Comparison of three experimental designs employed in gentamicin microbiological assay through agar diffusion

Gentamicin is a broad-spectrum antibiotic complex produced by actinomycetes belonging to Micromonospora genus and classified among aminoglycoside antibiotics, used in the treatment of serious infections derived from Gram-negative microorganisms. Alterations of their antimicrobial activity not shown in chemical assays can be evaluated through microbiological assays. The aim of this work was to compare 5 x 1, 2 x 2 and 3 x 1 experimental designs, evaluating validation parameters of specificity, linearity, range, precision, and accuracy for each experimental design in different levels of concentration, presentation, and lots. It consisted of 81 assays (in 3 replicas) of gentamicin microbiological dosage. The concentrations of the solutions used were employed in a range from 1.0 μg/mL to 5.0 μg/mL, diluted in phosphate buffer 0.1 M pH 8.0. Antibiotic medium number 11 was used, with Staphyloccocus epidermis (ATCC 12228). 21ml of medium were used as base layer and 4 ml of medium inoculated at 1% were used as surface layer. The dishes were incubated for 18 hours at 37 ± 1 ºC. The three designs employed showed adequate specificity for analysis of dermatological cream and injectable solution containing gentamicin sulphate. They also showed accuracy and linearity in the range evaluated, but not a significant difference concerning precision. The results were compared by means of the determination of the rates of measurement system capacity. The statistical analysis demonstrated that there is no significant difference among the results obtained through 5 x 1, 2 x 2, and 3 x 1, being these equivalent and interchangeable.A gentamicina é um complexo antibiótico de largo espectro, produzido por actinomicetos do gênero Micromonospora e classificado entre os antibióticos aminoglicosídeos, utilizado no tratamento de infecções graves, devidas a microrganismos Gram-negativos. Alterações da sua atividade antimicrobiana, não demonstradas pelos ensaios químicos, podem ser avaliadas pelos ensaios microbiológicos. O objetivo deste trabalho foi comparar os delineamentos experimentais 5 x 1, 2 x 2 e 3 x 1, avaliando-se os parâmetros de validação de especificidade, linearidade, faixa ou intervalo, precisão e exatidão para cada delineamento experimental em diferentes níveis de concentração, apresentações e lotes. O plano de trabalho constituiu-se na realização de 81 ensaios (em 3 réplicas) de doseamento microbiológico de gentamicina. As concentrações das soluções empregadas foram preparadas numa faixa de 1,0 μg/mL a 5,0 μg/mL, diluídos em tampão fosfato 0,1 M pH 8,0. O meio utilizado foi o meio antibiótico no. 11, com Staphyloccocus epidermidis (ATCC 12228). Empregou-se 21 mL de meio como camada base e 4 mL de meio inoculado à 1% como camada superfície. As placas foram incubadas por 18 horas à 37 ± 1 °C. Os três delineamentos empregados apresentaram especificidade adequada para análise de creme dermatológico e solução injetável contendo sulfato de gentamicina. Também apresentaram exatidão e linearidade no intervalo avaliado. Os delineamentos não apresentaram diferença significativa quanto a precisão. Os resultados foram comparados através da determinação de índices de capacidade do sistema de medição. A analise estatística demonstrou que não há diferença significativa entre os resultados obtidos pelos delineamentos 5 x 1, 2 x 2 e 3 x 1, sendo equivalentes e intercambiáveis

Comparison of three experimental designs employed in gentamicin microbiological assay through agar diffusion

