Norvaline is accumulated after a down-shift of oxygen in Escherichia coli W3110

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Norvaline is an unusual non-proteinogenic branched-chain amino acid which has been of interest especially during the early enzymological studies on regulatory mutants of the branched-chain amino acid pathway in <it>Serratia marcescens</it>. Only recently norvaline and other modified amino acids of the branched-chain amino acid synthesis pathway got attention again when they were found to be incorporated in minor amounts in heterologous proteins with a high leucine or methionine content. Earlier experiments have convincingly shown that norvaline and norleucine are formed from pyruvate being an alternative substrate of α-isopropylmalate synthase, however so far norvaline accumulation was not shown to occur in non-recombinant strains of <it>E. coli</it>.</p> <p>Results</p> <p>Here we show that oxygen limitation causes norvaline accumulation in <it>E. coli </it>K-12 W3110 during grow in glucose-based mineral salt medium. Norvaline accumulates immediately after a shift to oxygen limitation at high glucose concentration. On the contrary free norvaline is not accumulated in <it>E. coli </it>W3110 in aerobic cultures. The analysis of medium components, supported by transcriptomic studies proposes a purely metabolic overflow mechanism from pyruvate into the branched chain amino acid synthesis pathway, which is further supported by the significant accumulation of pyruvate after the oxygen downshift. The results indicate overflow metabolism from pyruvate as necessary and sufficient, but deregulation of the branched chain amino acid pathway may be an additional modulating parameter.</p> <p>Conclusion</p> <p>Norvaline synthesis has been so far mainly related to an imbalance of the synthesis of the branched chain amino acids under conditions were pyruvate level is high. Here we show that simply a downshift of oxygen is sufficient to cause norvaline accumulation at a high glucose concentration as a consequence of the accumulation of pyruvate and its direct chain elongation over α-ketobutyrate and α-ketovalerate.</p> <p>Although the flux to norvaline is low, millimolar concentrations are accumulated in the cultivation broth, which is far above the level which has been discussed for being relevant for misincorporation of norvaline into recombinant proteins. Therefore we believe that our finding is relevant for recombinant protein production but also may even have implications for the physiology of <it>E. coli </it>under oxygen limitation in general.</p

Transient increase of ATP as a response to temperature up-shift in Escherichia coli

BACKGROUND: Escherichia coli induces the heat shock response to a temperature up-shift which is connected to the synthesis of a characteristic set of proteins, including ATP dependent chaperones and proteases. Therefore the balance of the nucleotide pool is important for the adaptation and continuous function of the cell. Whereas it has been observed in eukaryotic cells, that the ATP level immediately decreased after the temperature shift, no data are available for E. coli about the adenosine nucleotide levels during the narrow time range of minutes after a temperature up-shift. RESULTS: The current study shows that a temperature up-shift is followed by a very fast significant transient increase of the cellular ATP concentration