Control biológico de <i>Mycosphaerella graminicola</i>, patógeno del trigo, con cepas de <i>Trichoderma harzianum</i> caracterizadas por su morfología, fisiología, actividad enzimática y molecular

Frente a las consecuencias indeseables del control químico, la demanda pública de alimentos más sanos y el cambio actual de los paradigmas productivos, la tendencia es sustituir total o parcialmente los fungicidas sintéticos por métodos alternativos no contaminantes, en el marco del Manejo Integrado. El trigo es el cereal de mayor distribución geográfica en el mundo y su demanda irá en aumento debido al incremento de la población mundial. La región triguera en la Argentina abarca una zona muy amplia con condiciones favorables para la aparición de diversas enfermedades. Una de ellas, de origen fúngico, es la Septoriosis ó Mancha de la hoja del trigo (Septoria tritici Roberge in Desmaz. anamorfo; Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schroeter, in Cohn teleomorfo). A nivel mundial, ocasiona daños que oscilan entre 31 y 54% de reducción en el rendimiento y en Argentina entre 17 y 50% dependiendo del estado fenológico en el que ocurre la infección. El método utilizado tradicionalmente para el control de la enfermedad es la aplicación de productos químicos sintéticos. El uso masivo de estos productos favoreció la aparición de patógenos resistentes además de las graves consecuencias la contaminación del ambiente. Utilizando microorganismos antagonista, el control biológico, ha tomado relevancia en estos últimos años. Las especies del género Trichoderma son los antagonistas más utilizados para el control de enfermedades de plantas, producidas por hongos, debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un gran número de sustratos y a que no atacan a plantas superiores. Estas especies basan sus propiedades antagónicas en la activación de mecanismos muy diversos. Uno de ellos es que pueden ejercer el biocontrol de hongos fitopatógenos indirectamente, compitiendo por el espacio y los nutrientes, modificando las condiciones ambientales, estimulando el crecimiento de las plantas y sus mecanismos de defensa. Otra medida, es mediante el micoparasitismo, por la penetración directa de las hifas al hospedador y/o por producción de enzimas extracelulares. El objetivo de este trabajo es presentar un estudio integrado, que combine propiedades: morfológicas, fisiológicas y moleculares de los aislamientos nativos de T. harzianum, para ser utilizarlos como eficientes agentes de control biológico. En este estudio se evaluaron 240 aislamientos de Trichoderma obtenidas de muestras de suelo de diferentes localidades de la región triguera argentina. La capacidad antagónica se ensayó en plántulas de trigo, en invernaculo. Para seleccionar las cepas de Trichoderma harzianum se tuvo en cuenta la capacidad de reducir en un 50 % tanto la superficie necrosada como la cobertura picnidial generada por M. graminicola. Se obtuvieron de esta manera 37 cepas del antagonista. Los resultados presentados hasta el momento evidencian la importancia de resistencia sistémica inducida (RSI) actuando en la defensa de la planta contra M.graminicola. Para la identificación de los aislamientos de Trichoderma se utilizó la técnica de PCR con los cebadores forward THITS-F2 y reverse THITS-R3 los cuales permiten identificar específicamente a T. harzianum. Para la caracterización genética intraespecífica se utilizaron marcadores ISSR. Con los resultados obtenidos se agruparon las cepas, en tres grupos de similitud. Estos grupos no presentaron correspondencia con el origen geográfico, ni con el año de aislamiento y ni con los distintos niveles de antagonismos. Los resultados de la caracterización morfocultural, el crecimiento radial y el color de las colonias, la coloración del medio de cultivo y el tamaño y la forma de los conidios no presentaron diferencias con las descripta en la taxonomía clásica para la especie T. harzianum. La presencia de las clamidosporas y su ubicación en el micelio, fue la característica que demostró mayor variación en el presente estudio. El 27% de las 37 cepas estudiadas no formaron clamidosporas durante el tiempo de duración del ensayo. De aquellas cepas que si las formaron, el 59% se ubicaron de manera intercalar y el 26% tanto terminales como intercalares. Sólo el 15% de las cepas formaron clamidosporas terminales. Los aislamientos se caracterizaron fisiológicamente en base a los siguientes parámetros: crecimiento de las colonias en diferentes fuentes carbonadas y nitrogenadas, crecimiento de las mismas bajo condiciones extremas de temperatura y pH. Los resultados presentaron escasa variabilidad por sí solos y no generaron una discriminación entre las cepas. La caracterización de la actividad enzimática destacó a dos cepas (2 y 8) como capaces de producir altos niveles de β-1-3 glucanasa, quitinasa y proteasa. Es importante resaltar en este estudio la relación encontrada entre las cepas cuando se integraron los atributos morfológicos, fisiológicos y moleculares. Con esta combinación se pudo observar una clara correspondencia entre ellas y su origen geográfico. Como ejemplo de ello, las cepas que integran el grupo I se encuentran divididas en dos ramas bien diferenciadas. Así las cepa 1, 5, 8 y 12 pertenecen a la localidad de Los Hornos y las cepas 160, 162, 165, 170 y 177 a la de Lobería. Con los resultados obtenidos en este trabajo se reconocieron una serie de propiedades (morfológicas, fisiológicas y moleculares) que sumadas a la identificación tradicional de T. harzianum, servirán para ampliar la caracterización de las cepas de esta especie como agentes de biocontrol y seguir su evolución en el tiempo y en medio ambiente cuando éstas se apliquen con fines biotecnológicos.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

