Comparison between MALDI-TOF MS and FilmArray Blood Culture Identification panel for rapid identification of yeast from positive blood culture

In this study we evaluated MALDI-TOF MS and FilmArray methods for the rapid identification of yeast from positive blood cultures. FilmArray correctly identified 20/22 of yeast species, while MALDI-TOF MS identified 9/22. FilmArray is a reliable and rapid identification system for the direct identification of yeasts from positive blood cultures

UN CASO DI FEBBRE REUMATICA ACUTA: CARATTERISTICHE CLINICHE E MICROBIOLOGICHE

INTRODUZIONE La febbre reumatica acuta (ARF) è una patologia autoimmune che può insorgere a seguito di un’infezione faringea da Streptococcus pyogenes. Nonostante attualmente l’incidenza di ARF sia notevolmente diminuita nei paesi industrializzati, alcuni focolai si sono verificati in associazione con l’alta circolazione di determinati emm-type di S.pyogenes caratterizzati da fenotipo mucoso. In questo studio riportiamo un caso di ARF verificatosi in un bambino di una scuola elementare della provincia di Bologna. Inoltre descriviamo le caratteristiche microbiologiche del ceppo di S.pyogenes isolato dal suo tampone faringeo e dai campioni raccolti durante un programma di sorveglianza condotto nella sua classe. METODI Nel novembre 2012, ad un bambino di 11 anni viene diagnosticata una faringite da S.pyogenes, che, a seguito di un trattamento con claritromicina per 10 giorni, va incontro a completa risoluzione. Nei mesi seguenti si manifestano episodi saltuari di malessere, febbre, astenia e dolori articolari. A febbraio 2013, per comparsa di dolore al ginocchio sinistro, il medico curante consiglia il ricovero per accertamenti e sospetta ARF. Durante la degenza vengono quindi eseguiti un esame obiettivo completo, un’ecocardiografia ed un ECG. Inoltre vengono effettuati un emocromo completo, il titolo antistreptolisinico (TAS), i marker di flogosi ed un tampone faringeo per la ricerca di S.pyogenes. Durante la sorveglianza sono stati raccolti anche i tamponi faringei dei contatti. I campioni sono stati seminati su piastre di Agar Sangue ed incubati a 37°C per 24 ore. Le colonie β-emolitiche sono state identificate tramite spettrometria di massa MALDI-TOF ed i ceppi di S.pyogenes sono stati testati per la suscettibilità agli antibiotici tramite pannelli MICroSTREP plus (MicroScan®, Siemens).Tutti i ceppi di S. pyogenes sono stati caratterizzati per l’emm-type ed è stata eseguita la ricerca di 13 superantigeni (speA–speC, speF–speM, smeZ, and Ssa) con PCR Real-time. RISULTATI Durante il ricovero, l’auscultazione cardiaca evidenziava un lieve soffio sistolico mentre gli esami ematici mostravano un elevato TAS (2264 U/L), accompagnato da aumento dei marker di flogosi ed una debole leucocitosi (18.070/mmc). L’ecocardiografia e l’ECG mostravano, rispettivamente, una lieve insufficienza mitralica ed un blocco atrio-ventricolare di I grado (PR 200-440 ms). In accordo con i criteri di Jones è stata posta diagnosi di ARF. Dal tampone faringeo del bambino è stato isolato un ceppo di S.pyogenes mucoso, emm-type 18, risultato sensibile a tutti gli antibiotici testati. E’ stata somministrata una terapia con corticosteroidi e benzilpenicillina, con graduale risoluzione dei sintomi. Dei 24 compagni di classe 7 sono risultati positivi per S.pyogenes. Di questi, 2 erano emm-type 18 con fenotipo mucoso e presentavano il medesimo spettro di superantigeni del caso indice (speA, speC, speG, speL, speM). CONCLUSIONI Il caso descritto mette in evidenza come l’ARF non si possa considerare scomparsa nei paesi industrializzati. Inoltre un’elevata circolazione di ceppi mucosi di S.pyogenes, come l’emm-type 18, può essere considerato un fattore di rischio per lo sviluppo di ARF