within the first minutes. This increase is connected to a longer lasting elevation of the cellular respiration and glucose uptake. Also the mRNA level of typical heat shock genes increases within only one minute after the heat-shock. CONCLUSION: The presented data prove the very fast response of E. coli to a heat-shock and that the initial response includes the increase of the ATP pool which is important to fulfil the need of the cell for new syntheses, as well as for the function of chaperones and proteases

Maatalouden ilmastotiekartta – Tiekartta kasvihuonekaasupäästöjen vähentämiseen Suomen maataloudessa

Suomen maatalous tuotti kaikkiaan noin 16 Mt CO2 ekv. kasvihuonekaasupäästöjä (khk-päästöjä) vuonna 2018. Maatalouden tie tuntuviin kasvihuonekaasupäästöjen vähentämiseen edellyttää laajamittaisia toimia turvemaiden päästöjen vähentämisessä, hiilensidonnan lisäämistä kivennäismailla ja muutoksia maatalouden energian käytössä ja tuottamisessa. Nämä muutokset edellyttävät uusia ohjauksia ja kannustimia viljelijöille, joiden päätehtävänä on edelleen tuottaa kuluttajien tarpeisiin ja mieltymyksin vastaavaa kotimaista ruokaa likimain entisessä laajuudessa. Maataloustuotannon kestävyyttä pyritään kaikilta osin parantamaan, myös kannattavuuden suhteen. Maatilojen mahdollisuudet vähentää kasvihuonekaasupäästöjä poikkeavat suuresti toisistaan. Tuntuvien vähennysten toteuttaminen on siksi suunniteltava huolellisesti ja toteutettava monin eri keinoin, jotta kaikki viljelijät voivat soveltaa sopivia toimenpiteitä yhteistyössä muiden viljelijöiden ja toimijoiden kanssa. Elintarvikkeiden ja maataloustuotteiden kotimainen kysyntä ei tuottajajärjestöjen arvion mukaan olennaisesti muutu vuoteen 2035. Punaisen lihan eli naudan- ja sianlihankulutus kuitenkin vähenee noin 20 % ja samalla siipikarjanlihan kotimainen kulutus kasvaa 20 %. Maidon kysyntä yhteensä, nestemaitotuotteita ja eri jalosteina, vähenee noin 10 % vuoteen 2035. Näiden kysyntämuutosten kanssa lähes samaa tahtia muuttuu myös kotimainen tuotanto, joskin suotuisa viennin kehitys voi pitää kotimaisen tuotannon vähän kulutusmuutosta korkeammalla tasolla. Kotimaassa tuotettujen palkokasvien kysyntä rehuksi ja elintarvikkeiksi kasvaa, samoin kauran. WEM-skenaariossa eli perusura-skenaariossa, jossa ei oleteta kuin melko vähäisiä muutoksia nykyiseen tilanteeseen maataloustuotteiden markkinoilla eikä lainkaan muutoksia pellonkäytössä tai siihen vaikuttavissa ohjauskeinoissa, khk-päästöt alenevat 5 % vuoteen 2035 (6 % vuoteen 2050). Tämä tarkoittaa vajaan 1 Mt CO2 ekv. päästövähennystä vuoteen 2050, joka aiheutuisi pääosin nautakarjan määrän hitaasta vähenemisestä, maataloustuotannon ja pellonkäytön pysyessä pääosin ennallaan. WAM-skenaarioissa (WAM1 ja WAM2), eli nykyistä perusuraa kunnianhimoisemmissa skenaarioissa, haetaan khk-päästöjen vähennyksiä lisätoimin maatalouden turvemailta, kivennäismaiden hiilensidontaa lisäämällä, ja tuottamalla enemmän biokaasua ja aurinkoenergiaa maatalouden yhteydessä. Näihin liittyy turvemailla monia toimenpiteitä, kuten yksivuotisten kasvien vähäisempää viljelyä, säätösalaojitusta, ennallistamista ja kosteikkoviljelyä vedenpinnan korkealla pitämiseksi, jotka vähentävät khk-päästöjä. WAM-skenaarioissa kasvien satotasot nousevat 10 % vuoteen 2035 ja yli 15 % vuoteen 2050 erityisesti uusien kasvilajikkeiden ja niiden asianmukaisen viljelyn ja tarkan panoskäytön keinoin, ja myös parantamalla