Gentamicin is a broad-spectrum antibiotic complex produced by actinomycetes belonging to Micromonospora genus and classified among aminoglycoside antibiotics, used in the treatment of serious infections derived from Gram-negative microorganisms. Alterations of their antimicrobial activity not shown in chemical assays can be evaluated through microbiological assays. The aim of this work was to compare 5 x 1, 2 x 2 and 3 x 1 experimental designs, evaluating validation parameters of specificity, linearity, range, precision, and accuracy for each experimental design in different levels of concentration, presentation, and lots. It consisted of 81 assays (in 3 replicas) of gentamicin microbiological dosage. The concentrations of the solutions used were employed in a range from 1.0 μg/mL to 5.0 μg/mL, diluted in phosphate buffer 0.1 M pH 8.0. Antibiotic medium number 11 was used, with Staphyloccocus epidermis (ATCC 12228). 21ml of medium were used as base layer and 4 ml of medium inoculated at 1% were used as surface layer. The dishes were incubated for 18 hours at 37 ± 1 ºC. The three designs employed showed adequate specificity for analysis of dermatological cream and injectable solution containing gentamicin sulphate. They also showed accuracy and linearity in the range evaluated, but not a significant difference concerning precision. The results were compared by means of the determination of the rates of measurement system capacity. The statistical analysis demonstrated that there is no significant difference among the results obtained through 5 x 1, 2 x 2, and 3 x 1, being these equivalent and interchangeable.A gentamicina é um complexo antibiótico de largo espectro, produzido por actinomicetos do gênero Micromonospora e classificado entre os antibióticos aminoglicosídeos, utilizado no tratamento de infecções graves, devidas a microrganismos Gram-negativos. Alterações da sua atividade antimicrobiana, não demonstradas pelos ensaios químicos, podem ser avaliadas pelos ensaios microbiológicos. O objetivo deste trabalho foi comparar os delineamentos experimentais 5 x 1, 2 x 2 e 3 x 1, avaliando-se os parâmetros de validação de especificidade, linearidade, faixa ou intervalo, precisão e exatidão para cada delineamento experimental em diferentes níveis de concentração, apresentações e lotes. O plano de trabalho constituiu-se na realização de 81 ensaios (em 3 réplicas) de doseamento microbiológico de gentamicina. As concentrações das soluções empregadas foram preparadas numa faixa de 1,0 μg/mL a 5,0 μg/mL, diluídos em tampão fosfato 0,1 M pH 8,0. O meio utilizado foi o meio antibiótico no. 11, com Staphyloccocus epidermidis (ATCC 12228). Empregou-se 21 mL de meio como camada base e 4 mL de meio inoculado à 1% como camada superfície. As placas foram incubadas por 18 horas à 37 ± 1 °C. Os três delineamentos empregados apresentaram especificidade adequada para análise de creme dermatológico e solução injetável contendo sulfato de gentamicina. Também apresentaram exatidão e linearidade no intervalo avaliado. Os delineamentos não apresentaram diferença significativa quanto a precisão. Os resultados foram comparados através da determinação de índices de capacidade do sistema de medição. A analise estatística demonstrou que não há diferença significativa entre os resultados obtidos pelos delineamentos 5 x 1, 2 x 2 e 3 x 1, sendo equivalentes e intercambiáveis

The biocompatibility of cardiovascular graft materials: a comparison between bovine pericardial tissue and Dacron(R)

During the past 25 years, numerous studies relating to medical device biocompatibility have appedared world-wide. Development of biomaterials for grafting cardiovascular applications has contributed to an increase in knowledge of the compatibility between synthetic or biological surfaces and blood. The biocompatibility of one of the materials most commonly used in the fabrication of xenograft heart valves, bovine pericardium, treated with glutaraldehyde and formaldehyde is assessed comparison to a synthetic material, Dacron(R) tricot. An in vitro tissue culture assay, by the agar overlay method, using RC-IAL and Hela cell lines, was applied to treated pericardium and attested the intense toxicity of the treating agents. The subcutaneous grafting of treated pericardium and Dacron(R) was carried out in Wistar rats of 1 to 3 months of age. After the use of the usual histological methods, an evaluation of hematoxylin-eosin stained specimens demonstrated an absence of histocompatibility, mainly as regards for the formaldehyde treated pericardium. Comparatively, the evaluation of implanted Dacron(R) confirmed it's perfect biocompatibility. In conclusion, some improvement in xenograft heart valves is necessary, before the surgical implantation procedure takes place.Durante os últimos 25 anos, numerosos estudos têm sido efetuados visando a biocompatibilidade de materiais de uso médico-hospitalar. Isto se deve ao desenvolvimento de materiais destinados às próteses particularmente na área cardiovascular, o que motivou pesquisas relativas à problemática da compatibilidade entre superfícies biológicas ou sintéticas e o sangue. O presente trabalho objetivou comparar a avaliação da biocompatibilidade do pericárdio bovino, um dos materiais mais empregados na fabricação de válvulas cardíacas protéticas, após tratamento com glutaraldeído e formaldeído, com o material sintético conhecido como tricot de Dacron(R). Tanto fragmentos de pericárdio submetidos a diferentes tratamentos, como os de Dacron(R) foram implantados subcutaneamente na região abdominal de ratos Wistar, por períodos de 1 a 3 meses. O exame de cortes histológicos obtidos por métodos convencionais evidenciou ausência de biocompatibilidade principalmente para o pericárdio tratado com formaldeído. Para o Dacron(R), foi constatado, comparativamente, uma perfeita biocompatibilidade. A cultura de células in vitro, com o uso de linhagens RC-IAL e Hela pelo método de revestimento com ágar, foi empregada exclusivamente para o material de origem biológica e evidenciou um grau intenso de toxicidade associado ao resíduo do agente de tratamento. Concluiu-se que existe a necessidade do aperfeiçoamento da técnica de lavagem da prótese biológica antes da implantação.Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de FarmáciaEscola Paulista de Medicina Departamento de Morfologia Disciplina de HistologiaUNIFESP, EPM, Depto. de Morfologia Disciplina de HistologiaSciEL

