Zellbiologische und biochemische Charakterisierung des Ustilago maydis Virulenzfaktors Mcs1(Myosin-Chitinsynthase 1)

Infektionen von Wirtspflanzen durch pathogene Pilze erfordert polares Spitzenwachstum, ein Prozess, der die kontinuierliche polare Anlieferung von Zellwandkomponenten und Enzymen, wie Chitinsynthasen (CHS), entlang des Cytoskeletts benötigt. Klasse V CHS sind als Virulenzfaktoren für die pathogene Entwicklung essentiell. Diese potentiellen molekularen Motoren bestehen aus einer Myosin-Motordomäne (MMD), die mit einer CHS-Domäne fusioniert sind. Letztere ist am Aufbau der pilzlichen Zellwand beteiligt, die Rolle der MMD bleibt bisher ungeklärt. Eine nahe liegende Rolle könnte die MMD-vermittelte Anlieferung sekretorischer Vesikel (Chitosomen) zur Wachstumszone sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss beider Domänen in Mcs1, der Klasse V CHS in U. maydis, untersucht. Durch quantitative Analysen von Krankheitssymptomen, Besiedlung der Pflanze und Auswertungen morphometrischer Parameter wurde gezeigt, dass beide Domänen essentielle, jedoch ungleiche Rollen, für die pathogene Entwicklung von U. maydis spielen. Während der Phänotyp der G3Mcs1Chsdead-Mutante dem der Deletionsmutante ähnelt, konnte die Besiedelung des Pflanzengewebes durch Stämme, die Defekte in der Motordomäne aufwiesen, noch teilweise erfolgen. mcs1-Deletionsmutanten und CHS-aktivitätsdefekte Stämme werden schnell durch das pflanzliche Abwehrsystem erkannt und getötet. Mutanten bei denen die MMD deletiert wurden verursachen nur eine abgeschwächte Abwehrreaktion. Der Verlust der Klasse V CHS Aktivität führt vermutlich zu gravierenden Mängeln in der Zellwandzusammensetzung, wodurch polares in planta Wachstum gestört und der Infektionsprozess verlangsamt wird. Eine Folge dessen ist eine starke pflanzliche Abwehrreaktion, die durch die Bildung von H2O2 und lokalem Zelltod charakterisiert ist. Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die apikale Mcs1-Lokalisierung von der eigenen MMD abhängt. Jedoch wurde auch beobachtet, dass noch wenige Chitosomen die Plasmamembran erreichen. Dadurch kann intrazelluläres Hyphenwachstum in begrenztem Maße erfolgen und U. maydis kann die Pflanzenzelle besiedeln. Eine Strukturanalyse verdeutlichte, dass trotz geringer Sequenzidentitäten die Mcs1 MMD der Struktur veröffentlichter Myosinmotoren ähnelt. Des Weiteren konnte belegt werden, dass die Mcs1 MMD an Aktin bindet und in der Lage ist Dimere auszubilden. In in vivo Motilitätsversuche wurde nachgewiesen, dass sich Mcs1-gebundende Chitosomen schnell und bi-direktional über lange Strecken bewegen und kurz bevor sie sekretiert werden in subapikalen Bereichen der Plasmamembran verharren. Die Insertion in die Membran erfolgt dabei selten und zufällig und es wurde gezeigt, dass die Verweildauer am Apex bei MMD-defizienten Mutanten signifikant verkürzt war. Wohingegen die apikale Mcs1-Akkumulation von F-Aktin und der eigenen MMD abhängt, spielen bei der Motilität von Chitosomen sowohl Aktin als auch Mikrotubuli eine Rolle und ist nicht abhängig von der MMD. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die eigene MMD nicht für die apikale Anlieferung verantwortlich ist, sondern eher lokale Funktionen in der Exozytose von Chitosomen übernimmt

Myosin-5, kinesin-1 and myosin-17 cooperate in secretion of fungal chitin synthase

The interactions between cytoskeletal motors are here explored in the context of polarized secretion in fungi, revealing unexpected complexity in the regulation of vesicle transport to and docking at the hyphal tip

Molecular profiling of single circulating tumor cells with diagnostic intention

Several hundred clinical trials currently explore the role of circulating tumor cell (CTC) analysis for therapy decisions, but assays are lacking for comprehensive molecular characterization of CTCs with diagnostic precision. We therefore combined a workflow for enrichment and isolation of pure CTCs with a non-random whole genome amplification method for single cells and applied it to 510 single CTCs and 189 leukocytes of 66 CTC-positive breast cancer patients. We defined a genome integrity index (GII) to identify single cells suited for molecular characterization by different molecular assays, such as diagnostic profiling of point mutations, gene amplifications and whole genomes of single cells. The reliability of >90% for successful molecular analysis of high-quality clinical samples selected by the GII enabled assessing the molecular heterogeneity of single CTCs of metastatic breast cancer patients. We readily identified genomic disparity of potentially high relevance between primary tumors and CTCs. Microheterogeneity analysis among individual CTCs uncovered pre-existing cells resistant to ERBB2-targeted therapies suggesting ongoing microevolution at late-stage disease whose exploration may provide essential information for personalized treatment decisions and shed light into mechanisms of acquired drug resistance