Control biológico de Mycosphaerella graminicola, patógeno de trigo, con cepas de Trichoderma harzianum caracterizadas por su morfología, fisiología, actividad enzimática y molecular

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias NaturalesFil: Stocco, Marina Celeste. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo; Argentin

Fusarium oxysporum, potencial agente de control biológico para Sorghum halepense en Argentina

El sorgo de Alepo (Sorghum halepense (L.) Pers.) es una de las especies de malezas perennes más importantes en el mundo. Hasta el momento, no se ha podido disminuir su propagación e incidencia en los sistemas agrícolas. El biocontrol es una posible alternativa de manejo de malezas. El objetivo del trabajo fue evaluar por primera vez en Argentina, el efecto de diferentes técnicas de aplicación de Fusarium oxysporum sobre el crecimiento aéreo y subterráneo del sorgo de Alepo. Además, se estudió la acción del patógeno sobre la germinación de semillas de maíz, girasol, soja y sorgo granífero, teniendo en cuenta que podría afectar a estos cultivos. Se utilizaron dos técnicas de aplicación del patógeno. La aplicación de una suspensión de esporas de F. oxysporum en suelo (técnica liquida) mostró que a los tres meses se había producido la muerte del total de las plantas, mientras que con la técnica de infestación del suelo con un cultivo sólido del patógeno (técnica sólida) a los 90 días sólo había muerto el 65% de las plantas. F. oxysporum no disminuyó el porcentaje de germinación de los cultivos de soja, girasol, sorgo granífero y maíz, por lo que este hongo podría utilizarse como agente de biocontrol del sorgo de Alepo. Sin embargo, es necesario conocer el rango de hospedantes del patógeno para poder evaluar los riesgos de usar este antagonista.Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers.) is one of the most important species of perennial weeds in the world. Despite the different chemical control strategies studied, its incidence has not decreased in agricultural systems. Because of this, biological control appears as an alternative weed management strategy. The objective of this study was to evaluate for the first time in Argentina, the efficiency of different methods of application of strains of Fusarium oxysporum on growth of johnsongrass. In addition, the effect of the pathogen seed germination of corn, sunflower, soybean and sorghum was determinated. We used two methods of application of the pathogens. The application of a spore suspension of F. oxysporum in soil (liquid technique) showed that after three months the total of the plants had died, while with the technique of soil infestation with a solid culture of the pathogen (solid technique) at 90 days only 65% of the plants had died. F. oxysporum did not decrease the percentage of germination of soy, sunflower, grain sorghum and corn crops, so this fungus could be used as a biocontrol agent for Johnsongrass. However further studies on its effect on these and other hosts are necessary to fully assess the risks its use would involve

Possibilities of the use of Trichoderma harzianum in the biocontrol of wilt and bacterial canker of tomato