Reutilização simulada de produtos médico-hospitalares de uso único, submetidos à esterilização com óxido de etileno

Objetivando avaliar o risco/benefício da reutilização de produtos médico-hospitalares de uso único, aplicaram-se dois desafios simulados: um com esporos de Bacillus subtilis e outro com endotoxina bacteriana da Escherichia coli, em corpos de prova representados por cateteres intravenosos, torneira três vias e tubos de traqueostomia. Estes foram submetidos a ciclos de reprocessamentos simulados, sendo 300 unidades intencionalmente contaminadas com B. subtilis (107 ufc/unidade) e outro grupo de 90 unidades contaminadas com endotoxina bacteriana (200 UE/ unidade). Os corpos de prova contaminados com B. subtilis foram lavados, enxaguados, secados e esterilizados em ETO/CFC 12:88. Os contaminados com endotoxina bacteriana foram submetidos à secagem, embalados e esterilizados. Após cada ciclo, dez unidades de cada corpo de prova contaminadas com B. subtilis foram avaliadas por contagem microbiana, testes de esterilidade, citotoxidade in vitro e microscopia eletrônica de varredura. Dos contaminados com endotoxina bacteriana, três de cada foram submetidos ao teste turbidimétrico após cada ciclo. No desafio com B. subtilis, verificou-se a presença de carga viável até 103 ufc e ocorreram danos na integridade física dos corpos de prova após o décimo reprocessamento, mas não se evidenciou toxicidade. No outro desafio, verificou-se aumento progressivo da porcentagem recuperada de endotoxina bacteriana. Frente a estes resultados, tal prática não é recomendada

Evaluation of cytochrome P-450 concentration in Saccharomyces cerevisiae strains

Saccharomyces cerevisiae has been widely used in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system, capable of metabolizing promutagens to active mutagens. There are a large number of S. cerevisiae strains with varying abilities to produce cytochrome P-450. However, strain selection and ideal cultivation conditions are not well defined. We compared cytochrome P-450 levels in four different S. cerevisiae strains and evaluated the cultivation conditions necessary to obtain the highest levels. The amount of cytochrome P-450 produced by each strain varied, as did the incubation time needed to reach the maximum level. The highest cytochrome P-450 concentrations were found in media containing fermentable sugars. The NCYC 240 strain produced the highest level of cytochrome P-450 when grown in the presence of 20 % (w/v) glucose. The addition of ethanol to the media also increased cytochrome P-450 synthesis in this strain. These results indicate cultivation conditions must be specific and well-established for the strain selected in order to assure high cytochrome P-450 levels and reliable mutagenicity results.Linhagens de Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente empregadas em testes de mutagenicidade devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias pró-mutagênicas à sua forma ativa. Devido à grande variedade de linhagens de S. cerevisiae com diferentes capacidades de produção de citocromo P-450, torna-se necessária a seleção de cepas, bem como a definição das condições ideais de cultivo. Neste trabalho, foram comparados os níveis de citocromo P-450 em quatro diferentes linhagens de S. cerevisiae e avaliadas as condições de cultivo necessárias para obtenção de altas concentrações deste sistema enzimático. O maior nível enzimático foi encontrado na linhagem NCYC 240 em presença de 20 % de glicose (p/v). A adição de etanol ao meio de cultura também produziu um aumento na síntese de citocromo P-450. Estes resultados indicam que as condições de cultivo devem ser específicas e bem definidas para a linhagem selecionada, garantindo assim elevados níveis de citocromo P-450 e, conseqüentemente, a confiabilidade nos testes de mutagenicidade.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Determination of apramycin in oral soluble powder by a HPLC method using pre-column derivatization with o-phthalaldehyde and UV detection