Caratterizzazione fenotipica e genotipica di ceppi di Staphylococcus aureus isolati in corso di batteriemia

INTRODUZIONE. Staphylococcus aureus (SA) è uno dei microrganismi prevalenti tra gli agenti di batteriemia/sepsi. Negli ultimi anni il numero di batteriemie da SA diagnosticate tramite emocoltura è progressivamente aumentato in Emilia-Romagna. Le sepsi da SA hanno un impatto clinico di particolare rilevanza considerando la virulenza del microrganismo, la possibilità di determinare secondarismi e la frequente antibiotico-resistenza. La conoscenza di tali caratteristiche nei ceppi circolanti in una particolare realtà epidemiologica è fondamentale per mettere in atto strategie diagnostiche, gestionali e terapeutiche efficaci. METODI. Nel periodo compreso tra febbraio ed aprile 2016, presso l’U.O. di Microbiologia del Policlinico Sant’Orsola-Malpighi di Bologna, sono stati raccolti tutti i ceppi di SA consecutivamente isolati da emocoltura. Per ogni ceppo, è stato studiato il profilo di antibiotico-resistenza sia con metodiche semi-automatizzate (MicroScan®, Vitek® 2) sia con test manuali (E-test per Vancomicina e GRD test per indagare fenotipi di resistenza hVISA). Differenti PCR end-point sono state utilizzate per valutare la presenza di geni codificanti esotossine (emolisina α e δ –HLA e HLD-, tossina dello shock tossico –TST-, leucocidina di Panton-Valentine –PVL-) ed i ceppi MRSA sono stati tipizzati sulla base della presenza del gene mecA e della cassetta cromosomica SCCmec. Utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF sono stati costruiti dendrogrammi per valutare la presenza di fenomeni di tipo clonale. I fenotipi di resistenza e le caratteristiche di virulenza sono state inoltre poste in relazione con diversi parametri clinici al fine di determinare eventuali correlazioni con la gravità clinica e la prognosi della sepsi. RISULTATI. Lo studio fenotipico dei 73 ceppi di SA ha evidenziato un 30,1% di isolati meticillino-resistenti con un 2,7% di eteroresistenti ai glicopeptidi. Dalla caratterizzazione molecolare è emerso che tutti gli MRSA sono portatori del gene mecA e le cassette SCCmec tipizzate sono del tipo I, II, IVc e IVd. La ricerca dei geni per i fattori di virulenza ha mostrato una minima positività per PVL (1,3%) ed un’elevata prevalenza di HLA e HLD (94,5% e 79,4%). La TST è risultata positiva nel 10,1% degli isolati (tutti meticillino-sensibili). Dalla correlazione fra i dati clinici e le caratteristiche dei ceppi è emerso che l’outcome clinico non è associato ad un determinato profilo di virulenza e che l'appropriatezza della terapia empirica è associata al profilo di resistenza del ceppo isolato. L’analisi MALDI-TOF ha permesso di ipotizzare l’assenza di clonalità tra gli isolati e fornito interessanti risultati per lo sviluppo di algoritmi volti ad individuare ceppi di MRSA con ridotta suscettibilità a vancomicina. CONCLUSIONI. I dati dello studio indicano come nel periodo in esame le sepsi da SA siano state sostenute prevalentemente da ceppi meticillino-sensibili, non correlati geneticamente fra loro, mentre gli MRSA circolanti sembrano appartenere, sulla base delle antibiotico-resistenze e del pattern di geni di virulenza, a ceppi di origine nosocomiale. Il MALDI-TOF ha mostrato interessanti potenzialità come metodica di screening in grado di individuare i ceppi MRSA con ridotta suscettibilità a vancomicina e conseguente potenziale fallimento della terapia con glicopeptidi

