Biological Evaluation of Medical Devices in the Form of Suppositories for Rectal and Vaginal Use

Проблематика. Програми доклінічного вивчення безпеки продуктів у системі охорони здоров’я залежать від регуляторного статусу досліджуваних продуктів. Класифікування таких продуктів, зокрема супозиторіїв для ректального та вагінального застосування, є критичним етапом для розробки тактики їх біологічного оцінювання. Актуальними для біомедицини залишаються питання адаптації методів біологічного оцінювання медичних виробів на основі комбінації біологічно активних речовин, а також оцінки результатів такого оцінювання. Мета. Здійснити обґрунтування регуляторного статусу та біологічне оцінювання медичних виробів у формі вагінальних супозиторіїв на основі октенідину дигідрохлориду (“Продексин”) та у формі ректальних супозиторіїв на основі екстрактів рослин Saw palmetto, Levisticum officinale і Calendula officinalis (“Правенор”). Методика реалізації. Біологічне оцінювання проводили згідно з вимогами стандартів серії ISO 10993 за допомогою біологічних тест-систем in vitro та in vivo (цитотоксичність у культурі клітин та у МТТ-тесті, сенсибілізуюча та подразнювальна дія на мурчаків). Результати. Цитотоксичність (СС50) екстракту медичного виробу “Продексин” на культурі клітин Vero становила 8,35 мкг/мл у перерахунку на октенідину дигідрохлорид та 416,65 мкг/мл у перерахунку на декспантенол. Медичній виріб “Правенор” виявився нетоксичним на культурі клітин Vero. За результатами МТТ-тесту СС50 для октенідину дигідрохлориду становила 1,67 мкг/мл, декспантенолу – 83,33 мкг/мл. СС50 у перерахунку на активні інгредієнти медичного виробу “Правенор” становила 50 мг/мл для екстракту ягід карликової пальми (Saw palmetto), 16,67 мг/мл для екстракту коренів любистку лікарського (Levisticum officinale), 16,67 мг/мл для екстракту квіток нагідок лікарських (Calendula officinalis). Для медичних виробів не було виявлено сенсибілі­зуючої та шкіроподразнювальної дії на мурчаків. Висновки. Біологічне оцінювання медичних виробів у формі ректальних супозиторіїв “Правенор” і вагінальних супозиторіїв “Продексин”, проведене із використанням біологічних систем in vitro та in vivo, засвідчило прийнятний рівень безпечності цієї продукції. При визначенні цитотоксичності МТТ-тест виявився у 5 разів чутливішим порівняно з методом на основі культури клітин Vero.Background. Programs of preclinical safety studies of the health care products depend on the regulatory status of the investigated products. The classification of such products, in particular suppositories for rectal and vaginal use, is a critical step of developing tactics for their biological evaluation. Adaptation of biological evaluation methods for the medical devices based on the combination of biologically active substances, as well as evaluation of the results of such studies is urgent task of biomedicine. Objective. To substantiate the regulatory status and to carry out a biological evaluation of medical devices in the form of vaginal suppositories based on octenidine dihydrochloride ("Prodexyn") and in the form of rectal suppositories based on Saw palmetto, Levisticum officinale and Calendula officinalis extracts ("Pravenor"). Methods. Biological evaluation was conducted according to the requirements of ISO 10993 standards using in vitro and in vivo biological test systems (cytotoxicity in cell culture and the MTT test, sensitizing and irritating effect in guinea pigs). Results. The cytotoxicity (СС50) of the medical device "Prodexyn" extract in Vero cell culture was 8.35 μg/ml calculated as octenidine dihydrochloride and 416.65 μg/ml calculated as dexpanthenol. "Pravenor" medical device was found to be non-toxic in Vero cell culture. According to the results of MMT assay CC50 for octenidine dihydrochloride was 1.67 μg/ml, and 83.33 μg/ml – for dexpanthenol. CC50 indicators calculated for the different active ingredients of the medical device "Pravenor" were the following: 50 mg/ml for the dwarf palm berries extract (Saw palmetto), 16.67 mg/ml for the lovage roots extract (Levisticum officinale), and 16.67 mg/ml for the calendula flowers extract (Calendula officinalis). No sensitizing or skin irritating effects were observed in guinea pigs. Conclusions. Biological evaluation of medical devices in the form of rectal suppositories "Pravenor" and vaginal suppositories "Prodexyn" performed using in vitro and in vivo biological systems. It was demonstrated an acceptable level of safety of the products. The MTT test was 5 times more sensitive than the Vero cell culture method in determination of cytotoxicity