Disseminated cancer cells detected by immunocytology in lymph nodes of NSCLC patients are highly prognostic and undergo parallel molecular evolution

In melanoma, immunocytology (IC) after sentinel lymph node disaggregation not only enables better quantification of disseminated cancer cells (DCCs) than routine histopathology (HP) but also provides a unique opportunity to detect, isolate, and analyse these earliest harbingers of metachronous metastasis. Here, we explored lymph node IC in non-small cell lung cancer (NSCLC). For 122 NSCLC patients, 220 lymph nodes (LNs) were split in half and prepared for IC and HP. When both methods were compared, IC identified 22% positive patients as opposed to 4.5% by HP, revealing a much higher sensitivity of IC (p < 0.001). Assessment of all available 2,952 LNs of the same patients by HP uncovered additional patients escaping detection of lymphatic tumour spread by IC alone, consistent with the concept of skip metastasis. A combined lymph node status of IC and complete HP on a larger cohort of patients outperformed all risk factors in multivariable analysis for prognosis (p < 0.001; RR = 2.290; CI 1.407–3.728). Moreover, isolation of DCCs and single-cell molecular characterization revealed that (1) LN-DCCs differ from primary tumours in terms of copy number alterations and selected mutations and (2) critical alterations are acquired during colony formation within LNs. We conclude that LN-IC in NSCLC patients when combined with HP improves diagnostic precision, has the potential to reduce total workload, and facilitates molecular characterization of lymphatically spread cancer cells, which may become key for the selection and development of novel systemic therapies. © 2022 The Authors. The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland

Molecular profiling of single circulating tumor cells with diagnostic intention

Several hundred clinical trials currently explore the role of circulating tumor cell (CTC) analysis for therapy decisions, but assays are lacking for comprehensive molecular characterization of CTCs with diagnostic precision. We therefore combined a workflow for enrichment and isolation of pure CTCs with a non-random whole genome amplification method for single cells and applied it to 510 single CTCs and 189 leukocytes of 66 CTC-positive breast cancer patients. We defined a genome integrity index (GII) to identify single cells suited for molecular characterization by different molecular assays, such as diagnostic profiling of point mutations, gene amplifications and whole genomes of single cells. The reliability of >90% for successful molecular analysis of high-quality clinical samples selected by the GII enabled assessing the molecular heterogeneity of single CTCs of metastatic breast cancer patients. We readily identified genomic disparity of potentially high relevance between primary tumors and CTCs. Microheterogeneity analysis among individual CTCs uncovered pre-existing cells resistant to ERBB2-targeted therapies suggesting ongoing microevolution at late-stage disease whose exploration may provide essential information for personalized treatment decisions and shed light into mechanisms of acquired drug resistance

Zellbiologische und biochemische Charakterisierung des Ustilago maydis Virulenzfaktors Mcs1(Myosin-Chitinsynthase 1)

Infektionen von Wirtspflanzen durch pathogene Pilze erfordert polares Spitzenwachstum, ein Prozess, der die kontinuierliche polare Anlieferung von Zellwandkomponenten und Enzymen, wie Chitinsynthasen (CHS), entlang des Cytoskeletts benötigt. Klasse V CHS sind als Virulenzfaktoren für die pathogene Entwicklung essentiell. Diese potentiellen molekularen Motoren bestehen aus einer Myosin-Motordomäne (MMD), die mit einer CHS-Domäne fusioniert sind. Letztere ist am Aufbau der pilzlichen Zellwand beteiligt, die Rolle der MMD bleibt bisher ungeklärt. Eine nahe liegende Rolle könnte die MMD-vermittelte Anlieferung sekretorischer Vesikel (Chitosomen) zur Wachstumszone sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss beider Domänen in Mcs1, der Klasse V CHS in U. maydis, untersucht. Durch quantitative Analysen von Krankheitssymptomen, Besiedlung der Pflanze und Auswertungen morphometrischer Parameter wurde gezeigt, dass beide Domänen essentielle, jedoch ungleiche Rollen, für die pathogene Entwicklung von U. maydis spielen. Während der Phänotyp der G3Mcs1Chsdead-Mutante dem der Deletionsmutante ähnelt, konnte die Besiedelung des Pflanzengewebes durch Stämme, die Defekte in der Motordomäne aufwiesen, noch teilweise erfolgen. mcs1-Deletionsmutanten und CHS-aktivitätsdefekte Stämme werden schnell durch das pflanzliche Abwehrsystem erkannt und getötet. Mutanten bei denen die MMD deletiert wurden verursachen nur eine abgeschwächte Abwehrreaktion. Der Verlust der Klasse V CHS Aktivität führt vermutlich zu gravierenden Mängeln in der Zellwandzusammensetzung, wodurch polares in planta Wachstum gestört und der Infektionsprozess verlangsamt wird. Eine Folge dessen ist eine starke pflanzliche Abwehrreaktion, die durch die Bildung von H2O2 und lokalem Zelltod charakterisiert ist. Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die apikale Mcs1-Lokalisierung von der eigenen MMD abhängt. Jedoch wurde auch beobachtet, dass noch wenige Chitosomen die Plasmamembran erreichen. Dadurch kann intrazelluläres Hyphenwachstum in begrenztem Maße erfolgen und U. maydis kann die Pflanzenzelle besiedeln. Eine Strukturanalyse verdeutlichte, dass trotz geringer Sequenzidentitäten die Mcs1 MMD der Struktur veröffentlichter Myosinmotoren ähnelt. Des Weiteren konnte belegt werden, dass die Mcs1 MMD an Aktin bindet und in der Lage ist Dimere auszubilden. In in vivo Motilitätsversuche wurde nachgewiesen, dass sich Mcs1-gebundende Chitosomen schnell und bi-direktional über lange Strecken bewegen und kurz bevor sie sekretiert werden in subapikalen Bereichen der Plasmamembran verharren. Die Insertion in die Membran erfolgt dabei selten und zufällig und es wurde gezeigt, dass die Verweildauer am Apex bei MMD-defizienten Mutanten signifikant verkürzt war. Wohingegen die apikale Mcs1-Akkumulation von F-Aktin und der eigenen MMD abhängt, spielen bei der Motilität von Chitosomen sowohl Aktin als auch Mikrotubuli eine Rolle und ist nicht abhängig von der MMD. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die eigene MMD nicht für die apikale Anlieferung verantwortlich ist, sondern eher lokale Funktionen in der Exozytose von Chitosomen übernimmt