A case of acute rheumatic fever in Italy: clinical and microbiological findings

Objectives. Acute rheumatic fever (ARF) is a post-infectious non-suppurative condition resulting from an autoimmune response to a Group A streptococcus (GAS) pharyngeal infection. In the last decades, the incidence of ARF showed a significant decrease in industrialized Countries. However, sporadic outbreaks have been reported in combination with the reappearance of certains emm-types of GAS. Here, we report a case of ARF occurred in a child from a primary school in Bologna, North of Italy. In addition, we describe the epidemiological investigation of GAS strains isolated from pharyngeal swabs collected during a surveillance program conducted in his classroom. Methods. In November 2012, a 11-year-old previously healthy white boy suffered for a GAS pharyngitis and was treated with clarithromycin for 10-days. In February 2013, he complained about left knee joint pain and retrosternal pain and was admitted to the hospital since a diagnosis of ARF was suspected. The patient underwent a complete clinical examination, an echocardiography and an electrocardiography (ECG). Several blood samples were taken to perform white blood cell count (WBC), antistreptolysine O titer (ASO) and inflammation markers. A pharyngeal swab was collected for GAS investigation. A surveillance program, based on pharyngeal swabs screening, was started in the classroom since case definition of ARF. Pharyngeal swabs were seeded on blood agar plates and β-haemolytic colonies were identified with mass-spectrometry (MALDI-TOF). In case of GAS isolation, antibiogram was performed using MICroSTREP plus1 panel (Microscan). Susceptibility was determined according to EUCAST criteria. Emm-type of each GAS isolates was determined by PCR and sequencing. Streptococcal pyrogenic exotoxin (spe) profile of each isolate, were performed by multiplex PCR Results. During hospitalization, echocardiography showed a mild mitral regurgitation. ECG revealed a first-degree atrioventricular block (PR=200-440 ms). The cardiac auscultation highlighted a faint systolic murmur. Blood tests showed an elevated ASO (2264 U/L) and inflammation markers and a mild leucocytosis (18.070/mmc). According to Jones criteria a diagnosis of ARF was established. A GAS strain showing a mucoid phenotype was isolated from pharyngeal swab of ARF case and the typing analysis conducted on it identified the presence of emm18 gene. Superantigen profile showed the presence of speA, speC, speG, speL, speM genes. Seven out of 24 pharyngeal swabs collected for surveillance resulted positive for GAS. Detailed microbiological characteristics are shown in table 1. Patient was given a therapy with corticosteroids for 21 days and benzilpenicillin (1.200.000 U im), with a gradual resolution of symptoms. Pharyngeal swab culture were negative after 2 weeks of hospitalization. Conclusion. Our case highlights that ARF has not disappeared in developed Countries. Moreover, as observed in our experience, a high circulation of certain mucoid GAS strains, like emm-type 18, could be a risk factor for ARF development

