Anjiyotensin dönüştürücü enzim ve anjiyotensin II tip 1 reseptörü gen polimorfizmlerinin Trakya bölgesindeki Türk hastalarda görülen iskemik inme ile ilişkisi

Amaç: Bu çalışmanın amacı, Trakya bölgesinde yaşayan iskemik inme geçirmiş hastalarda ACE insersiyon/delesyon (I/D) ve AT1R (A1166C) gen polimorfizmlerinin sıklığını, vasküler risk faktörleri ve inme alt-grupları ile ilişkisini araştırmaktır. Hastalar ve Yöntemler: Çalışmaya 162 iskemik inme geçirmiş hasta ile 146 sağlıklı olgu alındı. İskemik inme hastaları, ORG 10172 Akut İnme Tedavisi (TOAST) kriterlerine göre büyük ve küçük damar hastalığı olarak inme alt gruplarına ayrıldı. ACE I/D polimorfizmi polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), AT1R (A1166C) gen polimorfizmi ise PZR ve restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemleri kullanılarak yapıldı. Bulgular: Hasta grubundaki ACE I/D genotip dağılımı (DD=34.0%, ID=50.0%, II=16.0%), kontrol grubu ile karşılaştırıldığında (DD=34.3%, ID=49.7%, II=16.1%) fark bulunmadı. Ayrıca hasta grubundaki AT1R (A1166C) genotip dağılımları ile (AA=58.0%, CA=34.6% ve CC=7.4%) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında (AA=60.1%, CA=35.7% ve CC=4.2%) anlamlı fark saptanmadı. Her iki inme alt grubu arasında ACE I/D ve AT1R (A1166C) polimorfizmlerinin dağılımı açısından farklılık bulunmadı. Sonuç: Çalışmamızda Trakya bölgesinde yaşayan insanlarda ACE I/D ve AT1R (A1166C) gen polimorfizmlerinin iskemik inme gelişmesinde genetik risk faktörleri olmadıkları belirlendi.Objectives: The aim of this study was to investigate the frequency of ACE insertion/deletion (I/D) and AT1R (A1166C) gene polymorphisms in ischemic stroke patients in Trakya region and the relation between these gene polymorphisms and stroke subtypes and vascular risk factors. Patients and Methods: The study involved 162 patients with ischemic stroke and 146 control subjects. Ischemic stroke patients were divided into large and small vessel disease subgroups according to ORG 10172 in Acute Stroke Treatment TOAST criteria. The ACE I/D polymorphism was investigated using polymerase chain reaction (PCR), and the AT1R (A1166C) polymorphism was identified using PCR and restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay. Results: The ACE I/D genotype distribution in patients (DD=34.0%, ID=50.0%, II=16.0%) did not differ from those in controls (DD=34.3%, ID=49.7%, II=16.1%). The AT1R A1166C genotype distribution in patients (AA=58.0%, CA=34.6%, CC=7.4%) did not significantly differ from those in controls (AA=60.1%, CA=35.7%, CC=4.2%). There was also no difference among the stroke subgroups regarding the distribution of ACE I/D and AT1R (A1166C) polymorphisms. Conclusion: Our results show that ACE I/D and AT1R (A1166C) gene polymorphisms were not genetic risk factors for ischemic stroke in subjects in Trakya region

ACE:n ja ACTN3:n vaikutus urheilusuoritukseen

Tiivistelmä. Tutkielmassani käyn läpi geenien vaikutusta urheilusuoritukseen ja menestymiseen huippu-urheilussa. Geenejä, joiden on osoitettu vaikuttavan urheilusuoritukseen, on löydetty monia, mutta tässä tutkielmassa keskityin kahteen eri geeniin. Valitsemani geenit olivat ACTN3 ja ACE. Näistä kahdesta geenistä on tehty paljon tutkimusta ja niiden on osoitettu olevan merkittävimpiä urheilusuoritukseen vaikuttavia geenejä. Tarkastelin geenejä sillä perusteella, vaikuttavatko ne kestävyyttä vaativissa urheilulajeissa vai nopeutta ja voimaa vaativissa urheilulajeissa. Tutkielman tavoitteena on selvittää ACE:n ja ACTN3:n vaikutukset erilaisissa urheilusuorituksissa. Tutkielmasta käy ilmi, että molemmilla geeneillä on suuri vaikutus urheilusuoritukseen. ACE:ssa tapahtuva insertio saa aikaan positiivisia vaikutuksia kestävyysurheilussa, kun taas ACTN3:n on todettu olevan merkittävässä roolissa voimaa ja nopeutta vaativissa lajeissa. ACE:n deleetion ei ole osoitettu olevan yhtä merkittävässä roolissa urheilusuorituksessa kuin ACE:n insertion. ACE:n deleetiosta on saatu