El presente trabajo consistió en evaluar la posibilidad del uso de dos cepas de Trichoderma harzianum (Th118 y Th5cc) sobre la manifestación del marchitamiento y cancro bacteriano del tomate en plantas de tomate platense cultivadas en invernáculo. Ambas cepas se aplicaron al sustrato de la plantinera en forma sólida (S) y líquida (L) en el momento de la siembra. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis se inoculó en el momento del desbrote mediante una pequeña incisión en el tallo principal entre la quinta y sexta hoja. El ensayo se repitió durante dos años consecutivos. Para cada tratamiento se evaluaron los componentes del rendimiento (peso y número de frutos) y número de hojas afectadas. Si bien no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos durante los dos años, el tratamiento Th118 L es el que presentó menor cantidad de hojas afectadas y valores promedio más altos de peso de frutos. De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede afirmar que la cepa de Trichoderma harzianum Th 118 aplicada como riego a los plantines en el momento de la siembra, podría ser incorporada como una buena alternativa dentro de un plan de manejo integrado de enfermedades en el cultivo de tomate platense.The objective of this work was to evaluate the possibility of using two strains of Trichoderma harzianum (Th118 and Th5cc) against bacterial wilt and canker symptoms in tomato plants grown under greenhouse conditions. Both strains were applied on the substrate of the tomato seedling in solid (S) and liquid (L) form at sowing. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis was inoculated at the time of budding through a small incision in the main stem between the fifth and sixth leaves. The trail was repeated for two consecutive years. For each treatment, the yield components (number and weight of fruits) and number of affected leaves were evaluated. Although no significant differences were found between treatments during the two years, the Th118 L treatment was the only that presented the least amount of affected leaves and higher average values of fruit weight. According to results obtained, it can be stated that the Trichoderma harzianum Th118 strain applied as irrigation to the seedlings at the time of sowing could be incorporated as a good alternative within an integrated disease management plan in the tomato crops.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Coinoculation of soybean plants with Bradyrhizobium japonicum and Trichoderma harzianum: Coexistence of both microbes and relief of nitrate inhibition of nodulation

Coinoculation of plants with mixtures of beneficial microbes sometimes produces synergistic effects. In this study, the effect of soybean coinoculation with the N2-fixing Bradyrhizobium japonicum E109 and the biocontrol fungus Trichoderma harzianum Th5cc was analyzed. Nodulation by E109 was not hampered by Th5cc, which antagonized five out of seven soybean pathogens tested. Furthermore, Th5cc relieved nitrate-inhibition of nodulation, enabling the formation of nodules containing infected cells with bacteroids in the presence of the otherwise inhibitory 10 mM KNO3. Th5cc released micromolar amounts of auxin, and addition of 11 mM indoleacetic acid to soybean plants inoculated with E109 in the absence of Th5cc also induced nodulation in the presence of 10 mM KNO3. Thus, Th5cc may release auxins into the soybean rhizosphere, which hormones might participate in overcoming the nitrate-inhibition of nodulation. Our results suggest that soybean plants coinoculated with these microorganisms might benefit from biocontrol while contributing to soil-nitrogen preservation.Fil: Iturralde, Esteban Tomás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Stocco, Marina Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Departamento de Ciencias Biológicas. Centro de Investigaciones de Fitopatología. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigaciones de Fitopatología; ArgentinaFil: Faura, Andrés. Rizobacter Argentina S.A.; ArgentinaFil: Monaco, Cecilia Ines. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Departamento de Ciencias Biológicas. Centro de Investigaciones de Fitopatología. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigaciones de Fitopatología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Cordo, Cristina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Departamento de Ciencias Biológicas; Argentina. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas; ArgentinaFil: Pérez Giménez, Julieta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Lodeiro, Anibal. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Genética; Argentin

Efecto de la coinoculación de Bradyrhizobium japonicum y Trichoderma harzianum sobre soja en ausencia y presencia de N