pellon kasvukuntoa monipuolisemman viljelykierron ja maan orgaanisen aineksen lisäämisen kautta. Pellonkäyttö muuttuu merkittävästi monipuolisempaan suuntaan, koska viljan viljelystä ja heikkotuottoisesta osasta tuotantonurmia vapautuu peltoalaa erityisesti palko- ja öljykasvien tuotantoon, biokaasutuotannossa käytettäville nurmille, sekä viherlannoitusnurmille, saneerauskasveille ja erilaisille tavoitteellisille ympäristökesannoille. Kokonaisuutena kivennäismaiden hiilensidonta paranee selvästi ja kivennäismaat muuttuvat khk-päästöjen lähteestä niiden nieluksi vuoteen 2035. Tätä tehostetaan kerääjäkasvialaa lisäämällä ja monilajisilla satoisilla nurmilla niin tuotanto- kuin kesantonurmillakin. Biokaasua ja aurinkoenergiaa edistetään uusilla ohjauksilla ja lisätuilla liittyen tuotetun energian hyödynnettävyyteen ja ravinnekiertoon yhteistyössä eri toimijoiden kanssa. WAM1-skenaariossa khk-päästöt alenevat 29 % vuodesta 2018 vuoteen 2035 ja 38 % vuoteen 2050. Tämä tarkoittaa noin 6 Mt CO2 ekv. päästöjen vähennystä vuoteen 2050. Tästä noin 1,9 Mt CO2 ekv. saavutetaan turvemaita koskevilla toimilla ja noin 2,2 Mt CO2 ekv. pellonkäytön muutoksen ja tavoitteellisen kivennäismaiden hiilensidonnan keinoin. Maatalouden energiankäytön ja tuotannon muutoksesta aiheutuu myös pieni khk-päästöjen lasku, samoin nautakarjan määrän vähenemisestä, joka on WAM-skenaarioissa samalla tasolla kuin WEM-skenaariossa. WAM2-skenaariossa maatalouden khk-päästöt vähenevät 42 % vuoteen 2035 (77 % vuoteen 2050) vuodesta 2018. Tämä tarkoittaisi noin 12 Mt CO2 ekv. päästövähennystä vuoteen 2050 (6,8 Mt CO2 ekv. jo vuoteen 2035). Tästä noin 3,1 Mt CO2 ekv. aiheutuisi turvemailla tehtävien toimien laajamittaisemmasta soveltamisesta, erityisesti turvemaalajia olevien peltojen ennallistamisesta, säätösalaojituksesta ja ohutturpeisten peltojen metsityksestä. Kivennäismailla tavoitteena on tässä skenaariossa suuri, jopa 5 Mt CO2 ekv. suuruinen hiilinielu vuoteen 2050 mennessä (2 Mt CO2 ekv. vuoteen 2035). Tätä on pidetty vahvasti tavoitteellisena ja kunnianhimoisena skenaariona. WAM2-skenaarion suurta tavoitteellista hiilensidontaa kivennäismaihin ei voida toistaiseksi laskea Luonnonvarakeskuksen käyttämillä virallisen kasvihuonekaasuinventaarion aineistoilla ja menetelmillä. Tavoitteen saavuttamisen arvioiminen edellyttäisi uusia aineistoja ja menetelmiä. Tavoite on haasteellinen, uusia ratkaisuja vaativa pitkän aikavälin työ, jossa erityisenä kysymyksenä on paitsi hiilisyötteen lisääminen maahan, myös hiilen pysyvyys maassa, mihin liittyy suuria epävarmuuksia mm. ilmaston lämpenemisestä johtuen. Tuottajajärjestöillä on kuitenkin vahva tahtotila tavoitteen saavuttamiseen. Sen sijaan WAM1-skenaariota voidaan pitää jo nykytiedon valossa saavutettavissa olevana, jopa realistisena, jos ohjauskeinoihin liittyvät haasteet saadaan ratkaisua. Erityisesti tämä koskee sitä, millä ehdoin viljelijälle voidaan korvata täysimääräisesti ne tulonmenetykset, jotka aiheutuvat maataloustukien menetyksistä ennallistettavilla tai viljelykäytöstä poistettavilla huonotuottoisilla turvemailla ja metsitetyillä turve- tai kivennäismailla. Lisäksi turvemailla tarvitaan erillistä tukea ja kannustimia vedenpinnan korkeana pitämiseen ja tämän todentamiseen. Tarkastelujen perusteella näyttää siltä, että erityisesti näihin toimiin tarvitaan uusia resursseja 300-500 milj. euroa 2020-2050 aikajaksolle. Lisäksi tarvitaan resursseja