viitteitä, että se voisi vaikuttaa positiivisesti nopeutta ja voimaa vaativissa lajeissa, mutta eri tutkimuksissa on saatu ristiriitaisia tuloksia eikä voida sanoa, että ACE:n deleetio vaikuttaisi positiivisesti urheilusuoritukseen. ACTN3:ssa tapahtuvan mutaation on havaittu vaikuttavan negatiivisesti voimaa ja nopeutta vaativissa lajeissa. Geenien voidaan olettaa olevan merkittävässä roolissa kaikessa ihmisten toiminnassa, joten niiden vaikutus urheilusuorituksessa oli odotettua. Ainoastaan ajoittainen ristiriitaisuus eri tutkimusten välillä ja erityisesti eri etnisyyden omaavien ihmisten välillä oli hieman odottamatonta. Urheilusuoritukseen vaikuttavat geenien lisäksi niin monet muutkin tekijät, että yhtenäisiä ja selkeitä tuloksia voi olla vaikea saada. Myös eri urheilulajien vaatimukset ovat erilaisia. Tutkimusta onkin hankala tehdä lajeilla, jotka vaativat sekä hyviä nopeus-, voima- että kestävyysominaisuuksia. Tulevaisuudessa yleistyy varmasti perimän tutkiminen jo lapsilla, jotta voidaan selvittää esimerkiksi, mihin urheilulajiin lapsen kannattaa panostaa, jos hän haluaa menestyä omassa lajissaan. Myös useamman geenin tutkimus, jossa pyritään selvittämään, miten geenit vaikuttavat yhdessä, on varmasti yhä yleisempää tulevaisuudessa. Tulevaisuudessa geenien tutkiminen voikin antaa yhä enemmän vastauksia siihen, miksi tietyt henkilöt menestyvät urheilussa paremmin kuin toiset. Vastauksia voidaan myös saada siihen, miksi toiset ihmiset saavat paremman vasteen tietynlaiselle harjoittelulle kuin toiset

Strukturelle Veränderungen des Rattenherzens bei chronischer Hypertonie und ihre Beeinflussung durch den ACE-Hemmer Ramipril

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Bluthochdrucks auf die Morphologie des Rattenherzens untersucht. Zusätzlich konnten Aussagen darüber getroffen werden, ob die antihypertensive Behandlung mit dem ACE-Hemmer Ramipril die hochdruckbedingten Umbauprozesse des Rattenmyokards verhindern oder gar umkehren kann. Lichtmikroskopisch bzw. immunhistochemisch wurden die Herzen von 60 Ratten untersucht. Drei Rattenpopulationen wurden für diese Studie gewählt: - normotensive Wistar-Kyoto-Ratten (WKR), - Spontan-Hypertensive-Ratten (SHR) - Spontan-Hypertensive-Ratten-Stroke-Prone (SHR-SP) . Die Tiere wurden vor der Sektion behandelt: - mit einem Placebo, - Ramipril in subantihypertensiver Dosierung (10 myg.kg-1.d-1) - Ramipril in antihypertensiver Dosierung (1 mg.kg-1.d-1) Es wurden vier Sektionstermine gewählt: - Sektion der Jungtiere (K), - Erste Zwischensektion (Z), - Zweite Zwischensektion (Z2), - Endsektion (E). Lichtmikroskopisch wurden die Rattenherzen im Anschluss an die Hämatoxylin-Eosin-Färbung bzw. die Van-Giesonschen-Färbung untersucht. Wir ermittelten hierbei den Grad der geweblichen Schädigung und bestimmten das Maß des fibrotischen Gewebsumbaus. Die Immunhistochemie wurde mit Antikörpern gegen Kollagen VI, Vimentin, VEGF, PDGF, und CD 45 LCD durchgeführt. Zusätzlich wurde die Apoptoserate durch ein der Immunhistochemie nahe verwandtes Verfahren, des sog. TUNEL-Methode, bestimmt. Wir kommen zu folgenden Ergebnissen: Es kommt im Verlauf des Lebens der unbehandelten gesunden Wistarratte zu deutlichen myokardialen Umbauprozessen. Diese manifestieren sich teilweise schon im Alter von einem Monat. Hier liegt die Schlussfolgerung nahe, dass der Alterungsprozess per se mit einer degenerativen Gewebsveränderung mit prädominierender Gewebsfibrose einhergeht. Der myokardiale Schaden, den beide Hochdruckpopulationen erleiden, ist in Art und Ausprägung deutlicher als bei den Wistartieren. Hierbei ist der Grad der Schädigung abhängig von der Höhe und der Dauer des Blutdrucks. Die Manifestation der hypertensiven Herzschädigung erfolgt schon bei den Jungtieren. Gravierende Befunde lassen sich jedoch erst bei den erwachsenen Tieren nachweisen. Die Anzahl von vimentinpositiven Myozyten steigt sowohl mit der Höhe des Blutdrucks als auch mit der Dauer des hypertensiven Krankheitsgeschehens. Dieser