Aspectos metabólicos y multivitamínicos del maíz

La deficiencia de vitamina A causa 2.2 millones de muertes al año. Por tanto, investigadores intentan elevar el contenido de β-caroteno y otros carotenoides en cereales mediante la ingeniería genética. Mi trabajo consistió en analizar carotenoides en maíz y callos de arroz transgénico con el fin de indentificar y cuantificar estos pigmentos y además analizar la ruta metabólica de los mismos. Por tal motivo, desarrollaré una técnica analítica por HPLC y UHPLC que me permitió separar la mezcla de carotenoides. Estas moléculas se detectaton utilizando un detector de arreglo de diodos y masas. Con éste último se probaron distintas técnicas de ionización (ESI, APCI y APPI) para encontrar la mejor técnica que ionizara carotenos y xantófilas. Además se hallaron transiciones para identificar a cada uno de los carotenoides. Para mostrar la confiabilidad del método analítico, realicé la validación del mismo y determiné factores importantes que influyen en el análisis de carotenoides, como por ejemplo, su estabilidad química. Para analizar la ruta metabólica de los carotenoides, se realizaron distintos experimentos, entre ellos, introducir distintas combinaciones de genes en el maíz y arroz que permitieran entender cuáles eran las enzimas importantes que permitían la acumulación de carotenoides. También se analizó la biosíntesis de carotenoides a distintas etapas del desarrollo de la semilla de maíz, desde los 15 días después de la polinización (DAP) hasta los 60 DAP y su estabilidad química a lo largo de todo este período. Finalmente, se profundizó en la identificación de nuevos carotenoides encontrados en las muestras, como los oxo-carotenoides (utilizados en la industria como colorantes). Para llevar acabo su identificación, se realizaron pruebas químicas, se determinaron sus espectros visibles y sus fragmentos por masas.   Vitamin A deficiency casuses 2.2 million deaths per year. Therefore, many researches have attempted to elavate β-carotene levels in staple cereals by introducing the corresponding metabolic pathway. I was involved in the analysis of carotenoids in maize and rice. I improved and developed analytical tecniques by HPLC y UHPLC in order to separate these pigments. Its identification was carried out by using PDA and mass detectors. In addition, different ionization tecniques were compared in order to choose the most suitable tecnique to ionize these molecules. Parameters influencing carotenoid analysis (such as carotenoid stability) were determined and the analytical method was validated. Likewise, the extraction method of carotenoids was optimized.Three diffetent experiments were carried out in order to analize the metabolic pathway of carotenoids. The first one consited in introducing different carotenogenic genes into a white maize variety deficient for endosperm carotenoid synthesis. The second one consisted in analyzing the biosynthesis of carotenoids at different developmental stages of the maize seed (from 15 DAP to 60 DAP). The third one corresponded to the metabolic engineering of ketocarotenoids biosynthesis in maize seed and rice callus. These experiments allowed us to identify and complement rate-limiting steps in the pathway and analyze carotenoid stability. On top of that, the different transgenic plants obtained had extraordinary levels of β-carotene and other carotenoids, including complex mixtures of hydroxycarotenoids and ketocarotenoids. Finally, I also deepened in the identification of carotenoids since new pigments were synthesized in the transgenic plants. Thereby, I did chemical reactions and determined mass spectra of the new carotenoids

Targeted carotenoid metabolite profiling in transgenic cereals and correlations with carotenoid gene expression