Use of temocillin for identification of class D carbapenemases

Objectives. Currently, the main difficulty in laboratory confirmation of carbapenemases production concerns the identification of class D enzymes (OXA-48, OXA-181 and OXA-181-like), harbored in Enterobacteriaceae. Nevertheless, determination of susceptibility to temocillin provides an important indication of their possible presence. Aims of the study are to evaluate the susceptibility to temocillin of Enterobacteriaceae strains with reduced susceptibility to carbapenems, and to correlate it with the mechanism of resistance defined by genotypic tests, in order to assess the performance of the temocillin-susceptibility test. Methods. 231 strains of Enterobacteriaceae with reduced susceptibility to carbapenems at routine analysis (Vitek2 - BioMérieux), were tested, selected on the basis of the results to disk diffusion synergy test for detection and typing of carbapenemases (DDST, Rosco). These strains, belonging to different genus and species (Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus), have also been molecularly characterized with Hyplex® PCR (Amplex), a multiplex-PCR for blaKPC, blaVIM, blaIMP, blaNDM and blaOXA-48; their susceptibility to temocillin has been evaluated by disk diffusion test. Results. The 231 tested strains, divided according to DDST, gave the following results: - 33 class A carbapenemase-producers: 33 resulted positive for blaKPC, 31 subsceptible to temocillin, 2 resistant; - 41 class B (MBL) producers: 34 resulted positive for blaVIM (12 susceptible to temocillin, 22 resistant), and 7 for blaNDM (6 susceptible to temocillin, 1 susceptible); - 147 negative to DDST: 2 resulted positive for blaOXA-48, both resistant to temocillin, while the other 145 were negative to multiplex PCR and temocillin-susceptible; - 10 AmpC-producers: all resulted negative to multiplex PCR and susceptible to temocillin. Conclusion. Susceptibility to temocillin proved to be the only phenotypic test that allows the identification of class D carbapenemases-producers strains if combined to DDST, even if this study suggest that temocillin resistance, not performed with DDST, does not provide a result specific for class D carbapenemases. However its introduction in the laboratory routine could allow the clinical microbiologist to provide a reliable result about presence/absence of all main known carbapenemases in strains with reduced susceptibility to carbapenems; particularly, a negative result to DDST, associated with susceptibility totemocillin, allows to exclude with very high probability the presence of any carbapenemases (negative predictive value of 100%)

VALUTAZIONE DI UN FLUSSO DI LAVORO “LESS TIME CONSUMING” PER L’IDENTIFICAZIONE RAPIDA DI MICRORGANISMI DA EMOCOLTURA POSITIVA TRAMITE LO STRUMENTO VITEK MS

INTRODUZIONE L’introduzione della spettrometria di massa (MS) MALDI-TOF per l'identificazione (ID) microbica ha migliorato la diagnosi di batteriemia, riducendo turnaround time e costi complessivi. Tuttavia, molti dei protocolli per l’ID diretta da emocoltura positiva tramite MS prevedono procedure complesse comprendenti fasi di lavaggio e di estrazione delle proteine. Anche se tali metodiche hanno mostrato una buona accuratezza diagnostica, i tempi di lavorazione rendono difficile la loro implementazione nella routine diagnostica. In questo lavoro è stato valutato un flusso di lavoro “less time consuming” che prevede una semina concentrata su piastra e una breve incubazione prima dell’analisi dei campioni tramite lo strumento Vitek MS (bioMerieux) METODI Da febbraio ad aprile 2014 sono stati raccolti 351 flaconi positivi. Unitamente all’esecuzione di subcolture e colorazione di Gram, 8ml di sangue da ogni flacone positivo sono stati prelevati e inseriti in una provetta Vacuette Z serum Sepclot activator contenente un gel separatore (Bekton Dickinson). Questa è stata centrifugata a 3500 giri per 10 minuti. Il sovranatante è stato scartato e il pellet risospeso in 100 μl di 0,9% sterile saline solution water. Dopo aver vortexato la provetta per 2 secondi, la soluzione è stata rovesciata su una piastra di agar cioccolato (Meus s.r.l), seminata e fatta asciugare per pochi minuti. In base all'esito della lettura del vetrino Gram: per i bacilli Gram negativi il tempo di incubazione è stato di 1,5h, per tutti gli altri di 3h. Al termine con un'ansa si è raccolta una quantità di patina di crescita e la si è deposta in un target-plate monouso con l'aggiunta di 1μl di matrice HCCA. Gli spot ottenuti sono stati analizzati tramite lo strumento Vitek MS come indicato dalla casa produttrice. I risultati sono stati verificati e confrontati nei giorni successivi ripetendo le ID dalle subcolture (gold standard) tramite MS o se necessario tramite metodi di ID biochimica (Vitek II bioMerieux, Microscan Siemens) e analisi complementari RISULTATI Dei 351 campioni, 214 hanno mostrato la presenza di microrganismi Gram+, 110 di Gram-, 12 di lieviti, 15 hanno mostrato la presenza di flora polimicrobica. Dei 336 campioni con flora monomicrobica, 286 sono risultati identificati correttamente (85,1%), 48 non identificati (14,2%) e solamente 2 con ID erronea (0,5%). I Gram+ e i Gram- hanno avuto una ID corretta rispettivamente nell’83,2% e nel 95,4% dei casi. Tra i microrganismi Gram+ sono stati identificati correttamente 26 su 28 (92,8%) ceppi di S. aureus e 19 su 20 (95%) ceppi di enterococchi. Solo 4 campioni (25%) dei 12 con presenza di lieviti hanno avuto ID corretta. Dei 48 campioni con microrganismi non identificati, 21 sono stati considerati da probabile contaminazione CONCLUSIONI Il protocollo in esame ha dimostrato una buona capacità analitica, in linea con altri protocolli presenti in letteratura che però prevedono passaggi di lavaggio e di estrazione delle proteine. In più c’è da sottolineare come sia molto efficace nell’ID dei microrganismi più rilevanti come Gram-, S. aureus ed enterococchi. Per campioni con presenza di lieviti il protocollo prevede limiti intrinseci alla metodica che non ne suggeriscono l’impiego. In definitiva, essendo la metodica in esame poco laboriosa, pur mantenendo una qualità diagnostica elevata, possiamo concludere come essa possa essere implementabile senza difficoltà nella routine di un laboratorio di microbiologia clinica