Dedifferenzierungsprozess kann als Parameter für das Maß der kardialen Schädigung herangezogen werden. Der Querdurchmesser der Myozyten steigt sowohl mit der Höhe des Blutdrucks als auch der Wirkdauer der Hypertonie. Das Maß der gewebliche Markierung von VEGF steht im direkten Zusammenhang mit dem Grad der hypertensiven Herzschädigung. Je stärker der myokardiale Schaden, desto höher die VEGF-Konzentration im Gewebe. Das Ergebnis lässt sich auf die Hochdruckjungtiere übertragen. Bezüglich der myokardialen Kapillardichte kommen wir zu dem Ergebnis, dass es mit zunehmendem Alter der Tiere zu einer Abnahme der Kapillardichte kommt. Dieser Prozess wird moduliert sowohl durch die Höhe als auch die Dauer der Hypertension. Die Dauer und die Ausprägung des Bluthochdrucks spiegeln sich in Größe und Anzahl von leukozytären Infiltraten wider. Der apoptotische Zelluntergang spielt beim hochdruckbedingtem Myozytenuntergang keine Rolle. Die Herzmuskelzellen gehen hier vorwiegend durch nekrotische Prozesse zugrunde. Abschließend lässt sich sagen, dass Ramipril das Rattenherz vor diesen druckbedingten Schäden schützt. Dabei ist die High-dose-Behandlung der Low-dose-Behandlung überlegen. Die von uns konstatierten Befunde untermauern die sich in den letzten Jahren herauskristallisierte Meinung, dass der Bluthochdruck nicht nur als Risikofaktor für die Entstehung atherosklerotischer Veränderungen des Gefäßsystems anzusehen ist, sondern auch unabhängig davon die Entstehung der Herzhypertrophie begünstigt. Umso wichtiger wird damit die frühzeitige und suffiziente Behandlung der arteriellen Hypertonie. Aufgrund der Pathogenese beider Krankheitsbilder halten wir die Verabreichung eines ACE-Hemmers bei diesem Krankheitsbild für unerlässlich. Er wirkt nicht nur symptomorientiert durch eine Minderung des Blutdrucks, sondern greift in das komplizierte Gefüge des RAAS ein und verhütet damit auch die Entstehung der Herzhypertrophie

Genetic factors affecting the response of skeletal muscle to strength training

The aim of this study was to investigate the influence of Angiotensin-I 3 Converting Enzyme (ACE) genotype and the influence of circulating ACE activity 4 on the extent of muscle growth and strength development achieved during 5 strength training. It was hypothesized that ACE Deletion (D) allele carriers would 6 have higher force output values before and after the 12 week strength training 7 programme. Forty male Caucasian recreationally active volunteers were 8 genotyped for ACE Insertion/Deletion (I/D) polymorphism, but only eighteen 9 subjects identified with the DD or the II genotype were qualified to participate. 10 Eleven II and seven DD subjects underwent a 12 week strength training program 11 for the quadriceps muscle group of the trained leg, with both legs assessed 12 weekly by isokinetic dynamometry at joint angles of 30°, 60° and 90°(isometric 13 knee extension) and 60°/sec and 180°/sec (isokinetic maximal torque). Biopsy 14 samples were obtained from the vastus lateralis of the trained leg pre- and post-15 training, and they were analyzed using light microscopy and computer-based 16 planimetry to identify the cross-sectional area of each major fiber type as an 17 index of hypertrophy. A number of histochemical staining methods (H&E, SDH, 18 GPDH, IHC, mATPases) were used for delineation of the fiber types. Circulating 19 ACE activity was determined in blood samples and DNA samples were extracted 20 from saliva for genotyping. ACE genotype was not associated with circulating 21 ACE activity, with DD individuals presenting similar plasma ACE activity levels 22 with II individuals (39.7 ± 40 and 40.5 ± 3.30 respectively, P = 0.89 pre-training, 23 41.9 ± 3.7 and 35.5 ± 4.30 respectively, P = 0.30 post-training). ACE activity did 24 not change significantly with training (40.2 ± 2.5 nmol His-Leu/min/mL pre-25 training, 38.1 ± 3 nmol His-Leu/min/mL post training, P = 0.41) and correlated 26 significantly with baseline isometric force of the untrained leg at 5° (r = 0.46, P 27 = 0.05) and isokinetic strength at 180°/sec (r = 0.52, P = 0.03). When strength 28 was presented as force production per kilogram of body mass, the above 29 correlations became non-significant. Isometric force at 60º post-training 30 revealed a significant effect of the genotype, in favour of the DD individuals, on 31 the trained leg F (1, 64) = 4.242, P = 0.04, observed power = 0.53, partial eta 32 squared = 0.062). The effect persisted after adjustment for weight, but when it 33 was adjusted for body mass index and physical activity (assessed by 34 questionnaires), the effect became non-significant (F (1, 63) = 3.13391, P = 0.08, 35 5 partial eta squared = 0.047, observed power = 0.41); and F (1, 63) = 3.1628, P = 1 0.08, partial eta squared = 0.048, observed power = 0.42, respectively).The 2 average cross-sectional area (AVECSA) of Type IIA fibres for the DD individuals 3 increased significantly post-training (4070 ± 506 μm² pre-training, 4674 ± 399 4 μm² post-training, t (6) = -2.999, P = 0.02) and so did the AVECSA of the Type I 5 fibers of II individuals (3345 ± 207 μm² pre-training, 3988 ± 239 μm² post-6 training, t (10) = -3.063, P = 0.01). The finding shows that the strength training 7 programme applied resulted in muscle hypertrophy, but the changes in AVECSA 8 were not genotype-related. In conclusion, our findings suggest a possible role for 9 ACE gene polymorphism in the regulation of human skeletal muscle strength, but 10 limited statistical power and confounding factors prevented us from drawing 11 clear conclusions

Molecular mechanism of intracellular signal transduction by the angiotensin-converting enzyme

The angiotensin converting enzyme (ACE) is an important component of the renin-angiotensin system (RAS) and is crucially involved in the homeostasis of fluid and electrolyte balance and thus in the regulation of blood pressure. The zinc metallopeptidase is involved in the generation of angiotensin II, a potent vasoconstrictor and in the degradation of bradykinin, a potent vasodilator. It is worth noting that ACE more readily hydrolyzes bradykinin than it does angiotensin I thus culminating in the net physiological effect of the production of a vasoconstrictor and the decrease in the availability of a vasodilator. ACE inhibitors have become one of the most successful therapeutic approaches as a first line of therapy in hypertension, and are also widely used in treating heart failure, myocardial infarction, stroke, coronary artery disease and impaired left ventricular function. However, one unexpected clinically relevant finding related to ACE inhibitors is their ability to delay the onset of type II diabetes that was revealed by various large clinical trials. However, the mechanisms underlying these beneficial effects of ACE inhibitor therapy are currently unclear and cannot be explained by the prevention of angiotensin II formation or the attenuated degradation of bradykinin. Thus the potential beneficial effects attributed to ACE inhibitors may occur independent of reductions in blood pressure paving way for new and/or unknown mechanism. Our group has recently redefined ACE as a signal transduction molecule which upon binding to ACE inhibitor turns on a signalling cascade leading to phosphorylation of Ser1270 by CK2, activation of JNK and changes in gene expression in endothelial cells. However the mechanism by which ACE inhibitor initiates the signalling cascade was not clear. It was hypothesized that ACE, which is anchored to the membrane with a single transmembrane domain should dimerize prior to initiating further downstream signalling events in endothelial cells. Therefore, we sought to explore whether or not ACE forms dimers in endothelial cells and whether ACE dimerization is essential for the initiation of ACE signalling in endothelial cells. Using native gel electrophoresis, we found that ACE forms dimers in endothelial cells and that there is an increase in the dimer formation upon treatment of endothelial cells with ACE inhibitors. ACE homodimerization was also demonstrated using the split-ubiquitin system and chemical cross-linking experiments. ACE dimers are also formed in endothelial cells overexpressing the non-phosphorylatable ACE, wherein ACE signalling was abolished indicating that dimerization process is not influenced by the phosphorylation of the serine residue residing in the cytoplasmic tail. Monosaccharides like glucose, galactose and mannitol did not have any influence on ACE-inhibitor induced dimerization. Making use of different monoclonal antibodies directed to the epitopes of N-domain which harbours carbohydrate recognizing domain, also did not affect dimerization. However, inactivation of the C-domain active site by introducing mutation of the key histidine residues in HEMGH consensus sequences, which complexes the zinc ions, abolished enzyme dimerization both in the basal state and in response to ramiprilat. Mutation of the C-domain also resulted in the loss of ACE inhibitor-induced ACE signalling, that is we failed to observe ramiprilat-induced increase in the phosphorylation of the Ser1270 and the subsequent JNK activation. ACE-inhibitor induced dimerization precedes the phosphorylation of Ser1270 and activation of JNK. Thus the ACE-inhibitor induced dimerization via the C-domain of ACE represents the initial step in the ACE signalling pathway which involves the activation of JNK/c-Jun pathway and leading to the changes in the gene expression in endothelial cells. Our group previously identified ACE itself as well as cyclooxygenase-2 (COX-2) as two “ACE signalling-regulated” genes. To screen for additional genes regulated in a similar manner we used DNA microarray technology, to assess ramiprilat-induced changes in the endothelial cell gene expression. 21 genes were identified to be differentially regulated of which, 7 were upregulated and 14 were downregulated by ramiprilat. However, when screened at the protein level, we found no significant differences between the untreated control cells and those treated with ramiprilat. As several other cells and tissues possess a fully functional RAS we screened plasma samples from healthy volunteers as well as from patients with coronary artery disease for the proteins identified in the microarray. We observed that the cellular retinal binding protein-1 (CRBP-1) was detectable at low levels in plasma from patients and that ramipril markedly increased serum levels of this protein. Endothelial cells overexpressing CRBP-1 demonstrated increased RXRE and PPRE activity when stimulated with 9-cis retinoic acid and rosiglitazone respectively suggesting that CRBP-1 might affect gene expression via heterodimerization of PPAR elements with RXR elements by virtue of its function as a transport protein of retinoic acid. Studies aimed at determining the consequences of elevated CRBP-1 expression on endothelial cell homeostasis are ongoing. Although the RAS has been described in many other tissues apart from endothelial cells, ACE signalling has not yet been addressed in tissues such as monocytes/macrophages, which have an increased ACE expression in an atherosclerotic setting. We observed that upon stimulation of cultured ACE expressing monocytes with ramiprilat, JNK is activated suggesting the occurrence of ACE signalling in human monocytes. It is worth noting that ACE inhibitors delay the onset of type II diabetes in spite of moderate decrease in blood pressure. To further elucidate the mechanism underlying this effect, we found that ACE inhibitors increase the PPARgamma levels in the nuclear extracts of ACE expressing monocytes which were also reproduced in human endothelial cells overexpressing human somatic ACE. However, ramiprilat did not have any direct effect on the activity of a luciferase-coupled promoter containing several copies of the PPRE in human endothelial cells. These results contrasted with the actions of the PPARgamma agonist suggesting that ramiprilat enhances PPARgamma levels through an indirect mechanism. We next hypothesized that ramiprilat might increase the levels of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2) which is a natural ligand for PPARgamma via COX enzymes in monocytes. We observed that ramiprilat was able to decrease the diminution of COX-2 levels upto 48 hours of treatment but the levels of 15dPGJ2 were too low to be detected by ELISA. However ramiprilat enhanced the plasma levels of adiponectin, a downstream target of PPARgamma, which is a anti-atherogenic and anti-inflammatory adipokine, in patients with coronary artery disease. Though adiponectin is a PPARgamma-regulated gene, the observed increase in adiponectin might be attributed to the increase in RXR rather than via PPARgamma. Taken together, the results of this investigation have revealed that ACE inhibitors initiate ACE signalling by eliciting the dimerization of the enzyme, more specifically via its C-domain active centers. The ACE signalling cascade when activated leads to the enhanced expression of ACE, COX-2 and CRBP-1 which in turn favours the heterodimerization of PPARgamma with RXR and thus results in the increased expression of “PPARgamma regulated” genes such as adiponectin. The latter results provide a molecular basis for the observation that ACE inhibitors can delay the onset of type 2 diabetes in as much as it was possible to link ramipril with CRBP-1, RXR activity and the expression of adiponectin, an adipokine associated with improved insulin sensitivity. Further work is however required to elucidate the consequences of ACE inhibitors in monocytes and adipocytes as well as in intact animals.Das Angiotensin-konvertierende Enzym (ACE) ist eine zentrale Komponente des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) und ist insbesondere für die Regulation des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes sowie für die Kontrolle des Blutdrucks von großer Bedeutung. Das Enzym wandelt zum einen Angiotensin I in das stark vasokonstrikitorisch wirkende Hormon Angiotensin II um und hydrolysiert zum anderen das vasodilatorisch wirkende Hormon Bradykinin in inaktive Fragmente. Die Hemmung des RAS durch ACE-Inhibitoren ist zu einer wichtigen, erfolgreichen therapeutischen Maßnahme geworden, nicht nur zur Behandlung des Bluthochdrucks, sondern auch bei Myokardinfarkten, Diabetes mellitus Typ II, Schlaganfällen, koronarer Herzkrankheit (KHK) sowie bei Links-Herz-Insuffizienz. Interessanterweise lässt sich eine Reihe der positiven Effekte der ACE-Inhibitoren nicht allein durch Senkung des Angiotensin II-Spiegels bzw. Anstieg der Bradykinin-Konzentration erklären. Vielmehr scheint es noch andere Wege zu geben, mittels derer ACE-Inhibitoren ihre positiven Wirkungen entfalten. Im Hinblick darauf ist von besonderem Interesse, dass das Enzym ACE erst kürzlich als Signaltransduktionsmolekül identifiziert werden konnte. Die Bindung von ACE-Inhibitoren an ACE löst in Endothelzellen eine Signaltransduktionskaskade aus, bei der zunächst die ubiquitäte Proteinkinase CK2 ACE an einem intrazellulären Serin-Rest (Ser1270) phosphoryliert. Infolge dieser Phosphorylierung wird der c-Jun/JNK-Signalweg und der Transkriptionsfaktor AP-1 aktiviert, was zur Steigerung der Expression von ACE und Cyclooxygenase-2 (COX-2) führt. In Endothelzellen, die eine nicht-phosphorylierbare Mutante von ACE (S1270A) überexprimieren, findet das ACE-Signalling nicht statt. Da mittels der Technik inverser Micellen gezeigt werden konnte, dass ACE als Dimer vorliegen kann, sollte die physiologische Relevanz dieser Dimerisierung und deren Einfluß auf das ACE-Signalling in Endothelzellen untersucht werden. Mit Hilfe nativer Gelelektrophorese, sowie Experimenten mit dem Split-ubiquitin System oder chemischem „Cross-linking“ konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass ACE in Endothelzellen als Dimer vorliegt und die Dimerisierung durch Gabe von ACE-Inhibitoren gesteigert wird. Da die nicht-phosphorylierbare, inaktive ACE-Mutante auch dimerisieren kann, konnte ein Einfluss der ACE-Phosphorylierung auf die Dimerisierung ausgeschlossen werden. Obwohl eine Dimerisierung des Enzyms über eine N-terminale Zucker-Seitenkette postuliert worden war, konnte im Rahmen dieser Arbeit die ACE-Inhibitor-induzierte Dimerisierung weder durch die Gabe von Monosacchariden wie Glukose, Galactose und Mannitol unterdrückt werden, noch durch die Inkubation der Endothelzellen mit verschiedenen N-terminalen, monoklonalen ACE-Antikörpern. Die basale und ACE-Inhibitor-induzierte Dimerisierung von ACE konnte jedoch durch die Inaktivierung des C-terminalen, aktiven Zentrums von ACE durch Mutation der Histidinreste in der HEMGH-Konsensussequenz verhindert werden. Dies führte zur völligen Aufhebung des ACE-Signaltransduktion weges, d.h. weder die Ramiprilat-vermittelte Phosphorylierung an Ser1270 noch die JNK-Aktivierung erfolgte. Somit konnte die durch ACE-Inhibitoren induzierte Dimerisierung über die carboxyterminale Domäne des Enzyms als Initiationspunkt der ACE-Signaltransduktion bestätigt werden. Mittels DNA-Microarray Technologie wurde ferner der Einfluss der ACE-Dimerisierung und der dadurch initiierten Signaltransduktion auf die Expression weiterer Gene untersucht, wobei 21 durch Ramiprilat regulierte Gene identifiziert wurden. Sieben Gene wurden in ihrer Expression gesteigert, 14 abgeschwächt. Zahlreiche weitere Experimente zeigten jedoch, dass Ramiprilat keinen Einfluss auf die Menge der durch diese Gene kodierten Proteine in Endothelzellen hatte. Da eine Reihe anderer Zellen und Gewebe ein funktionelles RAS exprimieren, untersuchten wir auch das Blutplasma von gesunden Probanden und Patienten mit KHK. Interessanterweise fand sich im Plasma von Patienten unter Ramipril-Therapie eine erhöhte Konzentration des „Cellular retinol binding protein-1“ (CRBP-1), welches auch mittels Microarray als durch Ramiprilat-hochreguliertes Gen ermittelt worden war. In Endothelzellen führte eine Überexpression von CRBP-1 zu einem Anstieg der Promotoraktivität von RXRE und PPRE nach Stimulation durch 9-cis Retinolsäure und Rosiglitazon, was möglicherweise auf das erhöhte, zelluläre Angebot von Retinol-Produkten und einer daraus resultierenden vermehrten Dimerisierung von PPAR und RXR zurückzuführen ist. Obwohl das RAS nicht nur in Endothelzellen, sondern auch in anderen Geweben eine Rolle spielt, konnte das ACE-Signalling bislang noch nicht in anderen Geweben nachgewiesen werden. Insbesondere die Untersuchung des ACE-Signallings in Monozyten bzw. Makrophagen könnte von besonderem medizinischem Interesse sein, da in diesen Zelltypen die ACE-Expression im Rahmen der Entwicklung einer Atherosklerose deutlich ansteigt. Es scheint jedoch ein ACE-Signalling in Monozyten zu existieren, da Ramiprilat in diesen Zellen eine Aktivierung der JNK sowie eine Erhöhung der COX-2 Expression auslöst. Eine weiterer positiver Aspekt einer ACE-Inhibitor-Therapie ist, dass diese Medikamente die Ausbildung eines Diabetes mellitus Typ II verzögern. Experimente zur Ermittlung des zugrundeliegenden Mechanismus zeigten, dass die Behandlung von ACE-exprimierenden Monozyten oder Endothelzellen mit ACE-Inhibitoren zu einem erhöhten PPARgamma-Level in den Kernextrakten dieser Zellen führte. Allerdings scheint Ramiprilat die PPARgamma-Expression nur indirekt zu beeinflussen, denn die PPRE-Promotoraktivität wurde durch die Behandlung von Endothelzellen mit Ramiprilat, im Gegensatz zu der Inkubation mit dem PPARgamma-Agonisten Rosiglitazon, nicht beeinflusst. Eine Wechselwirkung zwischen ACE und PPARgamma scheint in der Tat naheliegend, da Patienten mit KHK infolge einer Ramipril-Behandlung eine erhöhte Plasmakonzentration von Adiponectin aufweisen, das in seiner Expression durch PPARgamma gesteigert wird und als Adipokin anti-inflammatorische und anti-atherogene Eigenschaften aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das ACE-Inhibitor-vermittelte ACE-Signalling durch eine Dimerisierung des ACE initiiert wird und zum Anstieg der Expression von ACE, COX-2 und CRBP-1 führt. Die gesteigerte CRBP-1-Bildung erhöht vermutlich die Bildung von PPAR/RXR-Heterodimeren, was in der vermehrten Expression von PPAR-regulierten Genen (z.B. Adiponectin) resultiert

Regulation of epithelial sodium channels in vasopressin neurons in the hypothalamus

Salt-sensitive individuals have blood pressure that is unusually sensitive to salt intake. Because salt-sensitivity is a common disorder and may cause high blood pressure, it is a significant public health concern. All three epithelial Na+ channel (ENaC) subunits (a, b, and g) and the mineralocorticoid receptor (MR), a known regulator of ENaC, are expressed by vasopressin (VP) synthesizing magnocellular neurons in the hypothalamic supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei. A growing body of evidence indicates that epithelial Na+ channels (ENaCs) in the hypothalamus play a significant role in the development of salt-sensitivity. My dissertation research tests the hypothesis that abnormal ENaC regulation occurs in VP neurons during salt-sensitive hypertension. To investigate this, I first used acute hypothalamic slices in an in vitro model to elucidate the ENaC regulatory mechanism present in the VP neurons of normotensive rats. Findings from this study demonstrated that aldosterone binds to the MR to directly interact with the promoter region of the γENaC gene to increase protein abundance in VP neurons, but aldosterone alone does not alter the ENaC-mediated current in VP neurons. To examine ENaC regulation during salt-sensitivity, Dahl salt-sensitive (Dahl-SS) and normotensive Sprague- Dawley (SD) rats were fed high salt diet to determine if any abnormal responses in the expression of ENaC subunits and MR occurred in the hypothalamus and kidney in response to a high dietary salt intake. Dietary salt intake caused a significant hypothalamic upregulation of gENaC in salt-sensitive animals and promoted proteolytic cleavage of the gENaC subunit. In contrast, the same dietary regimen caused significant downregulation of hypothalamic MR and kidney aENaC expression in normotensive animals. These results indicate a possible compensatory mechanism for salt-sensitive hypertension development present at the level of the hypothalamus of normotensive animals, which is not observed in salt-sensitive animals. Taken together, findings from my research suggest that high salt diet initiates a central pathway involving aldosterone-MR-ENaC in salt-sensitive animals to affect VP neuronal activity and contribute to hypertension development

Studies on the angiotensin converting enzyme gene polymorphism and Ace inhibitors

Angiotensin converting enzyme (ACE) converts angiotensin I to angiotensin II, an important step in the control of blood pressure. The gene encoding for ACE is subject to an insertion/deletion (I/D) polymorphism which is associated with different levels of the enzyme in serum. This polymorphism accounts for 47% of the variability in serum ACE concentrations between subjects but its relevance to tissue ACE is unknown. ACE inhibition increases kinin level, for example bradykinin. Kinins have been proposed be involved in the pathogenesis of cough due to ACE inhibitors, a common adverse effect in those prescribed these drugs. A genetic link was proposed to explain the differing susceptibility of subjects to develop cough. Those susceptible may differ in the cough reflexes initially or perhaps have different degrees of tissue ACE activity. In this thesis I examined healthy subjects using substrates and inhibitors of ACE to identify any possible differences in tissue ACE between those of different ACE genotype. I also examined the natural history of ACE inhibitor cough in particular changes in cough reflex and the possible roles of kinins in its aetiology. The frequency of ACE genotype amongst those who developed cough was also examined