Erzeugung und Charakterisierung einer Mausmutante, in der Horizontalzellen induzierbar abgetötet werden können

Connexin57 (Gja10) unterscheidet sich in mehrerer Hinsicht von anderen Connexin-Genen. Seine Expression ist in der adulten Maus auf Horizontalzellen der Retina sowie einige wenige Zellen eines unbekannten Zelltyps im Thymus begrenzt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Cx57-Promotor zur Erzeugung zweier Mausmutanten verwendet, die eine genauere Untersuchung der Funktion von Horizontalzellen der Retina ermöglichen sollten. Zum einen wurde die Expression der humanen Form des Diphtherie Toxin-Rezeptors (DTR) unter dem Cx57-Promotor dazu genutzt, in der adulten Maus gezielt Horizontalzellen für das Toxin des Corynebakterium diphtheriae zu sensibilisieren, demgegenüber Mäuse ansonsten unempfindlich sind. Durch Behandlung mit unterschiedlichen Dosen Diphterie Toxin (DT) wurde die vollständige und spezifische Ablation der Horizontalzellen in der Retina erreicht. Diese führte zum Verlust des Kontaktes zwischen Photorezeptor- und Bipolarzellen in der sog. synaptischen Triade, an der auch die Horizontalzellen normalerweise beteiligt sind und für deren Erhalt sie aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit eine wichtige Rolle zu spielen scheinen. Darüber hinaus wurden auch Effekte der DT-Behandlung auf andere Organe beobachtet. So führt die Ablation Cx57 exprimierender Zellen in der Cx57-DTRfrtCre Mauslinie teilweise zum Verlust eines großen Teils der CD4 und CD8 doppelt positiven, sich entwickelnden Thymozyten und einer etwa 90 %igen Reduktion der Größe des Thymus. Zusätzlich hatte DT Auswirkungen auf die Leber, was auf eine bisher nicht gezeigte Expression von Cx57 bzw. des DTR in diesem Organ hindeutet. Als zweites Werkzeug wurde über FLP-vermittelte Rekombination in Cx57-DTRfrtCre Tieren die Cx57-Cre Mauslinie erzeugt, welche die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Cx57-Promotors exprimiert. Die Funktionalität der Cre-Rekombinase konnte in Horizontalzellen der Retina mithilfe einer ROSA26-STOPfloxYFP Reportermauslinie gezeigt werden. Auf diese Weise ist mit der hier erzeugten Cx57-Cre Mauslinie die Cre-vermittelte Deletion gefloxter Gene in Horizontalzellen möglich. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit physiologische Besonderheiten von Cx57-Kanälen anhand stabil transfizierter HeLa-Zellen identifiziert. Dabei wurde eine Öffnung der Cx57 Kanäle oberhalb eines pH-Wertes von etwa 7,4 und eine Regulierung in einem Bereich von 0,1-0,2 pH-Einheiten gefunden. Der zur Öffnung notwendige und im Vergleich zu anderen Connexine hohe pH-Wert stellt vermutlich eine Anpassung an den intrazellulären pH-Wert der Horizontalzellen dar. Veränderungen des intrazellulären pH-Wertes um 0,1 ¬0,2 pH-Einheiten könnten zur lichtabhängigen Regulation der Cx57-vermittelten Kopplung zwischen Horizontalzellen der Retina dienen. Zusätzlich wurde eine Aktivierung von Cx57-Halbkanälen in HeLa-Zellen bei niedrigen Calzium¬konzentrationen und entsprechendem intrazellulärem pH-Wert festgestellt. Des Weiteren wurde in in vitro Binde- und Phosphorylierungsexperimenten die Interaktion zwischen dem häufigsten neuronalen Connexin der Maus, Connexin36 (Cx36), und der Ca2+/Calmodulin abhängiger Kinase (CaMKII) untersucht. Es wurde eine Interaktion der Kinase mit beiden zytoplasmatischen Bereichen von Cx36 gezeigt, welche Gemeinsam¬keiten mit der Interaktion der CaMKII und mit dem N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor aufweist. Dies deutet auf einen ähnlichen Mechanismus bei der Regulation von elektrischen und chemischen Synapsen hin. Schließlich wurde die Expression und Funktion eines weiteren, in der Linse der Maus exprimierten Connexins, Connexin23 (Cx23), untersucht. Anhand von stabil Cx23-exprimierenden HeLa-Zelllinen wurde gezeigt, dass dieses Connexin der Maus keine funktionellen Gap Junction-Kanäle bildet, sondern statt dessen zur Bildung von Calcium-unabhängigen Halbkanälen in der Lage ist, über die ATP abgegeben werden kann. Dies weist auf eine ähnliche Funktion des Cx23 Proteins hin wie bereits für Pannexine beschrieben, mit denen Cx23 auch bestimmte extrazelluläre Cystein-Reste gemeinsam hat