teknologiakehitykseen ja menetelmien soveltamiseen, kuten tarkkuusviljely, uudet satoisammat ja ilmastokestävämmät kasvilajikkeet, hiilensidonnan onnistuminen ja todentaminen kivennäismailla, sekä onnistunut säätösalaojitus ja ennallistaminen turvemailla. Näiden resurssien käyttö olisi alkuvaiheessa osin melko vähäistä, mutta lisääntyisi merkittävästi viimeistään 2030-luvulle tultaessa. Näin siksi, että uusien ohjauskeinojen ja niiden ehtojen sekä teknologian ja todentamisen kehitys vie aikaa. Tämän lisäksi tarvitaan lisätukia ja markkinoiden edistämistä, jotta bioenergian tuotanto ja ravinnekierrätys voivat kasvaa. Merkittävä osa lisäresursseista tulisi saada markkinaehtoisesta toiminnasta. Kokonaisuutena maatalous muuttuu olennaisesti kestävämpään suuntaan monilla eri kestävyyden mittareilla, joten myös julkisten varojen käyttö muutokseen on perusteltua. Ohjauskeinojen suunnittelu entisten ohjausten päälle on haasteellista ja voi edellyttää olemassa olevan ohjauksen kuten maataloustuen tiettyjen ehtojen muuttamista, jotta ohjauksilla olisi toivottu vaikutus esimerkiksi luopumiseen heikkotuottoisten maiden viljelystä. Edellä mainittuja khk-päästöjen vähennyksiä voidaan pitää jo WAM1-skenaarion osalta varsin merkittävinä ja ne vaativat jo laajamittaista työtä monilla tasoilla toteutuakseen. Paljon riippuu myös siitä, päästäänkö molempien WAM-skenaarioiden taustalla oleva maatalouden kestävässä tehostamisessa eteenpäin. Tämä tarkoittaa ennen muuta satotason nostoa ja lannoitteiden ja muiden tuotantopanosten aiempaa tarkempaa hyödyntämistä. Tähän liittyy myös peltojen kasvukunnon parantaminen, nykyistä olennaisesti suurempi viljelykiertojen monipuolistaminen ja siten kivennäismaiden hiilensidonnan edellytysten parantaminen. Sekä turvemaiden toimien, etenkin turvepeltojen vettämisen (eli vedenpinnan noston) laajamittaisen soveltamisen, että kivennäismaiden tehokkaan hiilensidonnan suhteen on paljon merkittäviä epävarmuuksia ja ratkaisemattomia ongelmia. Niihin on tavoitteellisesti haettava ratkaisuja niin maatilatasolla kuin tutkimus- ja kehitystoiminnassa. WAM-skenaarioiden päästökehityksiin johtavat toimet vaativat asetelmaa, jossa viljelijä hyötyy khk-päästöjen vähentämisestä ja niihin liittyvistä toimista. Ellei tällaiseen asetelmaan päästä, vaan viljelijälle koituu tulonmenetyksiä, kuten esimerkiksi maataloustuotantoa haittaavia vaikutuksia tai maataloustukien menetyksiä ilman vastaavaa hyötyä tai kompensaatioita menetyksistä, WAM-skenaarioissa esitettyjen khk-päästövähennysten saavuttaminen ei ole mahdollista. Vaikuttavilla ja hyvin kohdennetuilla ohjauskeinoilla mahdollistetaan samalla kestävien ravinnekiertojen kehittäminen ja lisää päästövähennyksiä. Biokaasutuotanto luo ratkaisuja keskittyvän kotieläintuotannon alueellisiin haasteisiin lantaravinteiden hyödyntämisessä ja maatalouden ravinneomavaraisuuden parantamisessa (mineraalilannoitteiden korvaaminen). Osana khk-päästöjen vähentämiseen liittyvää kehitystä kuuluu olennaisena osana maatalouden energiantuotannon ja siihen liittyvän ravinnekierron (typpi, fosfori, kalium) edistäminen. WAM1-skenaariossa biokaasutuotantoa ja siihen kytkeytyvää ravinnekiertoa tuettaisiin ja edistettäisiin monin tavoin. Kannustinten myötä sekä liikenne- ja teollisen biokaasun että kierrätyslannoitevalmisteiden markkinat saataisiin kehittymään voimakkaasti, mikä nostaisi maatalouden materiaalien ohjautumista biokaasutuotantoon. Tällöin lannasta yli