La inoculación de cultivos de soja con Bradyrhizobium spp. seleccionados por su alta capacidad fijadora de N2 es una práctica de biofertilización sustentable utilizada por el 94% de los productores de soja de nuestro país. Sin embargo, esta práctica no puede mitigar el uso de otros agroquímicos como por ejemplo, fungicidas. Es por ello que se está trabajando en el desarrollo de inoculantes combinados que, además de los rizobios, incluyan bioprotectores. Trichoderma harzianum es un hongo del suelo de rápida proliferación, muy utilizado en horticultura por sus efectos inhibidores de hongos fitopatógenos, que además tiene un efecto positivo sobre la contextura de la raíz mejorando así la absorción de nutrientes. Por lo tanto, nos propusimos el desarrollo de un inoculante para soja que combine ambos microorganismos.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Biological fungicide based on a strain of the fungus Trichoderma harzianum: its survival in the soil

Una alternativa al uso indiscriminado de fitosanitarios es la incorporación de microorganismos antagónicos competitivos para la protección de los cultivos de los patógenos habitantes del suelo. En este trabajo se evaluó la potencialidad del establecimiento de Trichoderma harzianum Rifai (cepa Th5cc) en el suelo bajo diferentes formulaciones, con el objeto de conocer cuál es la más efectiva en mantener la población del antagonista a niveles moderados. La población se cuantificó mediante la técnica del suelo diluido en placa utilizando un medio selectivo para Trichoderma. Los resultados muestran que tanto en el formulado líquido como en las semillas recubiertas aumenta la población de Th5cc hasta los 90 días desde que se incorporó el formulado al suelo (1,4 x 104 unidades formadoras de colonia/g de suelo). En contraste, con la aplicación de formulado sólido la población del antagonista comienza a disminuir a los 90 días. En el caso de la incorporación en la semilla, la población de T. harzianum al inicio fue menor a la del testigo, pero a los 60 y 90 días alcanzaron valores mayores a la población original del suelo (testigo). La eficiencia de la aplicación de T. harzianum como antagonista en plantas está estrechamente relacionada con su formulación, la cual tiene una clara influencia en la supervivencia en el suelo.An alternative to the indiscriminate use of phytosanitary products is the incorporation of competing antagonistic microorganisms for the protection of the crops of soil-borne pathogens. In this work the potentiality of the establishment of Trichoderma harzianum Rifai (strain Th5cc) in the soil under different formulations was evaluated, in order to know which is the most effective in maintaining the population of the antagonist at moderate levels. The population was quantified using the soil dilution plate technique with a selective medium for Trichoderma. The results show that both the liquid formulation and the coated seeds increase the Th5cc population until 90 days after the formula was incorporated into the soil (1.4 x 104 colony forming units / g of soil). In contrast, with the application of solid formula, the population of the antagonist begins to decrease after 90 days. In the case of incorporation in the seed, the population of T. harzianum at the beginning was lower than that of the control, but at 60 and 90 days they reached higher values than the original soil population (control). The efficiency of the application of T. harzianum as an antagonist in plants is closely related to its formulation, which clearly influences survival in the soil.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Biological fungicide based on a strain of the fungus Trichoderma harzianum: its survival in the soil

Una alternativa al uso indiscriminado de fitosanitarios es la incorporación de microorganismos antagónicos competitivos para la protección de los cultivos de los patógenos habitantes del suelo. En este trabajo se evaluó la potencialidad del establecimiento de Trichoderma harzianum Rifai (cepa Th5cc) en el suelo bajo diferentes formulaciones, con el objeto de conocer cuál es la más efectiva en mantener la población del antagonista a niveles moderados. La población se cuantificó mediante la técnica del suelo diluido en placa utilizando un medio selectivo para Trichoderma. Los resultados muestran que tanto en el formulado líquido como en las semillas recubiertas aumenta la población de Th5cc hasta los 90 días desde que se incorporó el formulado al suelo (1,4 x 104 unidades formadoras de colonia/g de suelo). En contraste, con la aplicación de formulado sólido la población del antagonista comienza a disminuir a los 90 días. En el caso de la incorporación en la semilla, la población de T. harzianum al inicio fue menor a la del testigo, pero a los 60 y 90 días alcanzaron valores mayores a la población original del suelo (testigo). La eficiencia de la aplicación de T. harzianum como antagonista en plantas está estrechamente relacionada con su formulación, la cual tiene una clara influencia en la supervivencia en el suelo.An alternative to the indiscriminate use of phytosanitary products is the incorporation of competing antagonistic microorganisms for the protection of the crops of soil-borne pathogens. In this work the potentiality of the establishment of Trichoderma harzianum Rifai (strain Th5cc) in the soil under different formulations was evaluated, in order to know which is the most effective in maintaining the population of the antagonist at moderate levels. The population was quantified using the soil dilution plate technique with a selective medium for Trichoderma. The results show that both the liquid formulation and the coated seeds increase the Th5cc population until 90 days after the formula was incorporated into the soil (1.4 x 104 colony forming units / g of soil). In contrast, with the application of solid formula, the population of the antagonist begins to decrease after 90 days. In the case of incorporation in the seed, the population of T. harzianum at the beginning was lower than that of the control, but at 60 and 90 days they reached higher values than the original soil population (control). The efficiency of the application of T. harzianum as an antagonist in plants is closely related to its formulation, which clearly influences survival in the soil.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Cambio en la sensibilidad al fungicida tebuconazol en las poblaciones de <i>Zymoseptoria tritici</i>, patógeno de la septoriosis de la hoja del trigo

