf ~30-40% erniedrigten Wechselzahl des isolierten Enzyms. F230L zeigt eine Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität von der Ionenstärke analog dem nativen Enzym, wobei keine spezies-spezifische Bevorzugung des nativen Substrates festgestellt werden konnte. Im Einklang mit dem Verlsut der hydrophoben Interaktionen in F230L konnte eine erhöhte Sensitivität gegenüber einer Veränderung in der Ionenstärke im Vergleich zum nativen Enzym in der Variante bei Bestimmung des Km- und KD-Wertes für das native Substrat beobachtet werden. Die Substitution von F230 durch Tryptophan beeinträchtigte die Bindung von Cytochrom c an das Membranprotein, was durch eine erniedrigte Bindung der Variante an eine Cytochrom c-Affinitätssäule gezeigt werden konnte. Zudem wies sich F230W ein verändertes Verhalten in Abhängigkeit von der Ionenstärke aus, was aus Brönsted-Plots und dem Elutionsverhalten von der Affinitätssäule ersichtlich war. Reduktionkinetiken enthüllten, dass in Abwesenheit von Cytochrom c, der Elektrontransfer in die Hochpotentialkette in F230W vergleichbar mit dem nativen Enzym war. Dies deutet daraufhin, dass die erniedrigte Wechselzahl für F230W einer schwächeren Bindung von Cytochrom c zuzuschreiben ist. F230L zeigte eine Reoxidation von Cytochrom c1. Da beobachtet wurde, daß die Bindung von Cytochrom c and F230L bei moderater Ionenstärke vergleichbar mit dem nativen Cytochrom-bc1-Komplex ist, erklärt sich die verringerte enzymatische Aktivität dieser Variante sehr vermutlich durch die Veränderungen im Elektronenfluß. Der beobachtete Elektronenrückfluß deutet auf Veränderung des Redoxpotential von Cytochrom c1 hin. Somit deutet sich an, dass F230 nicht nur für die Bindung von Cytochrom c wichtig ist, sondern auch den Elektronentransfer zu Cytochrom c1 beeinflusst. Es ist desweiteren erwähnenswert, dass in beiden F230 Varianten eine Verlangsamung der Kinetik in der N-Bindungstelle zu beobachten war. Dies deutet an, dass die Cytochrom c Bindungsstelle mit dem aktiven Zentrum zur Chinon Reduktion „kommuniziert“. Eine entsprechende Hypothese wurde ebenfalls aufgrund der Struktur des Ko-Komplexes formuliert. Dort wurde beobachtet, das Cytochrom c nur an eines der beiden Monomere des Komplexes bindet. Die N-Bindungstelle desselben Monomers war mit Ubichinon besetzt, wohingegen das andere Monomer eine leere N-Bindungstasche und keine Cytochrom c Bindung aufwies (Lange und Hunte, 2002). In Hefe wird eine bevorzugte Assoziation zwischen dem Cytochrom bc1 Komplex und der Cytochrom c Oxidase beschrieben (Schägger und Pfeiffer, 2000). Eine besondere Bedeutung hat vermutlich das an Cytochrom-bc1-Komplex gebunden Cardiolipin in der Nähe der N-Bindungsstelle. Zur Untersuchung der supramolekularen Assemblierung der beiden Enzyme wurden Mitochondrienmembranen, die einen Cytochrom-bc1-Komplex mit einem Histidin- Affinitätspeptid enthielten, mit dem milden Detergenz Digitonin solubilisert. Solubiliserung und Aufreinigung in Gegenwart von Laurylmaltoside resultierte in einem reinen, vollständig assemblierten und aktiven Cytochrom-bc1-Komplex. In einem Silber-gefärbten SDS-Gel zeigte die Elutionsfraktion der Aufreingung mit Digitonin im Vergleich zur Aufreinigung in Gegenwart von Laurylmaltosid zusätzliche Banden, die anhand von immunologischen Untersuchungen und der bekannten Größe Cytochrom-c-Oxidase Unterheiten zugeschrieben wurde. Die Anwesenheit beider Enzyme in der Elutionsfraktion konnte ebenfalls durch enzymspezifische Aktivitätstests festgestellt werden. Jedoch zeigten diese Untersuchungen als auch die Bandenintensität im gefärbten SDS-Gel eine substöchiometrische Zusammensetzung der vermuteten Chinol:Cytochrom-c-Oxidase. Zukünftige Untersuchungen zielen auf eine Optimierung der Aufreinigung hin. Die Bedeutung der Cardiolipin-Bindungsstelle am Cytochrom-bc1-Komplex wurde durch Blau-Native(BN)-PAGE and 2D-Elektrophorese von Varianten des CL-Bindungsmotivs in An- und Abwesenheit des Phospholipids untersucht. Es zeigte sich, daß bei Anwesenheit von CL auch bei vollkommener Substitution der CL-bindenden Lysinreste Superkomplexbildung möglich ist. Bei Abwesenheit von CL zeigt sich bei nativer CL-Bindungsstelle keine Assemblierung der beiden Komplexes. Bei Substitutionen zweier Lysine im CL-Bindungsmuster kann die Superkomplexbildung jedoch wieder beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, daß CL die Ladungen der Lysine neutralisiert und somit die bekannte ladungssensitive Assemblierung ermöglicht. Die erhaltenen Ergebnisse erlauben Aussagen über die Kontrolle von Elektronentransfer und Substratbindung in den beiden aktiven Zentren. Für die N-Bindungsstelle konnten sowohl die Rolle der gebundenen Phospholipide in der Katalyse als auch die postul

Keep the fire burning: Current avenues in the quest of treating mitochondrial disorders

Mitochondrial diseases are very heterogeneous in their genetic cause and clinical manifestation. During the last few decades progress has been made in the diagnosis of mitochondrial diseases, but an established therapy is so far lacking. Several experimental strategies targeting different points of intervention are currently being assessed world-wide. Numerous mouse models of OXPHOS disorders have become available enabling further optimization and validation of therapeutic strategies and paving the way for future clinical trials. In this review, we provide an update on current developments towards treatment as well as the potential and status of transition into therapeutic use. (C) 2015 Elsevier B.V. and Mitochondria Research Society. All rights reserved