kolmannes ohjautuisi biokaasutuotantoon. Tuotetun lantabiokaasun energiamäärä nousisi vuoteen 2050 mennessä noin 38 %:iin lannan kokonaisenergiapotentiaalista biokaasuna. Lisäksi energiaa saataisiin WAM1-skenaariossa Etelä-Suomen nurmialoilta 50 000 ha pinta-alalta. Lannoista merkittävä osa päätyisi suuriin maatilakokoluokkaa suurempiin biokaasulaitoksiin, jotka mahdollistavat alueellisen ravinteiden uusjaon. WAM2-skenaariossa kannustimia ja tukitoimenpiteitä biokaasutuotantoon ja ravinnekiertoihin tulisi vielä lisää. Tällöin biokaasutuotanto maatalouden biomassoista kasvaisi entisestään, etenkin nurmien biokaasukäyttö selvästi kasvaisi sekä liikennebiokaasun ja teollisen biokaasun osuus tuotetusta energiasta nousisi merkittävästi. Maatilakokoluokkaa suurempien laitosten osuus biokaasulaitoksista nousisi liikennebiokaasutuotannon tehostamiseksi ja ohjaamiseksi etenkin nesteytetyn biokaasun suuntaan raskaan liikenteen käyttöön. Tuotetun biokaasun energiamäärä nousisi WAM2-skenaariossa vuoteen 2050 mennessä noin 48 % lannan kokonaisenergiapotentiaalista biokaasuna. Lisäksi energiaa saataisiin WAM2-skenaariossa 150 000 hehtaarin nurmialoilta Etelä-Suomesta. Tällöin nurmen osuus tuotettavasta biokaasusta olisi jo lantaa suurempi. Fossiilista energiaa korvattaessa saavutetaan merkittäviä päästövähennyksiä maatilatasolla ja niiden lähialueilla, vaikka kokonaistasolla vaikutus khk-päästöihin jääkin melko pieneksi, alle 0,5 Mt CO2 ekv. tasolle. Maatalouden materiaaleista tuotettu biokaasuenergia ei kuitenkaan jää ainoastaan maatalouden käyttöön, vaan sektoreiden välinen yhteistyö raaka-aineiden tuotannossa, prosessoinnissa ja lopputuotteiden hyödyntämisessä on välttämätöntä. WAM1-skenaariossa biokaasulaitoksilta arvioidaan vapautuvan kasvitiloille vähintään 8 milj. kg typpilannoitetta. WAM2-skenaariossa biokaasulaitoksilta voidaan arvioida vapautuvan kasvitiloille noin 19 milj. kg typpilannoitetta. Koko maataloudessa käytetiin 2018 noin 150 milj. kg epäorgaanisia teollisesti valmistettuja typpilannoitteita. Ilmastovaikutuksen lisäksi myös muiden ympäristövaikutusten, esimerkiksi ilman laatuun (ammoniakki) ja vesistöjen tilaan (ravinnehuuhtoumat) liittyen, ovat olennainen osa biokaasulaitosten mädätteen kestävää hyödyntämistä ja toimivia ravinnekiertoja. Tuotantorakennusten suuret harjakatot ja myös käytettävissä olevat maa-alueet tekevät maatiloista aurinkovoimaloiden rakentamiseen hyvin soveltuvia. Tuotannon kasvua rajoittaa erityisesti se, että tuotannosta 90% syntyy maalis-syyskuussa ja investointitukikelpoista on vain omaan käyttöön tuotettava aurinkovoima. Investointituen laajentaminen kattamaan myös ulosmyyntiin suunnitellut voimalat ja akustot, ulosmyynnin tuntikohtainen netotus, energiayhteisöjen muodostamisen helpottaminen, virtuaaliakkujen toteutuminen sekä ulosmyytävän sähkön kannustava verokohtelu vauhdittaisivat aurinkovoimalainvestointien toteutumista maatiloilla. Maatilojen sähkönkulutuksesta olisi mahdollista kattaa tilojen itse tuottamalla aurinkosähköllä n. 8% vuoteen 2035 mennessä ja n. 14% vuoteen 2050 mennessä. Kesäkuukausina aurinkovoima akustoon yhdistettynä voi tehdä osasta tiloja täysin sähköomavaraisia. Tarkastelluilla ilmastotoimenpiteillä ja niiden laajamittaiseen edistämiseen tarkoitetulla ohjauksella on myös merkittäviä sosiaalisia ja kulttuurisia vaikutuksia. Toimintaympäristön ja yhteiskunnallisten odotusten muuttuminen vaikuttavat sekä osaamisvaatimuksiin