El meu treball de recerca va consistir en la millora, desenvolupament i aplicació de tècniques analítiques per a l'anàlisi qualitatiu i quantitatiu de carotenoides en cereals, principalment en blat de moro i arròs. Inicialment vaig treballar en l'optimització del mètode d'extracció d'aquests pigments. Es compararen diferents combinacions de solvents per determinar el millor solvent extractant que permetés alliberar tots els carotenoides de la llavor de blat de moro, malgrat les seves diferents polaritats. Addicionalment, vaig millorar i desenvolupar dos mètodes cromatogràfics per HPLC i UHPLC per realitzar la separació d'aquests pigments. Es compararen diverses fases estacionàries i mòbils amb la finalitat de trobar el millor sistema que permetés la separació de la majoria d'aquests compostos. La identificació dels analits es va realitzar mitjançant l'ús detectors de fotodíodes en sèrie i de masses. Es compararen tècniques d'ionització com ara ESI, APCI i APPI per ionitzar aquests pigments.Mi trabajo de investigación consistió en la mejora, desarrollo y aplicación de técnicas analíticas para el análisis cualitativo y cuantitativo de carotenoides en cereales, principalmente en maíz y arroz. Inicialmente trabajé en la optimización del método de extracción de estos pigmentos. Diferentes combinaciones de solventes fueron comparadas para determinar el mejor solvente de extracción, que permitiera liberar de la semilla de maíz, todos los carotenoides a pesar de sus distintas polaridades. Adicionalmente, mejoré y desarrollé dos métodos cromatográficos por HPLC y UHPLC para conseguir realizar la separación de estos pigmentos. Varias fases estacionarias y móviles fueron comparadas con el fin de encontrar el mejor sistema que permitirá la separación de la mayoría de estos compuestos. La identificación de los analitos se realizó mediante el uso detectores de fotodiodos en serie y de masas. Técnicas de ionización tales como ESI, APCI y APPI fueron comparadas para ionizar los pigmentos.My research program focused on the development and optimization of qualitative and quantitative analytical methodology for carotenoid determination in cereal crops. Initially, I improved the protocol to extract carotenoids from maize and rice tissues. I compared different combinations of solvents in order to identify the most suitable mixture that allowed me to extract, in spite of its different polarities, all the carotenoids present in the samples. I also improved and developed two chromatographic methods by high performance liquid chromatography (HPLC) and ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) to separate these pigments. Various stationary and mobile phases were evaluated in order to obtain the most optimal resolution among the different pigments found in the samples. The identification of these molecules was carried out using photo diode array (PDA) and mass (MS) detectors. I investigated the effect of ionizing carotenoids using electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and atmospheric pressure photoionization (APPI) techniques

Estudio fitoquímico preliminar de la especie Solanum Stellatiglandulasum bitter y evaluación preliminar de la actividad biológica frente a Artemia salina leach

Desde la constitución de la sociedad humana hace diez mil millones de años, el ser humano utiliza especies vegetales como medio nutricional y medicinal, siendo los vegetales terrestres o acuáticos elementos básicos en las cadenas tróficas de la vida. El ochenta por ciento (80%) de la humanidad depende de remedios caseros y herbarios que han sido base farmacoquímica de medicamentos universales, y de otros tratamientos tradicionales como la acupuntura y la homeopatía para curar sus dolencias y patologías.1PregradoQuímicoArmenia Quindí

Influence of sample processing on the analysis of carotenoids in maize

We performed a number of tests with the aim to develop an effective extraction method for the analysis of carotenoid content in maize seed. Mixtures of methanol–ethyl acetate (6:4, v/v) and methanol–tetrahydrofuran (1:1, v/v) were the most effective solvent systems for carotenoid extraction from maize endosperm under the conditions assayed. In addition, we also addressed sample preparation prior to the analysis of carotenoids by liquid chromatography (LC). The LC response of extracted carotenoids and standards in several solvents was evaluated and results were related to the degree of solubility of these pigments. Three key factors were found to be important when selecting a suitable injection solvent: compatibility between the mobile phase and injection solvent, carotenoid polarity and content in the matrix

Analytical tools for the analysis of carotenoids in diverse materials

High-performance liquid chromatography (HPLC) has become the method of choice for carotenoid analysis. Although a number of normal-phase columns have been reported, reverse-phase columns are the most widely used stationary phases for the analysis of these molecules. C18 and C30 stationary phases have provided good resolution for the separation of geometrical isomers and carotenoids with similar polarity. More recently ultra high-performance liquid chromatography (UHPLC) has been used. UHPLC has a number of distinct advantages over conventional HPLC. These include: faster analyses (due to shorter retention times), narrower peaks (giving increased signal-to-noise ratio) and higher sensitivity. High strength silica (HSS) T3 and C18 and ethylene bridged hybrid (BEH) C18 stationary phases, with sub-2 μm particles have been used successfully for UHPLC analysis and separation of carotenoids. A number of spectroscopic and mass spectrometric techniques have also been used for carotenoid qualitative and quantitative analysis. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI/TOF-MS), atmospheric-pressure solids-analysis probe (ASAP) and Raman spectroscopy are used to profile rapidly and qualitative carotenoids present in different crude extracts. Such detection methods can be used directly for the analysis of samples without the need for sample preparation or chromatographic separation. Consequently, they allow for a fast screen for the detection of multiple analytes. Quantitative carotenoid analysis can be carried out using absorbance or mass detectors. Liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) is efficient for carotenoid identification through the use of transitions for the detection of analytes through precursor and daughter ions. This approach is suitable for the identification of carotenoids with the same molecular mass but different fragmentation patterns. Here we review critically the latest improvements for carotenoid resolution and detection and we discuss a number of analytical techniques for qualitative and quantitative analysis of carotenoids