DETERMINAZIONE DELLA PRODUZIONE DI CARBAPENEMASI IN ENTEROBATTERI CON RIDOTTA SENSIBILITA’ AI CARBAPENEMI MEDIANTE METODICA LC-MS (LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY)

INTRODUZIONE Le resistenza ai carbapenemi negli enterobatteri rappresenta ad oggi la principale problematica di antibiotico-resistenza. Negli ultimi anni nel contesto epidemiologico italiano si è osservata una rapida diffusione di microrganismi con queste caratteristiche, legata principalmente a Klebsiella pneumoniae produttrice di carbapenemasi KPC. Una rapida e corretta definizione della produzione di carbapenemasi riveste notevoli implicazioni sia da un punto di vista clinico che epidemiologico per la necessità di mettere in atto il più precocemente possibile una terapia antibiotica appropriata e le idonee misure preventive. In questo lavoro abbiamo valutato la performance analitica di un saggio di LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) nel determinare la produzione di carbapenemasi in isolati di enterobatteri. MATERIALI E METODI Sono stati selezionati per lo studio 48 isolati clinici (40 K.pneumoniae, 4 E.coli, 4 C.freundii) precedentemente caratterizzati: 20 ceppi produttori di carbapenemasi KPC, 10 di metallo-βlattamasi (MBL), 6 di OXA-48, 12 non produttori di carbapenemasi (6 con ridotta sensibilità ai carbapenemi da produzione di ESBL con deficit di porine e 6 wild-type). La metodica di valutazione della produzione di carbapenemasi prevede l’incubazione per 1 ora a 37°c dei ceppi in esame in presenza di meropenem ad una concentrazione di 0.05 mg/ml. In seguito si procede ad una centrifugazione ed il sovranatante viene utilizzato per il dosaggio del meropenem mediante LC-MS, metodica che coniuga la cromatografia liquida alla spettrometria di massa. L’analisi è stata eseguita su sistema HPLC Prominance UFLC-XR (Shimadzu) accoppiato a spettrometro di massa triplo quadrupolo API 4000 QTRAP (AB Sciex). Una curva di calibrazione permette di ottenere una quantificazione assoluta, mentre l’attività carbapenemasica è stata valutata in base al rapporto tra la concentrazione di meropenem nei campioni incubati con i ceppi e quella dell’antibiotico incubato in assenza di batteri (ratio). RISULTATI Tutti i ceppi produttori di KPC hanno evidenziato una rapida attività di degradazione del meropenem, determinando valori di ratio inferiori a 0.2 in 19 dei 20 campioni. Per gli isolati produttori di MBL i valori di ratio sono risultati tutti inferiori a 0.6, mentre per quelli positivi per OXA-48 in 2 casi i valori di ratio sono risultati sovrapponibili a quelli ottenuti per i ceppi produttori di ESBL. Complessivamente, utilizzando un cut-off di ratio ottimale identificato ad un valore di 0.75, la sensibilità del metodo nel determinare la produzione di carbapenemasi è risultata pari al 94.4%, la specificità del 100%. CONCLUSIONI La metodica di LC-MS valutata in questo studio ha dimostrato una elevata affidabilità diagnostica nella valutazione dell’attività carbapenemasica da parte di ceppi di enterobatteri. La sensibilità non ottimale ottenuta su isolati produttori di OXA-48 è probabilmente legata ad una più lenta attività enzimatica di questa specifica βlattamas

