ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE Brassica oleracea var. capitata EM MODELOS EXPERIMENTAIS IN VITRO

http://dx.doi.org/10.5902/223613086427The ability of microorganisms, especially bacteria become resistant, has been widelydiscussed in various publications, and plants are one source to search for new drugs that each dayhas become more necessary. This work aimed to evaluate different ways of preparing extracts ofBrassica oleracea var. capitata and test them fronts strain of Staphylococcus aureus using the teston solid medium by diffusion in agar and in liquid medium in the ELISA plate. Tests revealed thatextracts obtained by solvent extraction and decoction hydroalcoholic acid have greater appeal tothe search for new drugs with activity against S. aureus, and the latter fractions obtained by liquidliquidpartition relating to solvents ethyl acetate, dichloromethane and hydroalcoholic remainingfraction showed more efficient. As for the solid medium, there was a lack of antibacterial activityof hydroalcoholic extract. However, a strong antibacterial activity was observed when analyzed inthe same extracts in liquid medium. Ethanolic extracts with concentrations of 50 and 70% showedbetter results when evaluated for 8 h of incubation. Different results were observed when theperiod was bent where the concentrations became more expressive of the 70 and 80%. The resultsdemonstrate that the species is a potential source of antibacterial agents. However, the choice ofsolvent, the extraction method and the bacterial growth medium should be considered. The datashown here motivates further studies for the isolation and identification of the active principlesresponsible for the antibacterial activity that can be used in the pharmaceutical industry, becauseof the large number of resistance to existing antibacterial drugs.http://dx.doi.org/10.5902/223613086427A capacidade dos microrganismos, em especial, das bactérias se tornarem resistentes, tem sido amplamente abordada em diversas publicações, e as plantas são uma das fontes para busca de novos medicamentos, que a cada dia vem se tornando mais necessário. Este trabalho, teve por objetivo avaliar diversas formas de preparação de extratos de Brassica oleracea var. capitata e testá-las frentes a cepa de Staphylococcus aureus utilizando ensaio em meio sólido por difusão em ágar, e em meio líquido em placa de ELISA. Os testes revelaram que extratos obtidos por decocção e extração em solvente hidroalcoólico ácido possuem maior apelo para a busca de novos fármacos com atividade frente a S. aureus, sendo que deste último as frações obtidas por partição líquido-líquido referentes aos solventes acetato de etila, diclorometano e a fração hidroalcoólica remanescente apresentaram mais eficientes. Já para o meio sólido, verificou-se uma ausência de atividade antibacteriana do extrato hidroalcóolico. Entretanto, uma considerável atividade antibacteriana foi evidenciada nos mesmos extratos quando analisados em meio líquido. Os extratos com concentrações etanólica de 50 e 70% revelaram melhores resultados quando avaliados por 8h de incubação. Resultados diferentes foram observados quando o período foi dobrado, onde as concentrações mais expressivas passaram a ser as de 70 e 80%. Os resultados demonstram que a espécie é uma potencial fonte de agentes antibacterianos. Entretanto, a escolha do solvente, o método de extração e o meio de crescimento bacteriano devem ser considerados. Os dados aqui evidenciados motiva posteriores estudos para o isolamento e identificação dos princípios ativos responsáveis pela atividade antibacteriana que podem ser usadas na indústria farmacêutica, visto o grande número de resistência às drogas antibacterianas já existentes

Purification and characterization of Leishmania chagasi promastigotes heparin binding protein: implications on the parasite infectivity