A modular in vitro flow model to analyse blood-surface interactions under physiological conditions

Newly developed materials for blood-contacting devices need to undergo hemocompatibility testing to prove compliance with clinical requirements. However, many current in vitro models disregard the influence of flow conditions and blood exchange as it occurs in vivo. Here, we present a flow model which allows testing of blood-surface interactions under more physiological conditions. This modular platform consists of a triple-pump-chip and a microchannel-chip with a customizable surface. Flow conditions can be adjusted individually within the physiological range. A performance test with whole blood confirmed the hemocompatibility of our modular platform. Hemolysis was negligible, inflammation and hemostasis parameters were comparable to those detected in a previously established quasi-static whole blood screening chamber. The steady supply of fresh blood avoids secondary effects by nonphysiological accumulation of activation products. Experiments with three subsequently tested biomaterials showed results similar to literature and our own experience. The reported results suggest that our developed flow model allows the evaluation of blood-contacting materials under physiological flow conditions. By adjusting the occurring wall shear stress, the model can be adapted for selected test conditions

Moderate hyperventilation during intravenous anesthesia increases net cerebral lactate efflux

BACKGROUND:: Hyperventilation is known to decrease cerebral blood flow (CBF) and to impair cerebral metabolism, but the threshold in patients undergoing intravenous anesthesia is unknown. The authors hypothesized that reduced CBF associated with moderate hyperventilation might impair cerebral aerobic metabolism in patients undergoing intravenous anesthesia. METHODS:: Thirty male patients scheduled for coronary surgery were included in a prospective, controlled crossover trial. Measurements were performed under fentanyl-midazolam anesthesia in a randomized sequence aiming at partial pressures of carbon dioxide of 30 and 50 mmHg. Endpoints were CBF, blood flow velocity in the middle cerebral artery, and cerebral metabolic rates for oxygen, glucose, and lactate. Global CBF was measured using a modified Kety-Schmidt technique with argon as inert gas tracer. CBF velocity of the middle cerebral artery was recorded by transcranial Doppler sonography. Data were presented as mean (SD). Two-sided paired t tests and one-way ANOVA for repeated measures were used for statistical analysis. RESULTS:: Moderate hyperventilation significantly decreased CBF by 60%, blood flow velocity by 41%, cerebral oxygen delivery by 58%, and partial pressure of oxygen of the jugular venous bulb by 45%. Cerebral metabolic rates for oxygen and glucose remained unchanged; however, net cerebral lactate efflux significantly increased from -0.38 (2.18) to -2.41(2.43) μmol min 100 g. CONCLUSIONS:: Moderate hyperventilation, when compared with moderate hypoventilation, in patients with cardiovascular disease undergoing intravenous anesthesia increased net cerebral lactate efflux and markedly reduced CBF and partial pressure of oxygen of the jugular venous bulb, suggesting partial impairment of cerebral aerobic metabolism at clinically relevant levels of hypocapnia. Copyrigh

Raucherentwöhnung in der primärärztlichen Versorgung – Chance oder Fiktion?: Ergebnisse der "Smoking and Nicotine Dependence Awareness and Screening (SNICAS)"-Studie

Durch eine stärkere Einbeziehung deutscher Hausärzte in die Raucherentwöhnung soll die Versorgung von Rauchern flächendeckend verbessert werden. Inwiefern dieser Anspruch realisierbar ist, wird im Rahmen der "Smoking and Nicotine Dependent Awareness and Screening" (SNICAS) Studie überprüft. SNICAS ist eine zweistufige epidemiologische Punktprävalenzstudie [Stufe I (Vorstudie): Charakterisierung einer repräsentativen, bundesweiten Stichprobe von n = 889 Hausärzten; Stufe II: Stichtagserhebung an n = 28 707 unselektierten konsekutiven Patienten], an die sich eine regionale klinische Interventionskomponente anschließt. In diesem Beitrag werden Prävalenzraten des Rauchens, Aufhörmotivation und bisherige Aufhörversuche von Primärarztpatienten berichtet. Dargestellt werden Erkennens- und Interventionsraten von Rauchern durch Hausärzte, das ärztliche Interventionsverhalten sowie deren Einschätzung der Chancen und Barrieren von Raucherentwöhnung im Praxisalltag. Die Ergebnisse der Studie belegen ein großes Interesse der Hausärzte am Thema Raucherentwöhnung. Dennoch weisen niedrige hausärztliche Interventionsraten bei gleichzeitig hohen Prävalenzraten von Rauchen und Nikotinabhängigkeit auf ein beträchtliches Versorgungsdefizit. Als Ursachen hierfür werden neben ambivalenter Aufhörmotivation der Patienten strukturelle Barrieren diskutiert. Die Autoren fordern neue klinische Versorgungsmodelle, die ein abgestimmtes Zusammenspiel von Hausärzten mit anderen, auf Raucherentwöhnung spezialisierte Berufsgruppen fokussieren.Through smoking cessation interventions, primary care physicians could play an important part in the treatment of smokers in Germany. In the "Smoking and Nicotine Dependent Awareness and Screening" (SNICAS) study, we examined whether this increased involvement of primary care physicians might be implemented. SNICAS is a two-stage epidemiological point prevalence study. In stage I (pre-study), a nationwide sample of 889 primary care doctors was characterized; in stage II, 28 707 unselected consecutive patients were assessed on the target day. The investigation was followed by regional clinical interventions. The present article contains our findings on the prevalence of smoking, the motivation to quit, and the history of quit attempts among primary care patients. Information will be provided on how frequently physicians recognize and treat smokers; what kind of interventions they offer; as well as how they judge the opportunities and obstacles for smoking cessation in routine care. Despite the high prevalence of smoking and nicotine dependence and the primary care doctors’ interest in treating smokers, insufficient interventions are provided. Reasons for this situation include, but are not limited to the patients’ ambivalent motivation to quit and structural barriers. Hence, new clinical models of health care with an improved cooperation between primary care physicians and other specialists in the field of smoking cessation seem necessary