The myosinmotor domain of fungal chitin synthaseV is dispensable for vesicle motility but required for virulence of themaize pathogenUstilago maydis. Plant Cell 22:2476–2494

Class V chitin synthases are fungal virulence factors required for plant infection. They consist of a myosin motor domain fused to a membrane-spanning chitin synthase region that participates in fungal cell wall formation. The function of the motor domain is unknown, but it might deliver the myosin chitin synthase-attached vesicles to the growth region. Here, we analyze the importance of both domains in Mcs1, the chitin synthase V of the maize smut fungus Ustilago maydis. By quantitative analysis of disease symptoms, tissue colonization, and single-cell morphogenic parameters, we demonstrate that both domains are required for fungal virulence. Fungi carrying mutations in the chitin synthase domain are rapidly recognized and killed by the plant, whereas fungi carrying a deletion of the motor domain show alterations in cell wall composition but can invade host tissue and cause a moderate plant response. We also show that Mcs1-bound vesicles exhibit long-range movement for up to 20 mm at a velocity of ;1.75 mm/s. Apical Mcs1 localization depends on F-actin and the motor domain, whereas Mcs1 motility requires microtubules and persists when the Mcs1 motor domain is deleted. Our results suggest that the myosin motor domain of ChsV supports exocytosis but not long-range delivery of transport vesicles

Pit2 interacts with different apoplastic maize cysteine proteases and inhibits their activity.

<p>(<b>A</b>) Y2H assay showing interaction of Pit2 with the maize cysteine proteases CP1A, CP1B, CP2 and XCP2 but not with CatB. BD: Gal4 Binding Domain. AD: Gal4 Activation Domain. (<b>B</b>) Protease activity in fractionated apoplastic fluid of maize leaves after treatment with SA. Highest activity was observed in fractions at elution volume 19.5 ml and 20.5 ml. Protease activity was inhibited by treatment with 10 µM recombinant Pit2 or 5 µM E-64, respectively. (<b>C</b>) Protease activity in apoplastic fluid fractions 19.5 ml (dark grey) and 20.5 ml (light grey). Application of 1–10 µM recombinant Pit2 resulted in a concentration-dependent inhibition of protease activity. <b>D</b>) Activity based protein profiling of cysteine proteases in apoplastic fractions 19.5 ml and 20.5 ml using the specific probe DCG-04 shows inhibition of the apoplastic proteases by Pit2 and E-64. LC: loading control; error bars represent SEM.</p

Sequence conservation of Pit2 in related smut fungi and the role of a conserved domain for interaction with cysteine proteases.

<p>(<b>A</b>) Alignment of <i>U. maydis</i> Pit2 (Um01375) and orthologs from the barley covered smut fungus <i>Ustilago hordei</i> (Uh02064) and the maize anther smut <i>Sporisorium reilianum</i> (Sr10529). Red box marks predicted secretion signals. Magenta labels identical (dark) and similar (light) amino acid residues. Orange box shows a 14 amino acid, highly conserved sequence stretch (residues 44–57). Green box marks the four aromatic residues that were addressed by targeted mutagenesis (see <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003177#ppat-1003177-t001" target="_blank">Table 1</a>). (<b>B</b>) Y2H analysis of Pit2 mutants carrying deletions of the conserved domain shown in (A). (<b>C</b>) Y2H of Pit2 mutants carrying mutations of the conserved domain shown in (A) and <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003177#ppat-1003177-t001" target="_blank">Table 1</a>. BD: Gal4 Binding Domain. AD: Gal4 Activation Domain.</p