DETERMINAZIONE DELLA PRODUZIONE DI CARBAPENEMASI IN ENTEROBATTERI CON RIDOTTA SENSIBILITA’ AI CARBAPENEMI MEDIANTE METODICA LC-MS (LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY)

INTRODUZIONE Le resistenza ai carbapenemi negli enterobatteri rappresenta ad oggi la principale problematica di antibiotico-resistenza. Negli ultimi anni nel contesto epidemiologico italiano si è osservata una rapida diffusione di microrganismi con queste caratteristiche, legata principalmente a Klebsiella pneumoniae produttrice di carbapenemasi KPC. Una rapida e corretta definizione della produzione di carbapenemasi riveste notevoli implicazioni sia da un punto di vista clinico che epidemiologico per la necessità di mettere in atto il più precocemente possibile una terapia antibiotica appropriata e le idonee misure preventive. In questo lavoro abbiamo valutato la performance analitica di un saggio di LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) nel determinare la produzione di carbapenemasi in isolati di enterobatteri. MATERIALI E METODI Sono stati selezionati per lo studio 48 isolati clinici (40 K.pneumoniae, 4 E.coli, 4 C.freundii) precedentemente caratterizzati: 20 ceppi produttori di carbapenemasi KPC, 10 di metallo-βlattamasi (MBL), 6 di OXA-48, 12 non produttori di carbapenemasi (6 con ridotta sensibilità ai carbapenemi da produzione di ESBL con deficit di porine e 6 wild-type). La metodica di valutazione della produzione di carbapenemasi prevede l’incubazione per 1 ora a 37°c dei ceppi in esame in presenza di meropenem ad una concentrazione di 0.05 mg/ml. In seguito si procede ad una centrifugazione ed il sovranatante viene utilizzato per il dosaggio del meropenem mediante LC-MS, metodica che coniuga la cromatografia liquida alla spettrometria di massa. L’analisi è stata eseguita su sistema HPLC Prominance UFLC-XR (Shimadzu) accoppiato a spettrometro di massa triplo quadrupolo API 4000 QTRAP (AB Sciex). Una curva di calibrazione permette di ottenere una quantificazione assoluta, mentre l’attività carbapenemasica è stata valutata in base al rapporto tra la concentrazione di meropenem nei campioni incubati con i ceppi e quella dell’antibiotico incubato in assenza di batteri (ratio). RISULTATI Tutti i ceppi produttori di KPC hanno evidenziato una rapida attività di degradazione del meropenem, determinando valori di ratio inferiori a 0.2 in 19 dei 20 campioni. Per gli isolati produttori di MBL i valori di ratio sono risultati tutti inferiori a 0.6, mentre per quelli positivi per OXA-48 in 2 casi i valori di ratio sono risultati sovrapponibili a quelli ottenuti per i ceppi produttori di ESBL. Complessivamente, utilizzando un cut-off di ratio ottimale identificato ad un valore di 0.75, la sensibilità del metodo nel determinare la produzione di carbapenemasi è risultata pari al 94.4%, la specificità del 100%. CONCLUSIONI La metodica di LC-MS valutata in questo studio ha dimostrato una elevata affidabilità diagnostica nella valutazione dell’attività carbapenemasica da parte di ceppi di enterobatteri. La sensibilità non ottimale ottenuta su isolati produttori di OXA-48 è probabilmente legata ad una più lenta attività enzimatica di questa specifica βlattamas