A leishmaniose visceral é uma doença humana fatal causada pelo protozoário intracelular Leishmania infantum/chagasi. A captação de promastigotas de Leishmania por células do hospedeiro é um processo mediado por receptores clássicos que iniciam a fagocitose. A busca por moléculas que estejam envolvidas no processo de infecção da célula do hospedeiro pelo parasito é importante para a concepção de estratégias para o controle da doença. Entre estas moléculas estão a Proteína Ligante de Heparina (PLH), uma lectina do grupo das proteínas ubíquas, cuja característica principal é a capacidade de se ligar a carboidratos presentes em glicoproteínas ou glicolípidos. A presença dessas moléculas em espécies de Leishmania é pouco estudada. Portanto, neste trabalho, a presença de PLH em formas promastigotas de L. chagasi foi avaliada, assim como o seu papel no processo de infecção do parasito. PLH de L. chagasi (PLHLc) foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de heparina-agarose em sistema automatizado FPLC e a produção de anticorpos policlonais antiPLHLc foi realizada. Nós verificamos a afinidade do anticorpo pela proteína e sua localização por intermédio de ensaios de Western blotting e imunomarcação. Uma vez detectada, utilizamos o anticorpo antiPLHLc e heparina sódica como agentes bloqueadores da PLH e investigamos o efeito causado pelo seu bloqueio no processo de infecção de macrófagos J774 in vitro. Pudemos verificar que esta proteína é um importante receptor que medeia o processo de infecção parasitário. Seu bloqueio gerou uma redução parcial no processo de adesão e internalização de Leishmania. De acordo com os resultados apresentados, acredita-se que esta proteína com atividade lectínica possa se tornar, a partir de estudos futuros in vivo, uma alternativa profilática ou terapêutica para resolução da leishmaniose visceral.Visceral leishmaniasis is a fatal human disease caused by the intracellular protozoan parasite Leishmania infantum/chagasi. The uptake of Leishmania promastigotes by host cells is a process mediated by classics receptors that initiate phagocytosis. The search for molecules that are involved in the infection process of the parasite to the host cell is important to design strategies to disease control. Among these molecules is the Heparin Binding Protein (HBP), a lectin of the group of ubiquitous proteins, whose main characteristic is to bind to carbohydrates present in glycoproteins or glycolipids. The presence of these molecules in Leishmania species is poorly studied. Therefore, in this work, the presence of HBP in L. chagasi promastigotes was assessed, as well its role in the parasite infection process. L. chagasi HBP was purified by affinity chromatography on a heparin-agarose column in FPLC automated system and the production of polyclonal antibody antiHBPLc was performed. We checked the affinity of the antibody for the protein and found the location of this in the parasite performing Western blotting and immunolabeling tests. Once detected, the antibody antiHBPLc and heparin were used as blocking agents of HBP and the effect caused by the blockage was investigated in the infection of J774 macrophages in vitro. We were able to verify that this protein is an important receptor that mediates the process of parasitic infection. Its blocking has generated a partial reduction in the accession and internalization of Leishmania by phagocytic cells. According to the results, it is believed that this protein may become, in in vivo future studies, a therapeutic alternative for resolution of visceral leishmaniasis.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Characterization of Leishmania infantum chagasi LPG3 protein as heparin binding protein and evaluation of its application in the LVC immunodiagnosis

Leishmania infantum chagasi é um protozoário intracelular responsável por causar uma doença fatal em humanos, a leishmaniose visceral. Identificar moléculas que estejam envolvidas no processo de infecção da célula do hospedeiro pelo parasito é importante para a concepção de estratégias para o controle da doença. Dentre estas moléculas estão as Proteínas Ligantes de Heparina (PLH’s), cuja característica principal é a capacidade de se ligar a carboidratos presentes em glicoproteínas ou glicolipídios. Há evidências de que PLH’s presentes na superfície de Leishmania participam dos processos de adesão e penetração dos parasitos nos tecidos e células, tanto dos hospedeiros vertebrados quanto dos invertebrados. Portanto, compreender as interações entre a PLH de L. chagasi (PLHLc) e o açúcar ao qual ela se liga, a heparina, bem como demonstrar propriedades da proteína, é importante para desenvolver mecanismos que interrompam a progressão da infecção. Este trabalho foi dividido em dois manuscritos onde foi proposto para o primeiro identificar e realizar análises estruturais in silico e análises funcionais da PLHLc. A proteína foi sequenciada e identificada como sendo a proteína LPG3 de L. infantum chagasi, que foi então sintetizada, clonada e a composição da sua estrutura foi determinada. Cromatografia de gel filtração, eletroforese em gel não desnaturante e ensaio de cross- linking sugerem que a rPLHLc/LPG3 está organizada como um tetrâmero. Calorimetria de titulação isotérmica confirma a capacidade da proteína em se ligar a heparina com afinidade micromolar. A inibição da atividade ATPásica pela presença da heparina, juntamente com as análises in silico, sugerem que o sítio de ligação a heparina sobrepõe ao sitio de ligação ao ATP. No segundo trabalho a proteína recombinante produzida foi avaliada para o imunodiagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina apresentando sensibilidade de 79-87% e especificidade de 63-83%, indicando o potencial da rPLHLc/LPG3 recombinante no diagnóstico imunológico da LVC.Leishmania infantum chagasi is an intracellular protozoan parasite responsible for causing a fatal disease in humans, visceral leishmaniasis. Identification of molecules from the parasites involved in the host cell infection process is important for designing strategies to control this disease. Among these molecules is Heparin Binding Protein (HBP), whose main characteristic is the ability to bind to carbohydrates present in glycoproteins or glycolipids. Evidence suggests that HBP's present on Leishmania surface participate in the adhesion of parasites to tissues of both vertebrate and invertebrate hosts as well as in cell invasion. Therefore, understanding the interactions between L. chagasi HBP (HBPLc) and the sugar to which it binds, heparin, as well as demonstrating protein properties, is important to develop mechanisms that interrupt the infection progression. This work was divided into two manuscripts where it was proposed to first identify and perform in silico structural and functional PLHLc analyzes. The protein was sequenced and identified as the L. infantum chagasi LPG3 protein, which was then synthesized, cloned and the composition of its structure determined. Gel filtration chromatography, non-denaturing gel electrophoresis and cross-linking assay suggest that rPLHLc/LPG3 is organized as a tetramer. Isothermal titration calorimetry confirms the ability of the protein to bind heparin with micromolar affinity. Inhibition of ATPase activity by the presence of heparin, together with in silico analyzes, suggests that the heparin binding site overlaps the ATP binding site. In the second study, the recombinant protein was evaluated for the Canine Visceral Leishmaniasis immunodiagnosis presenting a sensitivity of 79-87% and specificity of 63-83%, indicating the potential of recombinant rPLHLc/LPG3 in the immunological LVC diagnosis.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Leishmania chagasi heparin-binding protein: Cell localization and participation in L. chagasi infection

Visceral leishmaniasis is a fatal human disease caused by the intracellular protozoan parasite Leishmania chagasi that is captured by host cells in a process involving classics receptors mediated phagocytosis. The search for molecules involved in this process is important to design strategies to disease control. In this work, we verified the presence of heparin-binding protein (HBP) in L. chagasi promastigotes forms. HBP is a lectin of the group of ubiquitous proteins, whose main characteristic is to bind to carbohydrates present in glycoproteins or glycolipids, which is poorly studied in Leishmania species. L. chagasi HBP (HBPLc) was purified by affinity chromatography using heparin–agarose column in FPLC automated system. Its localization in the parasite was assessed by immunolabeling and electronic transmission microscopy tests using anti-HBPLc polyclonal antibodies, which showed HBP spread over the parasite outer surface and internally next to the kynetoplast. In addition, we verified that HBPLc participates in the process of parasite infection, since its blocking with heparin generated a partial reduction in the internalization of Leishmania by RAW macrophages “in vitro”. According to these results, it is believed that, in further “in vivo” studies, interference on this parasitic protein may provide us prophylactic and therapeutic alternatives against visceral leishmaniasis

Lipophosphoglycan 3 From Binds Heparin With Micromolar Affinity

Leishmania infantum chagasi is an intracellular protozoan parasite responsible for visceral leishmaniasis, a fatal disease in humans. Heparin-binding proteins (HBPs) are proteins that bind to carbohydrates present in glycoproteins or glycolipids. Evidence suggests that HBPs present on Leishmania surface participate in the adhesion and invasion of parasites to tissues of both invertebrate and vertebrate hosts. In this study, we identified the product with an HSP90 (heat shock protein 90) domain encoded by lipophosphoglycan ( LPG3 ) gene as a L infantum chagasi HBP (HBP Lc ). Structural analysis using the LPG3 recombinant protein suggests that it is organized as a tetramer. Binding analysis confirms that it is capable of binding heparin with micromolar affinity. Inhibition of adenosine triphosphatase activity in the presence of heparin, molecular modeling, and in silico docking analysis suggests that heparin-binding site superimposes with the adenosine triphosphate–binding site. Together, these results show new properties of LPG3 and suggest an important role in leishmaniasis

Supplementary_Material – Supplemental material for Lipophosphoglycan 3 From <i>Leishmania infantum chagasi</i> Binds Heparin With Micromolar Affinity

<p>Supplemental material, Supplementary_Material for Lipophosphoglycan 3 From <i>Leishmania infantum chagasi</i> Binds Heparin With Micromolar Affinity by Thaís Viana Fialho Martins, Ana Eliza Zeraik, Natália Oliveira Alves, Leandro Licursi de Oliveira, Tiago Antônio de Oliveira Mendes, Ricardo DeMarco and Eduardo de Almeida Marques-da-Silva in Bioinformatics and Biology Insights</p