Методы оценки биологической активности рекомбинантного интерлейкина-7 человека и исследование стабильности препарата на его основе

Проблематика. Інтерлейкін-7 є одним із найважливіших регуляторних цитокінів імунної системи. Рекомбінантний інтер­лейкін-7 людини (рІЛ-7) у водних розчинах піддається механізмам хімічного розкладання, таким як протеоліз, окиснення, дисульфідний обмін, олігомеризація тощо. Подібні зміни впливають на строк придатності препарату на основі рІЛ-7. Оцінку біологічної активності рІЛ-7 можна проводити через його противірусну активність. Мета дослідження. Порівняння методів інгібіції репродукції вірусів грипу, простого герпесу та гепатиту С рекомбінантним інтерлейкіном-7 людини та дослідження стабільності препарату на його основі. Методика реалізації. У роботі використовували перещеплювані культури клітин: нирки собак, нирки бика та нирки африканської зеленої мавпи Vero. Використовували такі віруси: сурогатний вірус гепатиту С (вірус бичачої вірусної діареї (ВБВД)), вірус грипу (штам А/FM/1/47(H1N1)), вірус простого герпесу 2 типу (ВПГ-2) (штам ВН). Для визначення антивірусної активності рІЛ-7 в умовах in vitro використовували добову перещеплювану культуру клітин. Клітини вирощували на середовищі RPMI-1640. Результати дослідження. Показано, що рІЛ-7 у буферних стабілізуючих розчинах і культуральному середовищі через 1 тиждень зберігання був активним до розведення 0,003 мкг/мл проти вірусу ВБВД. За результатами досліджень антивірусної активності препарату рІЛ-7 у буферних розчинах та культуральному середовищі проти вірусу грипу А/FM/H1N1 можна зробити висновок, що зберігання препарату в буферних розчинах і в інтактному стані за температурі 4 °С протягом 1 тижня не впливало на його антивірусну активність. Показано, що антигерпетична активність препаратів через 1 тиждень зберігання за температури 4 °С у буферних стабілізуючих розчинах та інтактному стані залишалася ефективною. Антивірусна активність препаратів у стабілізуючому розчині зберігалася упродовж 3-х місяців за температури 4 °С, а в інтактному стані рІЛ-7 втрачав свою антивірусну активність через 1 тиждень відносно вірусу герпесу і через 1 місяць відносно ВБВД. Висновки. Розроблено методики оцінки противірусної активності рІЛ-7 відносно ВБВД, вірусу грипу, а також ВПГ-2. Доведено, що запропоновані нами буферні стабілізуючі розчини забезпечують високий рівень біологічної активності препаратів рІЛ-7 при їх зберіганні за температури 4 °С упродовж 3-х місяців, що є передумовою для розробки на їх основі рідких лікарських форм фармацевтичних препаратів.Background. Interleukin-7 is one of the most important immune regulatory cytokines. Recombinant human interleukin-7 (rIL-7) in aqueous solution is subjected to chemical degradation mechanisms such as proteolysis, oxidation, disulfide exchange, oligomerisation etc. Such changes affect the shelf life of the preparation on the basis of rIL-7. Evaluation of the biological activity of rIL-7 can be carried out by assessing its antiviral activity. Objective. Comparison of methods for inhibiting reproduction of the influenza virus, herpes simplex virus and hepatitis C virus with recombinant human interleukin-7 and research stability of the preparation on the basis of rIL-7. Methods. We used immortalized cells: the kidneys of dogs, the bovine kidneys and kidneys of African green monkey Vero. The following viruses were used: hepatitis C virus surrogate (bovine viral diarrhea virus, BVDV), influenza virus (strain A/FM/1/47 (H1N1)), herpes simplex virus type 2 (HSV-2) (BH strain). To determine the antiviral activity of rIL-7 in vitro conditions using daily, immortalized cells. Cells were grown in RPMI-1640 medium. Results. It was shown that rIL-7 in buffer stabilizing solutions and the culture medium after 1 week of storage was active at a dilution of 0.003 g/ml against BVDV. The study results of antiviral activity of rIL-7 drug in buffer solutions and culture medium against influenza virus A/FM/H1N1 can conclude that storage of the drug in buffer solution and in the intact state at 4 °C for one week has not affected its antiviral activity. It was shown that antiherpetic activity of preparations after 1 week of storage at 4 °C in buffer stabilizing solutions and intact state remained effective. The antiviral activity of drugs in a stabilizing solution has been persisted for 3 months at 4 °C, and in the intact state of rIL-7 lost its antiviral activity after 1 week against the herpes virus, and after 1 month regarding BVDV. Conclusions. Methods for assessing the antiviral activity of rIL-7 towards BVDV, influenza virus, and HSV-2 were developed. It has been proven that the stabilizing buffer solutions proposed by us provide a high level of biological activity of rIL-7 preparations during storage at 4 °C for 3 months, which is a prerequisite for the development of liquid dosage forms of pharmaceutical preparations on their basis.Проблематика. Интерлейкин-7 является одним из важнейших регуляторных цитокинов иммунной системы. Рекомбинантный интерлейкин-7 человека (рИЛ-7) в водных растворах подвергается механизмам химического разложения, таким как протеолиз, окисление, дисульфидный обмен, олигомеризация и т.д. Подобные изменения влияют на срок годности препарата на основе рИЛ-7. Оценку биологической активности рИЛ-7 можно проводить посредством оценки его противовирусной активности. Цель исследования. Сравнение методов ингибирования репродукции вирусов гриппа, простого герпеса и гепатита С рекомбинантным интерлейкином-7 человека и исследование стабильности препарата на его основе. Методика реализации. В работе использовали перевиваемые культуры клеток: почки собак, почки быка и почки африканской зеленой мартышки Vero. Использовали такие вирусы: суррогатный вирус гепатита С (вирус бычьей вирусной диареи (ВБВД)), вирус гриппа (штамм А/FM/1/47 (H1N1)), вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) (штамм ВН). Для определения антивирусной активности рИЛ-7 в условиях in vitro использовали суточную перевиваемую культуру клеток. Клетки выращивали на среде RPMI-1640. Результаты исследования. Показано, что рИЛ-7 в буферных стабилизирующих растворах и культуральной среде через 1 неделю хранения был активным в разведении 0,003 мкг/мл против вируса ВБВД. По результатам исследований антивирусной активности препарата рИЛ-7 в буферных растворах и культуральной среде против вируса гриппа А/FM/H1N1 можно сделать вывод, что хранение препарата в буферных растворах и в интактном состоянии при температуре 4 °С в течение 1 недели не влияло на его антивирусную активность. Показано, что антигерпетическая активность препаратов через 1 неделю хранения при температуре 4 °С в буферных стабилизирующих растворах и интактном состоянии оставалась эффективной. Антивирусная активность препаратов в стабилизирующем растворе сохранялась в течение 3-х месяцев при температуре 4 °С, а в интактном состоянии рИЛ-7 терял свою антивирусную активность через 1 неделю в отношении вируса герпеса и через 1 месяц в отношении ВБВД. Выводы. Разработаны методики оценки противовирусной активности рИЛ-7 по отношению к ВБВД, вирусу гриппа, а также ВПГ-2. Доказано, что предложенные нами буферные стабилизирующие растворы обеспечивают высокий уровень биологической активности препаратов рИЛ-7 при их хранении при температуре 4 °С в течение 3-х месяцев, что является предпосылкой для разработки на их основе жидких лекарственных форм фармацевтических препаратов