La septoriosis de la hoja del trigo, producida por Zymoseptoria tritici (Quaedvlieg & Crous), necrosa el área fotosintética disminuyendo el rendimiento final. En Argentina la aplicación de fungicidas es una práctica común de control y los triazoles y las estrobilurinas son los más frecuentes. Los triazoles son activos inhibidores del ergosterol que abunda como parte constitutiva de la membrana de la célula fúngica. No obstante, el uso genera grados de tolerancia en el patógeno obligando a la utilización de mezclas de principios activos. El objetivo fue: evaluar la pérdida de sensibilidad al efecto del fungicida tebuconazol en las poblaciones de aislados de Zymoseptoria tritici de la región triguera argentina. Se cuantificaron: a) la tasa de crecimiento de las colonias fúngicas de 46 aislados creciendo en APG sólido con fungicida incorporado, en relación a los mismos creciendo en medio de cultivo sin el fungicida y b) el porcentaje de eficiencia del fungicida para cada uno de los aislados. El análisis de Kruskal Wallis categorizó a los aislados en dos tipos de respuesta: 1-tolerantes, que superan el efecto inhibidor del fungicida; 2- que no superan el crecimiento en presencia del fungicida. La experiencia internacional explica la tolerancia al fungicida por alteraciones genéticas producidas en el gen CYP51, responsable en el patógeno de la sensibilidad al químico. El siguiente avance será diagnosticar la presencia de los genotipos alterados para recomendar el uso adecuado de los principios activos.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Cambio en la sensibilidad al fungicida tebuconazol en las poblaciones de <i>Zymoseptoria tritici</i>, patógeno de la septoriosis de la hoja del trigo

La septoriosis de la hoja del trigo, producida por Zymoseptoria tritici (Quaedvlieg & Crous), necrosa el área fotosintética disminuyendo el rendimiento final. En Argentina la aplicación de fungicidas es una práctica común de control y los triazoles y las estrobilurinas son los más frecuentes. Los triazoles son activos inhibidores del ergosterol que abunda como parte constitutiva de la membrana de la célula fúngica. No obstante, el uso genera grados de tolerancia en el patógeno obligando a la utilización de mezclas de principios activos. El objetivo fue: evaluar la pérdida de sensibilidad al efecto del fungicida tebuconazol en las poblaciones de aislados de Zymoseptoria tritici de la región triguera argentina. Se cuantificaron: a) la tasa de crecimiento de las colonias fúngicas de 46 aislados creciendo en APG sólido con fungicida incorporado, en relación a los mismos creciendo en medio de cultivo sin el fungicida y b) el porcentaje de eficiencia del fungicida para cada uno de los aislados. El análisis de Kruskal Wallis categorizó a los aislados en dos tipos de respuesta: 1-tolerantes, que superan el efecto inhibidor del fungicida; 2- que no superan el crecimiento en presencia del fungicida. La experiencia internacional explica la tolerancia al fungicida por alteraciones genéticas producidas en el gen CYP51, responsable en el patógeno de la sensibilidad al químico. El siguiente avance será diagnosticar la presencia de los genotipos alterados para recomendar el uso adecuado de los principios activos.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale