Optimización de la producción aerobia de ácido succínico y ácido málico a partir de glicerol utilizando cepas de e. Coli modificadas genéticamente

Los ácidos dicarboxílicos C4 como el ácido succínico y el ácido málico son productos con alto potencial industrial al ser precursores de diferentes químicos de interés en la industria farmacéutica, alimentaria y agrícola. Estos compuestos pueden ser producidos a través de procesos de fermentación microbiana por bacterias como Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens y Anaerobiospirillum succiniciproducens para el caso del ácido succínico y por hongos como Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium oxalicum y la levadura Zygosaccharomyces rouxii para el caso del ácido málico. Sin embargo, con el advenimiento de las tecnologías del ADN recombinante y a través de la ingeniería metabólica es posible direccionar la producción de este metabolito modificando genéticamente la bacteria Escherichia coli, ya que, a diferencia de los productores naturales, esta bacteria es muy versátil metabólicamente, posee bajos requerimientos nutricionales y es de rápido crecimiento. Por otro lado, se ha estudiado el uso de diferentes sustratos para la producción de ácido succínico y ácido málico; no obstante, en miras de aprovechar los residuos industriales y con el propósito de promover una producción sostenible, se está utilizando el glicerol, un subproducto de la industria del biodiesel del cual hay una alta oferta. Este compuesto posee un alto grado de reducción de los átomos de carbono lo que permite la producción de productos químicos reducidos con mayores rendimientos que con el uso de carbohidratos. Sin embargo, a pesar de los altos rendimientos de ácido succínico y ácido málico obtenidos en condiciones anaerobias, el proceso se dificulta y retarda debido a inconvenientes en el mantenimiento del equilibrio de óxido-reducción, así como también por el bajo crecimiento en estas condiciones y la baja velocidad de consumo del sustrato. Por ello, se están desarrollando diversas estrategias para mejorar la producción en condiciones de aerobiosis haciendo uso de la ingeniería metabólica, lo cual ha permitido modificar el metabolismo del E. coli a través de la sobreexpresión y/o mutación de genes y así direccionarlo hacia la síntesis de estos compuestos; sin embargo, aún los rendimientos continúan siendo bajos. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la producción de ácido succínico y ácido málico a partir de glicerol en condiciones de aerobiosis utilizando una cepa de E. coli modificada genéticamente. Para ello, en primera medida, se analizaron las rutas metabólicas implicadas en el metabolismo de estos compuestos utilizando la base de datos EcoCyc lo que permitió identificar fugas de carbono, definir estrategias de ingeniería metabólica e identificar las enzimas clave implicadas en estas estrategias, estas últimas fueron caracterizadas con el propósito de obtener información que pueda ser relevante para la optimización de la producción de estos compuestos. Posteriormente, se realizó la modificación genética de E. coli, construyéndose un mutante base con la mutación del gen de la subunidad A de la enzima succinato deshidrogenasa (sdhA), con el propósito de linealizar el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y con las mutaciones de los genes de las enzimas de las vías de síntesis de ácido acético como la acetato quinasa y la fosfato acetiltransferasa (ack-pta) y la piruvato oxidasa (pox) para evitar pérdidas de carbono. A partir de este mutante se desarrollaron dos estrategias en paralelo que fueron la mutación del gen del represor de la vía del glioxilato (iclR) y la mutación del gen de la enzima 6 fosfogluconato deshidrogenasa (gnd) que participa en la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato, ya que trabajos anteriores han demostrado que por sí sola esta mutación aumenta las cantidades de ácido succínico, pero en condiciones de anaerobiosis. Es así como se construyeron tres mutantes: M4: (ΔsdhAΔack-ptaΔpox), M4-ΔiclR (ΔsdhAΔack-ptaΔpoxΔiclR) y M4-Δgnd (ΔsdhAΔack-ptaΔpoxΔgnd) los cuales fueron analizados con dos herramientas de metabolómica: la espectroscopia de análisis de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR) y cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS). Adicionalmente, se analizó la sobrexpresión de las enzimas anapleróticas y la malato deshidrogenasa bajo el promotor inducible pBAD, utilizando inicialmente una baja inducción (L-arabinosa 0,0002 %), como ensayo preliminar y posteriormente, una alta concentración (L-arabinosa 0,02 %) y a partir de este screening se seleccionaron dos cepas, una productora de ácido málico y la otra productora de ácido succínico. En cada una de estas cepas se realizó un diseño experimental Plackett-Burman para determinar qué componentes del medio M9 afectan a la producción de ambos metabolitos. Posteriormente, se procedió a estudiar el efecto de los factores más influyentes en ambos mutantes a partir del cual se optimizó el medio M9 para la producción de ácido málico, pero a raíz de que, con la evaluación de estos factores, las cantidades de ácido succínico aun no mejoraron, se realizó un diseño experimental para la optimización del medio de cultivo M9 para la mejorara de la producción de este compuesto. El medio optimizado fue entonces evaluado en cepas con la mutación de genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos y el mutante M4-Δgnd con la sobrexpresión de la Ppc. Los resultados obtenidos en el presente trabajo mostraron inicialmente que las vías asociadas directamente a la producción de ácido málico y ácido succínico fueron el TCA, la glicolisis y la vía del glioxilato; siendo los metabolitos más importantes: el piruvato, el acetil-CoA, la D-glucopiranosa 6-fosfato y el D-gliceraldehido 3-fosfato, por ser puntos de fuga de carbono a través de vías alternas como la vía de síntesis de ácido acético, la vía de síntesis de ácidos grasos y la vía de las pentosas fosfato. Se seleccionaron y caracterizaron inicialmente 57 enzimas dentro de estas rutas incluyendo además las de la asimilación del glicerol y a partir de estas, se eligieron 14 enzimas asociadas a las estrategias para la mejora de la síntesis de ambos compuestos, cuya característica más importante reside en un amplio rango de pH. La linealización del TCA con la mutación del gen sdhA mostró una acumulación de ácido succínico, mayor que con la mutación del operón completo sdhCDAB y las subsiguientes mutaciones de las vías de síntesis ácido acético permitió la reducción de la producción de ácido acético con el consecuente aumento de la producción de ácido succínico en alrededor de un 80 %. Las mutaciones de los genes del represor transcripcional de unión al ADN de la vía del glioxilato (iclR) y gnd favorecieron el aumento de la producción de ácido succínico en el mutante M4, el análisis metabolómico mostró una disminución de la mayoría de los metabolitos de la glicolisis con estas dos mutaciones y, asimismo, se evidencia con la mutación de iclR una acumulación de los metabolitos manitol, trehalosa y Fructosa 1,6-bifosfato (FBF) y con la mutación de gnd una regulación negativa del metabolismo del nitrógeno. A continuación, se realizó sobre este mutante un screening de sobreexpresión con las enzimas anapleróticas fosfoenolpiruvato carboxilasa (Ppc), fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck) y las enzimas málicas (MaeA y MaeB), además de la malato deshidrogenasa (Mdh). Con el ensayo preliminar a baja concentración de L-arabinosa, solo se observó un ligero aumento en la producción de ácido succínico y de ácido málico al sobreexpresar la Mdh. Sin embargo, cuando se utilizó una alta concentración de inductor, la sobreexpresión de la Ppc dio lugar a un aumento considerable de ácido succínico en la cepa M4, mientras que la sobreexpresión de la Pck provocó un considerable aumento en la producción de ácido málico tanto en el mutante M4 como en el M4-ΔiclR, siendo un poco mayor en el caso de esta última cepa. Del estudio mediante diseño experimental Plackett-Burman, se concluyó que el principal factor que afecta a la producción de ambos compuestos fue la concentración del inductor de la expresión (L-arabinosa) y, adicionalmente, para el caso del mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck fueron influyentes la concentración de carbonato de sodio, bajo la forma en el medio de cultivo de hidrogeno carbonato de sodio y la de glicerol; mientras que para el mutante M4/pBAD-ppc fueron además del glicerol, la concentración de NH4Cl, MgSO4 y la cantidad de los elementos traza. Pruebas adicionales determinaron que para la producción de ácido málico en el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck la concentración de carbonato ideal fue de 4 g/L, lo que permitió un consumo completo de una concentración inicial de 10 g/L de glicerol. Sin embargo, en ambos mutantes a partir de 10 g/L de glicerol este no alcanza a consumirse. Por ello, el análisis de ajuste a modelos de crecimiento microbiano mostró en estos mutantes un mejor ajuste al modelo logístico que al modelo de Monod. Por otro lado, el NH4Cl fue limitante en concentraciones de hasta 0,5 g/L y fue inhibitorio a una concentración de 3,5 g/L en el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck. El medio optimizado fue con una concentración de 0,87 g/L de NH4Cl, 2 mL de MgSO4 1 M y 61 µL (2,3 g/L FeCl3·6H2O, 0,039 g/L CuSO4·5H2O, 0,049 g/L ZnSO4·7H2O, 0,32 g/L MnCl2-7H2O, 0,129 g/L CoCl2·6H2O, 0,037 g/L (NH3)6Mo7O24·4H2O and 0,25 g/L H3BO3) de elementos trazas. El uso de este medio con los mutantes de la síntesis de ácidos grasos permitió un ligero aumento del rendimiento del ácido succínico con la mutación del gen FabF y un aumento de la producción de ácido málico con la mutación del gen FadR. En resumen, la producción volumétrica de ácido málico alcanzada con las condiciones optimizadas de 4 g/L de carbonato y 10 g/L de glicerol fue de 5,1 g/L con el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck y, por su parte, con el medio optimizado para la producción de ácido succínico se obtuvieron 3,51 y 4,40 g/L de ácido succínico con los mutantes M4/pBAD-ppc y M4-Δgnd/pBAD-ppc, respectivamente. Estos hallazgos reflejan que el direccionamiento del metabolismo de la bacteria E. coli mediante herramientas de ingeniería genética, sumado a la optimización de las condiciones de cultivo permitieron el mejoramiento de la producción volumétrica de ambos metabolitos a partir del uso de glicerol en condiciones de aerobiosis, aun cuando se hace necesario mejorar la velocidad de producción, especialmente la de ácido succínico; para ello, deberían ser implementadas otras herramientas centradas en el mejoramiento del consumo de sustrato y la exportación de estos compuestos C4

Identification of Enzymatic Bottlenecks for the Aerobic Production of Malate from Glycerol by the Systematic Gene Overexpression of Anaplerotic Enzymes in Escherichia coli

The biotechnological production of dicarboxylic acids (C4) from renewable carbon sources represents an attractive approach for the provision of these valuable compounds by green chemistry means. Glycerol has become a waste product of the biodiesel industry that serves as a highly reduced carbon source for some microorganisms. Escherichia coli is capable of consuming glycerol to produce succinate under anaerobic fermentation, but with the deletion of some tricarboxylic acid (TCA) cycle genes, it is also able to produce succinate and malate in aerobiosis. In this study, we investigate possible rate-limiting enzymes by overexpressing the C-feeding anaplerotic enzymes Ppc, MaeA, MaeB, and Pck in a mutant that lacks the succinate dehydrogenase (Sdh) enzyme. The overexpression of the TCA enzyme Mdh and the activation of the glyoxylate shunt was also examined. Using this unbiased approach, we found that phosphoenol pyruvate carboxylase (Ppc) overexpression enhances an oxidative pathway that leads to increasing succinate, while phosphoenol pyruvate carboxykinase (Pck) favors a more efficient reductive branch that produces mainly malate, at 57.5% of the theoretical maximum molar yield. The optimization of the culture medium revealed the importance of bicarbonate and pH in the production of malate. An additional mutation of the ppc gene highlights its central role in growth and C4 production

High-Pressure fractionation of tropical fruits with potential antibacterial activity: M. indica L. and B. Guineensis

The great interest in the potential health benefits of tropical fruits is due to their high content of antioxidants and phytochemicals. Colombia ranks as the second country with the major biodiversity worldwide. B. guineensis (Arecaceae) is a palm that grows in Colombia and Central America. The purple-black fruits of this plant are rich in thermal-stable anthocyanins. M. indica L. (Anacardiaceae) is a great source of phenolic compounds. It has multiple functional properties including antioxidant, antimicrobial, antidiabetic and anticarcinogenic activities. In this work, high-pressure extraction techniques: supercritical fluid extraction (SFE) and enhanced solvent extraction (ESE), and two different fractionation techniques: i) cascade fractionation and ii) sequential fractionation were applied. Fractions were analyzed by means of their phenolic content, antioxidant activity, and antibacterial activity against different bacterial strains: E. coli, P. mirabilis, S. Aurerus, S. enteritidis, E. aerogenes and P. aeruginosa. The sequential fractionation of B. guineensis pulp consisted in three steps: 1) supercritical CO2, 2) CO2 + 50% ethanol, and 3) CO2/EtOH/H2O (50:25:25). A red fraction rich in phenolic compounds, high antioxidant and antibacterial capacity (inhibition zone ~ 10 mm) was obtained in the last step. A cascade fractionation of M. indica leaves using CO2 + 50% H2O and three separators (S1, S2 and S3) was evaluated. Fractions obtained in S1 and S2 presented antioxidant capacity and antibacterial activity against P. mirabilis, and S2 also against S. Aureus and Salmonella

Preliminary Microbiological Coastal Water Quality Determination along the Department of Atlantico (Colombia): Relationships with Beach Characteristics

Beach water quality is an important factor concerning public health and tourism linked to the "Sun, Sea and Sand" market and is usually assessed in international regulations by the quantification of Escherichia coli and enterococci counts. Despite Salmonella spp. detection not being included in international normative, the presence/absence of this bacteria is also an indicator of seawater quality. The objective of this study was to determine microbiological quality of beach water at 14 beaches along the Department of Atlantico (Colombia) and its relationship with beach characteristics as beach typology (i.e., urban, village, rural and remote areas), presence of beach facilities (e.g., bars, restaurants, etc.) and streams outflowing into the coastline. Sampling program aimed to analyse E. coli and Salmonella spp., by culture-based and real time PCR methods, respectively. Microbiological outcomes were compared with beach characteristics, and a cluster analysis was performed. E. coli and Salmonella spp. were detected in 70% and 20% of samples, respectively. Highest E. coli counts were observed at beaches classified as urban and at Sabanilla, a rural beach with presence of numerous beach restaurants/bars. Salmonella spp. presence was associated with streams that lack wastewater treatment systems. Cluster analysis clearly evidenced the relationship between E. coli and Salmonella spp. and beach characteristics, allowing to obtain indications to implement management programs. According to data obtained, monitoring programs have to be especially carried out in urban areas and at places with beach facilities. This could enhance microbiological water quality and consequently, beachgoers safety and touristic beach attractiveness to international visitors

Molecular detection of Salmonella spp., Listeria spp. and Brucella spp. in fresh artisanal cheese marketed in the city of Barranquilla: A pilot study

Introduction: Each year approximately 3 million people die as the result of foodborne diseases. The fresh artisan (handmade) cheese produced and distributed in the Colombian Caribbean region is a native product from the departments of Córdoba, Sucre, Bolívar, Atlántico, Magdalena, Cesar, and La Guajira. Its mass consumption increases the risk of infection with Salmonella spp., Listeria spp., and Brucella spp., as it is made with a very rustic technology, with unpasteurized cow milk, without standardized and hygienic procedures and its storage is inadequate. Objective: To detect the presence of Salmonella spp., Listeria spp., and Brucella spp. in samples of fresh artisan cheese from the Colombian Caribbean region. Materials and methods: Twenty-seven samples of cheese from five departments of the Caribbean Region (Atlántico (n=6), Bolívar (n=2), Córdoba (n=1), Magdalena (n=16), and Sucre (n=2)) were analyzed by real-time polymerase chain reaction (qPCR). Seventeen of the samples corresponded to soft cheese, five to semi-hard cheese and five to hard cheese. Results: In 62.9% (17/27) of the samples we detected Salmonella spp., in 70.4% (19/27), Listeria spp., and in 22.2% (6/27), Brucella spp., mainly from the department of Magdalena. In 62.5% (10/16) of the samples we detected Salmonella spp. and Listeria spp. while in the department of Atlántico, 50% (3/6) of the samples corresponded to Brucella spp. Conclusion: The results confirmed the presence of these microorganisms in all the samples of soft cheese from the Colombian Caribbean region

Microbiological water quality and sources of contamination along the coast of the Department of Atlántico (Caribbean Sea of Colombia). Preliminary results

Microbiological sea water quality is a public health problem that has serious repercussions in the tourism and economy of Colombia. This study determines the concentrations of Escherichia coli, Enterococcus faecalis and Clostridium perfringens at eleven beach water points and seven streams along the coast of the Department of Atlántico, Colombia. In seawater, total E. coli, E. faecalis and C. perfringens concentrations were found between 16 and 572 cfu/100 mL, 7–450 cfu/100 ml and 2–125 cfu/100 ml, respectively. The highest counts were observed mainly on urbanised beaches and in correspondence with streams whose waters had a high concentration of faecal origin microorganisms, which represent a serious health risk factor for bathers. Relevant efforts have to be addressed to improve the microbiological quality of these beaches by the establishment of efficient wastewater management programs aimed at enhancing the efficiency of the local treatment plant and the control of illegal sewage pouring onto the coast

A Preliminary Approximation to Microbiological Beach Sand Quality along the Coast of the Department of Atlántico (Caribbean Sea of Colombia): Influence of the Magdalena River

Beaches represent important economic resources linked to “Sun, Sea and Sand” tourism and, therefore, their water quality constitutes an issue of great relevance especially in developing countries. The main objective of this work was to determine the microbial quality of beach sediments along the Caribbean coast of the Department of Atlántico (Colombia) and its relationships with the existence of local sources of contamination (e.g., streams containing wastewaters), beach exposition to waves, the quantity of beach visitors—which is reflected by beach typology (e.g., urban, rural, etc.), the presence of tourist activities/infrastructures and the beach sand sedimentological characteristics. Along the study area, samples of beach sediments were gathered in beach face and backshore areas at 11 sectors and the microbiological counts of three faecal indicator bacteria, i.e., Escherichia coli, Enterococcus spp. and Clostridium perfringens, were determined. A homogeneous distribution was recorded along the coast of Escherichia coli and Clostridium perfringens in both beach face and backshore sediments, in the order of 5 and 2 log CFU/100 mL, respectively; Enterococcus spp. was, at places, not observed in backshore sediments. No relationships existed between, on one side, the counts of the faecal indicator bacteria considered and, on the other side, the presence of streams and tourist activities/infrastructures, beach typology, exposition to waves and the sedimentological characteristics of beach sands. Such results suggest a chronic contamination of beach face and backshore sediments linked to the heavily polluted sedimentological load of the Magdalena River