että viljelijöiden ammattikuvaan varsinkin WAM1- ja WAM2-skenaarioissa. WAM1- ja WAM2-skenaarioissa ruoantuotanto integroituu yhä voimakkaammin ilmastotoimiin. Suurilla viljanviljely- ja kotieläintiloilla on paremmat taloudelliset mahdollisuudet ilmastotoimien vaatimien uusien teknologioiden ja tuotantotapojen käyttöönottoon. Yhteistyöverkostoihin perustuva toimintatapa valtaa alaa, mikä WAM2-skenaariossa mahdollistaa laajamittaisen biokaasutuotannon, jossa onnistuneesti yhdistetään hajautettuja ja keskitettyjä ratkaisuja. Pienten ja syrjäisten tilojen mukana pitäminen tässä tehokkaaseen työnjakoon ja yhteistyöhön sekä teknologiamurrokseen perustuvassa kehityksessä on haasteellista, mutta ratkaistavissa verkostomaisesti toimien. Jos viljelijät eivät koe maatalouden muuttuneita tavoitteita tai toimintakulttuuria omakseen, se voi johtaa rooliepäselvyyksiin tai - konflikteihin oman ammattikuvan suhteen. Skenaarioissa toimenpiteet ja kehityskulut eivät kohdistu kaikkiin viljelijöihin samalla tavalla. Yksittäiset viljelijät ovat eri asemassa riippuen tilan ominaispiirteistä ja aikaisemmin jo tehdyistä ilmastotoimenpiteistä. Siksi ilmastotoimia suunniteltaessa myös erilaisten sosiaalisten ja kulttuuristen vaikutusten kohtaantuminen on selvitettävä etukäteen. WAM2-skenaarion kuvaama kehitys voi toteutua vain, jos ilmastotoimien politiikkaohjaus toteutetaan niin, että kaikki viljelijät kokevat olevansa yhteisellä asialla. Tarkastellut kasvihuonekaasupäästöjen vähennystoimenpiteet sekä vähentävät että lisäävät vesistökuormitusta ja peltoluonnon monimuotoisuutta. Aktiivisen viljelytoiminnan väheneminen ja perinteisen peltokäytön korvautuminen uusilla viljelytavoilla ja osin myös maankäyttömuutoksilla luo monipuolisempia peltoympäristöjä ja tarjoaa lisää tilaa luonnonvaraiselle lajistolle. Samat muutokset vähentävät pitkällä aikavälillä myös ravinnevalumia vesistöihin. Toisaalta maankäyttömuutokset kuormittavat lyhyellä aikavälillä merkittävästi paikallisia vesistöjä. Lisäksi maaseutumaisema tulee muuttumaan ja peltolajistolle sopiva pinta-ala vähenee. Ei ole itsestään selvää, että yhteiskunta laajasti ymmärtää ja arvostaa maatalousmaiseman ja pellonkäytön muutosta, joka seuraisi khk-päästöjen voimakkaasta vähentämisestä.202

Puruveden metsät : Taustatietoa monitavoitteiseen metsienhoitoon

Puruvesi on tunnettu niin kansallisesti kuin paikallisesti vesistön erinomaisesta laadusta. Merkittävien luontoarvojensa vuoksi yli 77 % Puruvedestä kuuluu Natura 2000-ohjelmaan. Puruveden laatua ja sen virkistyskäyttöarvoa halutaan vaalia myös tulevaisuudessa. Valuma-alueesta suurin osa, 79 % on metsämaata. Metsien käytöllä on siten suuri vaikutus Puruveden tilaan. Ilmaston muuttuessa metsien käyttöön ja metsistä tulevaan hajakuormitukseen on odotettavissa muutoksia. Tähän julkaisuun on koottu tietoa siitä, miten metsien käyttö vaikuttaa vesistön tilaan ja millaisilla keinoilla metsätalouden vesistökuormitusta voidaan vähentää sekä edistää hiilensidontaa ja monimuotoisuutta. Julkaisu on toteutettu osana HIILIPOLKU -hanketta

Pystyruuviapevaunujen vertailu lihakarjan kasvatuksessa

Aperuokinnan työmenekkiin ja aperehun tasalaatuisuuteen vaikuttavista tekijöistä ei ole aikaisemmin tehty tutkimuksia Suomessa. Opinnäytetyön tavoitteena oli tuoda puolueettomasti esille erilaisien lihanautakasvattamoiden seosrehu-ruokinnan toimivuutta ja käytäntöä aperehun tasalaatuisuuden ja työmenekin näkökulmasta. Tavoitteena oli myös löytää hyviä ratkaisuja suunnitteilla olevaa lihanautakasvattamoa varten. Tutkimustiloiksi valittiin seitsemän lihakarjatilaa, joissa tilavierailujen aikana kuvattiin ja kellotettiin aperuo-kinnan työmenekkiä. Jokaiselta tilalta otettiin myös aperehunäytteet kivennäisanalyysiä ja silpunpituuden määrittämistä varten. Jokaisella tilalla oli kahden pystyruuvin apevaunu, joiden tilavuudet 15-22 m3. Tiloilla eläinmäärät olivat 160 - 500. Appeen epätasalaatuisuuteen vaikuttivat suurimmaksi osaksi käytettävät rehukomponentit, eri rehukompo-nenttien täyttöjärjestys, aperehun sekoittamiseen käytettävä aika ja pystyruuvien pyörimisnopeus. Apere-hun epätasalaatuisuus vaihteli kivennäispitoisuuden osalta 1,8 - 6,3 prosenttia tiloilta otettujen molempien tutkimusnäytteiden välillä. Apevaunun täyttöön käytettävä työmenekki vaihteli säilörehulla 0,05 – 0,14 sekuntia/kg. Viljan ja kivennäi-sen täytössä vastaavat luvut olivat 0,1 - 0,5 sekuntia/kg. Säilörehun täytössä käytettävä työaika vaihteli vuo-sitasolla omassa esimerkkiyksikössä 24,9 - 63,2 h. Viljan ja kivennäisen täytössä työaika oli vuodessa 31 - 86,2 h. Apevaunun täytössä ääripäiden mukaiset työmenekit olivat omassa esimerkkiyksikössä 1,15 -4 minuut-tia/apetonni, jolloin apevaunun täyttöön käytettävä työaika oli vuorokaudessa 7,1 - 24,8 minuuttia. Aperuo-kinnan kokonaisaika esimerkkiyksikössä oli 29 - 58 minuuttia vuorokaudessa. Vuositasolla työajat olisivat 176 - 355 tuntia.There has not been any research conducted in Finland on the factors affecting the homogeneity and labour input of mixed feeding. The aim of this thesis is to bring an objective perspective to the functionality and practice of mixed feeding from the point of view of the homogeneity of mixed feed and labour input. There is also the purpose to find out good solutions for a planned beef cattle farm. As research farms were chosen seven beef cattle farms. The labour input of mixed feeding was filmed and timed during the visits to the farms. Mixed feed samples were also taken from each farm for determination of mineral analyses and chop length. Each farm had a vertical mixer feeder wagon with two augers. Volumes of the mixed feeder wagons were 15-22m3. The amount of beef cattle on the farms varied between160 and 500. Used feed components, different filling order of the feed components, mixing time and the rotation speed of the vertical augers affected most the homogeneity of the mixed feed. Mineral concentration in the samples varied between 1.8-6,3 percent in both samples which were taken from the research farms. The used work efficiency of the filling of the mixed feed wagon varied in silage between 0,05 - 0,14 se-conds/kilogram. When filling by grain and mineral the corresponding factor was 0,1 - 0,5 seconds/kilogram. The work input in silage filling would vary between 24,9-63,2 hours a year on the planned beef cattle farm. When filling with grain and mineral the work input per year would be 31 - 86,2 hours. Work efficiency in the slowest and the fastest way of filling the mixed feed wagon on the planned beef cattle farm would be 1,15- 4 minutes/mixed feed ton. Then the working time spent on the filling of the mixed feed wagon per day would be 7,1 -24,8 minutes. The total time of mixed feeding on the planned beef cattle farm would be 29-58 minutes per day. In a year the working time would be 176 – 355 hours