VALUTAZIONE DEL VERIGENE GRAM-NEGATIVE BLOOD CULTURE TEST PER L’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE E DEI DETERMINANTI DI RESISTENZA AI BETA-LATTAMICI DA FLACONI POSITIVI DI EMOCOLTURA

INTRODUZIONE Le sepsi da gram-negativi multiresistenti rappresentano una delle più gravi minacce per la gestione dei pazienti ospedalizzati. Nei casi di sepsi grave o shock settico una precoce terapia antibiotica appropriata è correlata con una riduzione della mortalità e dei costi sanitari. La recente diffusione di gram-negativi resistenti ai β-lattamici per la produzione di ESBL e carbapenemasi, a cui spesso si associa la resistenza a diverse altre classi di farmaci, ha ulteriormente aumentato il rischio di inappropriatezza. Scopo di questo lavoro è quello di valutare il saggio molecolare Verigene Gram-negative Blood culture test (Nanosphere-Moss) che consente di identificare rapidamente da flacone di emocoltura positivo la specie responsabile della batteriemia e i determinanti di resistenza ai β-lattamici. METODI Sono stati inclusi nello studio 39 casi di batteriemia diagnosticati mediante emocoltura (BactecFX, BD) tra ottobre 2013 e maggio 2014 in pazienti ricoverati in reparti di area critica del Policlinico S.Orsola- Malpighi. Una volta identificata la presenza di bacilli gram-negativi mediante la colorazione di Gram, unitamente alle procedure di routine (subcoltura, identificazione con MALDI-TOF, antibiogramma con VITEK2, Biomerieux), si è proceduto all’esecuzione del saggio Verigene Gram-negative Blood culture test (BC-GN). Il metodo, della durata complessiva di 2 ore, prevede, a partire da 700 ml di brodo, l’estrazione degli acidi nucleici e la successiva ibridazione dei bersagli con sonde che permettono di identificare K.pneumoniae, K.oxytoca, E.coli, S.marcescens, Proteus spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., P.aeruginosa e Acinetobacter spp. e di rilevare la presenza dei principali marker di resistenza ai β-lattamici (CTX-M, KPC, VIM, NDM, IMP e OXA). I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli della routine diagnostica colturale. RISULTATI Il test BC-GN ha identificato 1 o più specie di gram-negativi in 36 campioni, con prevalenza di K.pneumoniae (17) ed E.coli (14). La concordanza con la metodica colturale è risultata del 100%. Per i 3 casi negativi, la coltura ha evidenziato la crescita di specie non incluse tra quelle previste dal metodo (2 M.morganii e 1 C.jejuni). Per quel che riguarda i determinanti di resistenza, il test ha identificato 13 CTX-M, 7 KPC e 2 OXA, e i risultati sono stati del tutto compatibili con il quadro fenotipico dei relativi antibiogrammi. CONCLUSIONI Il saggio molecolare Verigene Gram-negative Blood culture test ha evidenziato nel nostro studio elevata sensibilità e specificità nella identificazione delle specie di gram-negativi responsabili di batteriemia e dei meccanismi di resistenza ai β-lattamici. La metodica, molto rapida e di semplice esecuzione, è di facile implementazione all’interno della routine diagnostica. Peraltro altri studi sono necessari per valutare quale possa essere l’impatto clinico dell’introduzione del test sulla gestione del paziente settico in termini di appropriatezza delle modifiche terapeutiche indotte e dei relativi esiti