Raucherentwöhnung in der primärärztlichen Versorgung: Ziele, Design und Methoden der "Smoking and Nicotine Dependence Awareness and Screening (SNICAS)"-Studie

In Deutschland fehlen bislang belastbare epidemiologische Daten über sowohl die Häufigkeit nikotinabhängiger Raucher im primärärztlichen Versorgungsbereich als auch das Ausmaß der von Hausärzten angebotenen Raucherentwöhnungsmaßnahmen. Die Ziele in der "Smoking and Nicotine Dependence Awareness and Screening (SNICAS)"-Studie waren/sind: (1) die Ermittlung repräsentativer Daten zur Prävalenz des Rauchens und der Nikotinabhängigkeit in Deutschland, (2) die Beschreibung des Rauchverhaltens und der Aufhörmotivation von Rauchern in der primärärztlichen Versorgung sowie (3) die Feststellung von Einstellungen, Fertigkeiten und Erfahrungen von Hausärzten im Zusammenhang mit der Raucherentwöhnung. SNICAS basierte auf einem zweistufigen epidemiologischen Studiendesign, woran sich eine derzeit noch laufende, klinische Interventionskomponente anschloss. In Stufe I (Vorstudien-Fragebogen) wurde eine repräsentative Auswahl von 889 Ärzten (Allgemeinärzte, praktische Ärzte, Internisten) hinsichtlich Erfahrungen und Einstellungen zu Raucherentwöhnungsmethoden charakterisiert. In Stufe II wurde an einem Stichtag (7. Mai 2002) in diesen Praxen n = 28 707 unausgelesene, konsekutive Patienten zunächst mittels eines Patientenfragebogens untersucht (konservative Ausschöpfungsrate: 52,8%). Daran schloss sich für jeden einzelnen Patienten eine unabhängige, standardisierte Arztbeurteilung (Erhebung des Rauchstatus, des Gesundheitszustands, vergangener und aktueller Interventionen u.ä.) an. Der Beitrag enthält eine Darstellung von Design und Methode der SNICAS-Studie und berichtet über die Gewinnung, Ausschöpfung und Repräsentativität der Arzt- und Patientenstichprobe. Auf der Grundlage ausgewählter Daten des Vorstudien- Fragebogens, aus denen eine geringe Anzahl (17,6%) an sich intensiv mit der Raucherentwöhnung befassenden Ärzten hervorgeht, werden ärztliche Interventionsstrategien, aber auch Einstellungs- und Strukturbarrieren vorgestellt.Aims, Design and Methods of the "Smoking and Nicotine Dependence Awareness and Screening" (SNICAS) Study Germany lacks robust epidemiological data on the prevalence of smoking and nicotine dependence in primary care patients as it does on smoking cessation interventions provided by primary care physicians. Objectives of the "Smoking and Nicotine Dependence Awareness and Screening" (SNICAS) study are (1) to provide nationally representative data on the frequency of smoking and nicotine dependence among primary care patients in Germany, (2) to describe their smoking behaviour and motivation to quit as well as (3) attitudes, skills and experiences of physicians regarding smoking cessation. SNICAS is based on a 2-stage epidemiological design, supplemented by a subsequently conducted clinical intervention trial still ongoing. Stage I consists of a prestudy characterization of a nationwide sample of 889 primary care doctors (general practitioners, family doctors and internists with primary care functions). Stage II consists of a target day assessment (May 7th 2002) of n=28,707 unselected consecutive patients by means of a patient questionnaire (conservative response rate: 52.8%). For each patient a structured clinical appraisal form (screening of the patients' smoking status, physical and mental health, current and past interventions etc. ) was accomplished by the doctor. This article presents design and methods of the SNICAS study and describes its sampling strategy, its response rates and the representativity of primary care doctors and patients. By means of selected pre-study data, showing that only a small proportion of physician is extensively involved in smoking cessation (17.6%), intervention strategies of the doctors are presented as well as obstacles for smoking cessation (e.g. structures, attitudes)

Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle

BACKGROUND: Some yeasts have evolved a methylotrophic lifestyle enabling them to utilize the single carbon compound methanol as a carbon and energy source. Among them, Pichia pastoris (syn. Komagataella sp.) is frequently used for the production of heterologous proteins and also serves as a model organism for organelle research. Our current knowledge of methylotrophic lifestyle mainly derives from sophisticated biochemical studies which identified many key methanol utilization enzymes such as alcohol oxidase and dihydroxyacetone synthase and their localization to the peroxisomes. C1 assimilation is supposed to involve the pentose phosphate pathway, but details of these reactions are not known to date. RESULTS: In this work we analyzed the regulation patterns of 5,354 genes, 575 proteins, 141 metabolites, and fluxes through 39 reactions of P. pastoris comparing growth on glucose and on a methanol/glycerol mixed medium, respectively. Contrary to previous assumptions, we found that the entire methanol assimilation pathway is localized to peroxisomes rather than employing part of the cytosolic pentose phosphate pathway for xylulose-5-phosphate regeneration. For this purpose, P. pastoris (and presumably also other methylotrophic yeasts) have evolved a duplicated methanol inducible enzyme set targeted to peroxisomes. This compartmentalized cyclic C1 assimilation process termed xylose-monophosphate cycle resembles the principle of the Calvin cycle and uses sedoheptulose-1,7-bisphosphate as intermediate. The strong induction of alcohol oxidase, dihydroxyacetone synthase, formaldehyde and formate dehydrogenase, and catalase leads to high demand of their cofactors riboflavin, thiamine, nicotinamide, and heme, respectively, which is reflected in strong up-regulation of the respective synthesis pathways on methanol. Methanol-grown cells have a higher protein but lower free amino acid content, which can be attributed to the high drain towards methanol metabolic enzymes and their cofactors. In context with up-regulation of many amino acid biosynthesis genes or proteins, this visualizes an increased flux towards amino acid and protein synthesis which is reflected also in increased levels of transcripts and/or proteins related to ribosome biogenesis and translation. CONCLUSIONS: Taken together, our work illustrates how concerted interpretation of multiple levels of systems biology data can contribute to elucidation of yet unknown cellular pathways and revolutionize our understanding of cellular biology. ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL: The online version of this article (doi:10.1186/s12915-015-0186-5) contains supplementary material, which is available to authorized users

First Observation of Self-Amplified Spontaneous Emission in a Free-Electron Laser at 109 nm Wavelength

We present the first observation of Self-Amplified Spontaneous Emission (SASE) in a free-electron laser (FEL) in the Vacuum Ultraviolet regime at 109 nm wavelength (11 eV). The observed free-electron laser gain (approx. 3000) and the radiation characteristics, such as dependency on bunch charge, angular distribution, spectral width and intensity fluctuations all corroborate the existing models for SASE FELs.Comment: 6 pages including 6 figures; e-mail: [email protected]

Energy Estimation of Cosmic Rays with the Engineering Radio Array of the Pierre Auger Observatory

The Auger Engineering Radio Array (AERA) is part of the Pierre Auger Observatory and is used to detect the radio emission of cosmic-ray air showers. These observations are compared to the data of the surface detector stations of the Observatory, which provide well-calibrated information on the cosmic-ray energies and arrival directions. The response of the radio stations in the 30 to 80 MHz regime has been thoroughly calibrated to enable the reconstruction of the incoming electric field. For the latter, the energy deposit per area is determined from the radio pulses at each observer position and is interpolated using a two-dimensional function that takes into account signal asymmetries due to interference between the geomagnetic and charge-excess emission components. The spatial integral over the signal distribution gives a direct measurement of the energy transferred from the primary cosmic ray into radio emission in the AERA frequency range. We measure 15.8 MeV of radiation energy for a 1 EeV air shower arriving perpendicularly to the geomagnetic field. This radiation energy -- corrected for geometrical effects -- is used as a cosmic-ray energy estimator. Performing an absolute energy calibration against the surface-detector information, we observe that this radio-energy estimator scales quadratically with the cosmic-ray energy as expected for coherent emission. We find an energy resolution of the radio reconstruction of 22% for the data set and 17% for a high-quality subset containing only events with at least five radio stations with signal.Comment: Replaced with published version. Added journal reference and DO