A high-performance liquid chromatographic method employing pre-column derivatization with o-phthalaldehyde (OPA) and 2-mercaptoacetic acid was developed for the determination of apramycin, an aminoglycoside antibiotic used in veterinary medicine, in the oral soluble powder form. The chromatographic separation was done by ion-pair HPLC using a C18 reversed-phase column, Synergy Hydro (150 mm x 4.6 mm x 4 µm) and mobile phase composed of 0.005 mol/L sodium octanosulfonate in a mixture of acetonitrile: water: acetic acid (45:55:2) (v/v/v) with a flow rate of 1.0 mL/min; the UV detector was operated at 332 nm. The developed method was validated according to official compendia guidelines, having demonstrated robustness, selectivity and linearity for the concentration range of 0.02 to 0.05 mg/mL, precision (with RSD < 2.0% both for intra and inter-day precision) accuracy (average recuperation of 99.33%) and detectivity (quantification and detection limits of 0.08 and 0.02 µg/mL, respectively). Three batches of commercial apramycin oral soluble powder were analyzed by both the proposed method and the official microbiological method, where all the results obtained were in the acceptable range (95% to 105% of labeled value of apramycin). Both methods were statistically compared by the t test, which yielded no significant differences (&#945; = 0.05) thereby confirming the equivalence of the methods.Foi desenvolvido um método por cromatografia líquida alta eficiência empregando derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e ácido mercaptoacético para determinação de apramicina, um antibiótico aminoglicosídeo de uso veterinário, em pó oral solúvel. A separação cromatográfica foi feita por fase reversa com pareamento iônico utilizando-se coluna Synergy Hydro C18 (150 x 4,6 mm x 4 µm) e fase móvel composta por octanossulfonato de sódio 0,005 mol/L em mistura de acetonitrila:água:ácido acético nas proporções 45:55:2 (v/v/v), numa vazão de 1.0 mL/min; efetuou-se detecção por UV a 332 nm. O método foi validado de acordo com os compêndios oficiais e demonstrou robustez, seletividade, linearidade na faixa de 0,02 a 0,05 mg/mL, precisão (com DPR < 2,0% tanto para a precisão intra-dia quanto para a precisão inter-dia), exatidão (recuperação média de 99,33%) e detectabilidade (limite de quantificação e de detecção iguais a 0,08 e 0,02 µg/mL, respectivamente). Analisaram-se 3 lotes de apramicina pó oral solúvel pelo método proposto e pelo método microbiológico oficial e todos os resultados obtidos estavam dentro do limite de aceitação (95%-105% valor rotulado de apramicina). Ambos os métodos foram comparados estatisticamente pelo teste t, não sendo encontradas diferenças significativas entre eles para &#945;=0,05, sendo os dois equivalentes

Evaluation of cytochrome P-450 concentration in Saccharomyces cerevisiae strains

Saccharomyces cerevisiae has been widely used in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system, capable of metabolizing promutagens to active mutagens. There are a large number of S. cerevisiae strains with varying abilities to produce cytochrome P-450. However, strain selection and ideal cultivation conditions are not well defined. We compared cytochrome P-450 levels in four different S. cerevisiae strains and evaluated the cultivation conditions necessary to obtain the highest levels. The amount of cytochrome P-450 produced by each strain varied, as did the incubation time needed to reach the maximum level. The highest cytochrome P-450 concentrations were found in media containing fermentable sugars. The NCYC 240 strain produced the highest level of cytochrome P-450 when grown in the presence of 20 % (w/v) glucose. The addition of ethanol to the media also increased cytochrome P-450 synthesis in this strain. These results indicate cultivation conditions must be specific and well-established for the strain selected in order to assure high cytochrome P-450 levels and reliable mutagenicity results.Linhagens de Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente empregadas em testes de mutagenicidade devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias pró-mutagênicas à sua forma ativa. Devido à grande variedade de linhagens de S. cerevisiae com diferentes capacidades de produção de citocromo P-450, torna-se necessária a seleção de cepas, bem como a definição das condições ideais de cultivo. Neste trabalho, foram comparados os níveis de citocromo P-450 em quatro diferentes linhagens de S. cerevisiae e avaliadas as condições de cultivo necessárias para obtenção de altas concentrações deste sistema enzimático. O maior nível enzimático foi encontrado na linhagem NCYC 240 em presença de 20 % de glicose (p/v). A adição de etanol ao meio de cultura também produziu um aumento na síntese de citocromo P-450. Estes resultados indicam que as condições de cultivo devem ser específicas e bem definidas para a linhagem selecionada, garantindo assim elevados níveis de citocromo P-450 e, conseqüentemente, a confiabilidade nos testes de mutagenicidade

Avaliação da esterilidade do instrumental laparoscópico de uso único reprocessado

Se trata de un estudio, experimental, de laboratorio y comparativo, que evaluó la eficacia de la esterilidad de los instrumentos laparoscópicos de uso único(ILUU): grasper, disector, tijera, aguja de Veres y el sistema de sonda electroquirúrgica, después de "contaminación desafío" con esporas bacterianas y sangre de carnero; los resultados de las pruebas de esterilidad fueron comparados con los de los instrumentos equivalentes "permanentes". Para efectuar la limpieza se utilizó: lavadora ultrasónica con chorro pulsante y detergente enzimático, limpieza manual, agua bajo presión y enjuague. Los ILUU fueron esterilizados con óxido de etileno, los instrumentos "permanentes" en autoclave. Las pruebas de esterilidad mostraron resultados 100% negativos para la recuperación de los microorganismos contaminantes en los dos grupos. Se concluye que, en relación al alcance de la esterilidad, es posible reprocesar los ILUU.O presente estudo, experimental, laboratorial e comparativo, teve como objetivo avaliar a eficácia da esterilidade dos instrumentos laparoscópicos de uso único (ILUU): grasper, dissector, tesoura, agulha de Veress e sistema de sonda de eletrocirurgia, após contaminação desafio com esporos bacterianos e sangue de carneiro, e comparar os resultados dos testes de esterilidade com aqueles dos instrumentos equivalentes "permanentes". Para limpeza, utilizou-se lavadora ultrassônica com jato pulsátil e detergente enzimático, limpeza manual, água sob pressão e enxágue. Os ILUUs foram esterilizados por óxido de etileno, os instrumentos "permanentes" em autoclave. Os testes de esterilidade acusaram resultados 100% negativos para a recuperação dos micro-organismos contaminantes, nos dois grupos. Concluiu-se que, em relação ao alcance da esterilidade, é possível reprocessar ILUU.This experimental, comparative, laboratory study evaluated the effectiveness of the sterilization of single-use laparoscopic instruments - SULIs (grasper, dissector, scissors, Veress needle and electrosurgical probe system), after contamination-challenge with bacterial spores and sheep blood, and compared the results of the sterilization tests with those of the equivalent reusable instruments. The cleaning methods used were; ultrasonic washer with pulsatile water jet and enzymatic detergent, manual cleaning, cleaning with pressurized water and rinsing. The SULIs were sterilized with ethylene oxide and the reusable instruments in an autoclave. Sterility tests showed 100% negative results for recovery of contaminate microorganisms in both groups. It was concluded that, regarding the sterilization, that it is possible to reprocess SULIs

Descontaminação de drogas vegetais empregando irradiação gama e óxido de etileno: aspectos microbianos e químicos

The sanitary quality of vegetal drugs, as well as the use of decontamination methods are important steps towards the consumer safety, mainly due to the fact that these products are usually used by sick and with weak immunocompromised persons. In Brazil, the RDC 48/ 2004 mention the contamination research as well as the efficacy of the decontaminated product. The purpose of this work is to evaluate the effects of ethylene oxide fumigation and gamma irradiation on the microbial burden and some chemical constituents of ginkgo and guarana. The initial microbial burden was 3,2x10(6), on average, for total aerobic microorganisms and 3,0x10(5) for fungi. Both methods proved to be effective in the microbial burden reduction. The analyses using high performance liquid chromatography revealed the absence of significant alterations in the flavonol glycosides and caffein contents, respectively for ginkgo and guarana.A avaliação da qualidade sanitária de drogas vegetais, bem como a utilização de métodos de descontaminação constituem importantes etapas no que se refere ao aspecto de segurança ao consumidor, principalmente pelo fato de serem usualmente consumidas por pessoas debilitadas, por vezes imunodeprimidas. No Brasil a RDC 48/2004 menciona a pesquisa de contaminantes microbiológicos bem como o estudo da eficácia dos agentes descontaminantes. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar os efeitos da fumigação com óxido de etileno e da irradiação gama sobre a carga microbiana, bem como determinar alterações nos constituintes químicos em amostras de Ginkgo biloba e Paulinia cupana H.B.K. (guaraná). A carga microbiana inicial foi, em média, 3,2x10(6) para microrganismos aeróbicos totais e 3,0x10(5) para fungos. Ambos os métodos de descontaminação apresentaram-se eficazes na redução da carga microbiana. As análises por cromatografia líquida de alta eficiência revelaram ausência de alterações significativas nos teores de glicosídeos flavonoídicos e cafeína, respectivamente para ginkgo e guaraná

Estimativa da incerteza em ensaio de detecção de endotoxina bacteriana pelo método de gelificação

Desde a publicação da ISO 17025:1999, o interesse em métodos para estimativa da incerteza em ensaios qualitativos, do tipo "passa/não passa", têm ganho grande importância. Uma forma de estimar e informar a incerteza deste tipo de ensaio é o uso das probabilidades de respostas-falsas, particularmente falsos-positivos e falsos-negativos, determinados a partir do teorema de Bayes. O objetivo deste artigo é estabelecer um método para a estimativa de incerteza em ensaios de detecção de endotoxina bacteriana pelo método in vitro Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Considerando a confirmação da sensibilidade do LAL e a validação do teste, a probabilidade de uma resposta falsa corresponde à soma da probabilidade dos resultados falso-negativos e falso-positivos. A partir dos resultados obtidos foi verificado que a etapa da confirmação da sensibilidade do LAL contribui para a incerteza de forma mais significativa (67,6%) que a etapa de validação do teste (32,4%). Através de um procedimento simples, descrito neste artigo, e de dados obtidos a partir da confirmação da sensibilidade do LAL e validação do teste para um produto em questão é possível obter uma estimativa de incerteza razoável para o ensaio de detecção de endotoxinas bacterianas pelo método de gelificação.Since the publication of ISO 17025:1999, the interest in methods for estimation of the uncertainty in qualitative analysis, such as 'pass/fail', have became more important. The usual form of estimating and informing the uncertainty in this kind of analysis is the use of false-response rates, particularly false-positive and false-negative, determinated from Bayes theorem. The aim of this paper is establish a method for estimation of the uncertainty in the detection of bacterial endotoxins by in vitro Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test. Considering the confirmation of LAL sensitivity and the validation of the test, the probability of a false-response corresponds to the sum of false-negative and false-positive result probabilities. From results obtained was verified that the confirmation of LAL sensitivity contributed to the uncertainty in a more significant way (67,6%) than the validation of the test (32,4%). Through this simple procedure and data obtained from the confirmation of LAL sensibility and the validation of the test is possible to obtain a reasonable estimation of the uncertainty of the detection of bacterial endotoxins by gel-clot test