ANTIVIRAL ACTIVITY OF LIPOPOLYSACCHARIDES OF Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens

The aim of the study was to investigate the ability of lipopolysaccharides of two strains of Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens to inhibit in vitro the reproduction of human viruses: influenza A/FM/1/47 (H1N1), herpes simplex type 2 and bovine diarrhea, which is used as a model of hepatitis C virus, as well as to suppress hepatitis C virus production in model system of cells transfected with cDNA of this virus. It has been established that for both lipopolysaccharides in three types of cultures (MDCK, Vero and MDBK) the toxicity is not manifested even in a concentration of 100.0 μg/ml, and decreasing in infectious virus titer more than by 2.0 lg TCD50 (ED99) was already achieved at concentrations of 1.55 mg/ml. Selectivity indexes determination of lipopolysaccharides preparations against the influenza A/FM/1/47 (H1N1) virus, herpes simplex virus type 2 and bovine diarrhea virus shows that lipopolysaccharides of P. chlororaphis subsp. aureofaciens UCM B-306 and UCM B-111 are effective inhibitors of investigated viruses reproduction: selectivity index is at least 64. In the model of Jurkat cells transfected with human hepatitis C virus cDNA, viral RNA loading was determined in cells treated with lipopolysaccharides of P. chlororaphis subsp. aureofaciens. The results of the studies indicate that when lipopolysaccharides of both strains are administered, the production of the hepatitis C virus is completely inhibited

АНТИГЕРПЕТИЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ПРОБІОТИЧНИХ ШТАМІВ ЛАКТО- ТА БІФІДОБАКТЕРІЙ ЗА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ГЕНІТАЛЬНОГО ГЕРПЕСУ У МУРЧАКІВ

Метою було визначення антигерпетичної ефективності пробіотичного штаму Lacto­bacillus casei ІМВ В-7280 та композиції L. caseі ІМВ В-7280 – Bifidobacterium animalis VKL – B. animalis VKВ (В-7280 – VKL – VKВ) за експериментального генітального герпесу в мурчаків, індукованого вірусом простого герпесу 2-го типу (ВПГ-2). Матеріали і методи. Генітальну герпетичну інфекцію моделювали за допомогою ВПГ-2 (штам ВН) у самиць безпородних мурчаків. Критеріями оцінки ступеня тяжкості інфекційного процесу були: площа і ступінь специфічних уражень, а також наявність набряку, гіперемії й виразок. У сироватці крові тварин визначали титр ВПГ-2 за допомогою загальноприйнятих вірусологічних методів дослідження. Спектр мікробіоти піхви тварин визначали за допомогою загальноприйнятих мікробіологічних методів дослідження. Ефективність дії пробіотичних бактерій оцінювали за максимального розвитку патологічного процесу: за згасанням клінічних проявів захворювання та інфекційного титру ТЦД ID50 ВПГ-2, а також скороченням термінів захворювання та індексом лікувальної дії (ІЛД). Результати досліджень та їх обговорення. Встановлено, що за експериментального генітального герпесу у мурчаків при застосуванні пробіотичного штаму L. caseі ІМВ В-7280 та композиції В-7280 – VKL – VKВ зменшувались: ступінь клінічних симптомів захворювання, його тривалість, а також інфекційний титр ВПГ-2, хоч ІЛД не перевищував 50 %. Під впливом L. caseі ІМВ В-7280 та композиції відбувалось зменшення інфекційного титру ТЦД ID50 ВПГ-2, що свідчить про антигерпетичну ефективність цих пробіотичних штамів бактерій, у механізми якої може залучатись зміна мікробіоти піхви. Мікробіологічний пейзаж піхви за максимальної яскравості клінічних симптомів генітального герпесу характеризувався зниженням кількості стафілококів у піхві інфікованих мурчаків, яким вводили L. caseі ІМВ В-7280, при високому рівні цих бактерій за умови застосування композиції В-7280 – VKL – VKВ, а також появою в окремих тварин лактобацил (ЛАБ). Зауважимо, що виділені нами в кінці експерименту ЛАБ за своєю морфологією відрізнялися від лактобактерій, використаних в експерименті. Тобто можна припустити, що відбулося відновлення характерної для мурчаків нормальної мікробіоти піхви. Висновок. Штам L. caseі ІМВ В-7280 та композиція В-7280 – VKL – VKВ є перспективними для розробки цільових пробіотиків для профілактики й лікування інфекційно-запальних хвороб сечостатевої системи.Aim. The aim was to determine the antiherpetic effectiveness of the Lactobacillus casei IMV B-7280 probiotic strain and L. caseі ІМV В-7280 – Bifidobacterium animalis VKL – B. animalis VKВ (В-7280 – VKL – VKВ) composition on the experimental model of genital herpes in guinea pigs induced by herpes simplex virus type 2 (HSV-2). Materials and methods. Genital herpetic infection was modeled using HSV-2 (strain BH) on female non-breeding guinea pigs. The criteria for assessing the severity of the course of the infectious process were: the area and the degree of specific lesions, as well as the presence of edema, hyperemia and ulcers. HSV-2 titer was determined in blood serum by using common virological methods of research. The spectrum of microbiota in the vagina of animals was determined using generally accepted microbiological methods. The effectiveness of the probiotic bacteria was evaluated during the maximum development of the pathological process: the decrease in the severity of clinical manifestations of the disease and TCD ID50 infectious titer of HSV-2, as well as the reduction of terms of the disease and therapeutic index (TI). Results and discussion. It was established that in cases of experimental genital herpes in guinea pigs, treatment with L. casei IMV B-7280 probiotic strain or B-7280 - VKL - VKB composition reduced: the severity of clinical symptoms of the disease, the duration of its course, and the infectious titer of HSV-2, though TI did not exceed 50 %. Under the influence of L. casei IMV B-7280 and the composition, there was a decrease in the TCD ID50 infectious titer of HSV-2, which indicates the anti-herpetic efficacy of these probiotic strains, whose mechanisms may involve the change of vaginal microbiome. The microbiological parameters of the vagina at the maximum severity of clinical symptoms of genital herpes were characterized by a decrease in the number of staphylococci in the vagina of infected guinea pigs treated with L. casei IMV B-7280 with a high level of these bacteria after treating of guinea pigs with B-7280 – VKL – VKB composition, as well as lactobacilli (LAB) appearance in individual animals. It should be noted that LAB detected by us at the end of the experiment, differed from the lactobacilli used in the experiment by morphological characteristics. So, we can assume that there has been a restoration of the normal vagina microbiota specific for guinea pigs. Conclusions. L. casei IMV B-7280 strain and B-7280 – VKL – VKB composition are promising for the development of target probiotics for the prevention and treatment of infectious-inflammatory diseases of the genitourinary system

Antiviral properties of herbal flavonoids – inhibitors of the DNA and RNA synthesis

Aim. To investigate influence of the Deschampsia caespitosa L. and Calamagrostis epogeios L. herbal extract (HE) and its main components – quercetin derivatives – on the DNA and RNA synthesis; to per- form comparative analysis of their antiviral activities. Methods. The model transcription system of bacteriophage T7 (RNAP T7) and polymerase chain reaction (PCR) were used as test systems. For antiviral studies there were employed models of influenzal and herpetic infections and hepatitis C. Results. It was shown, that HE, its major component 7, 3'-dimetoxyquercetin (DMQ) its minor component 5,7,3',4'-tetrametho- xyqeercetin (TMQ) effectively inhibited the RNA synthesis in the RNAP T7 system with the corresponding values of IC50 – 0.07, 4 and 1 µg/ml. Minimal concentrations of the agents IC90, completely inhibiting PCR, were – 8, 30 and 40 µg/ml for HE, TMQ and DMQ, accordingly. All the studied preparations revealed high multiple antiviral activities against the RNA- and DNA-containing viruses. Conclusions. Antiviral activity of the herbal extract is likely determined by the combined action of its components, TMQ and DMQ including. Bearing in mind multi-target profile of quercetin derivatives, an assumption may be made, that antiviral mechanism of the agents studied consists in blocking of enzymatic systems of the RNA and DNA synthesis

Evaluation of antibacterial and antiviral activity of N-arylamides of 9-methyl and 9-methoxyphenazine-1-carboxylic acids – inhibitors of the phage T7 model transctiption

Aim. Search for compounds with antibacterial and antiviral properties among N-arylamides of 9-substituted phenazine-1-carboxylic acids (PCA), inhibitors of the RNA synthesis. Methods. Influence of N-aryl-amides on the RNA synthesis was tested in vitro in the model system of the DNA-dependent RNA polymerase of phage T7 (T7 RNAP). Antimicrobial activities of the N-arylamides against bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae VR-2 var. IVM, Klebsiella spp. and Escherichia coli ATCC25922 were investigated by the method of two-fold dilution in a liquid medium. Antiviral effects against Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and cytotoxicity of the N-arylamides were evaluated using Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells. Results. Twenty N-arylamides appeared to be efficacious inhibitors of the RNA synthesis at concent- rations of 0.48–61 µМ. The compound 16 proved to be the most effective inhibitor of T7 RNAP with the IC50 value being 0.48 µМ. Fourteen N-arylamides demonstrated antibacterial properties against gram positive and gram negative bacteria at the 0.1–10 µg/ml concentrations. A number of the N-arylamides revealed a multiplicity of their antimicrobial actions: 7 compounds against two bacteria and two compounds, 2 and 3, against three bacteria investigated. N-arylamides 16 and 26 showed high inhibitory activity as to BVDV with the IC50 values 0.43 and 0.88 µg/ml and SI values 160 and 10 correspondingly. Conclusions. The obtained data evidence that the most likely targets of the N-arylamides 9-substituted PCA in bacteria and viruses are their RNA synthesizing complexes