Effects of environmental variations in <em>Escherichia coli</em> fermentations

Abstract Production of recombinant proteins and organic molecules by microbial fermentation is a widely used process in pharmaceutical, biofuel, food and chemical industries. Micro-organisms are cultivated in a bioreactor enabling a proper environment and conditions for production of the desired product molecule. Usually, however, the conditions in the bioreactor are inhomogeneous because of technical limitations such as insufficient mixing. This causes gradients in various parameters such as temperature, ph, dissolved oxygen or substrate concentration, which can have a negative effect on product quality and quantity. Understanding the effects of such environmental variations for the host organism and product molecule are crucial for the bioprocess control. The aim of this dissertation was to study the metabolic and gene expression level response of Escherichia coli bacterium for variating conditions in the bioreactor. The responses for rapid temperature increase and oxygen limitation was studied by shift experiments. The effect of oscillating oxygen and glucose concentrations, typical for industrial scale processes, was studied with a scale-down model. The main results were obtained in the oxygen downshift experiments. It was shown that a non-canonical amino acid norvaline, known to replace leucine in recombinant proteins, is accumulated in significant concentration under oxygen limitation. The accumulation of norvaline was also observed in the scale-down model indicating that norvaline could also be found in large scale processes. The quantitative gene expression results for the norvaline pathway genes showed no clear response. This indicates that the norvaline formation occurs due to the changes on metabolic rather than transcriptional level. The second key result of this dissertation was the finding, that the accumulation of formate, a typical anaerobic metabolite, was diminished by medium boosted with trace amounts nickel, selenium and molybdenum, enabling the activity of formate degrading enzyme complex. The results of this dissertation can be utilized in the industrial process optimisation and as a basis for further bioprocess studies.Tiivistelmä Vierasproteiinien ja orgaanisten molekyylien tuottaminen fermentoimalla on paljon käytetty menetelmä lääke-, bioenergia-, elintarvike- sekä kemianteollisuudessa. Mikrobit kasvatetaan bioreaktorissa, joka mahdollistaa sopivan kasvuympäristön ja tuotanto-olosuhteet halutulle tuotteelle. Usein bioreaktorin olosuhteet ovat kuitenkin epätasaiset teknisten rajoitteiden kuten riittämättömän sekoitustehon vuoksi. Tämä aiheuttaa eri muuttujien, kuten happi- ja ravinnepitoisuuden, pH:n tai lämpötilan vaihtelua ajan ja paikan suhteen, millä voi olla haitallinen vaikutus tuotteen laatuun tai saantoon. Ympäristötekijöiden muutosten isäntäsolulle tai tuotemolekyylille aiheuttamien vaikutusten ymmärtäminen ovat yksi ratkaisevista tekijöistä bioprosessien hallinnassa. Tässä väitöskirjassa tutkittiin Escherichia coli -bakteerin aineenvaihdunnan sekä geeniekspression vasteita bioreaktorin ajan ja paikan suhteen vaihtelevissa olosuhteissa. Hapenpuutteen ja lämpötilan nousun vaikutusta tutkittiin kokeilla, joissa olosuhdetta kertaluontoisesti ja nopeasti muutettiin. Teollisille fermentointiprosesseille tyypillistä happi- ja ravinnepitoisuuksien jatkuvaa vaihtelua tutkittiin suurta bioreaktoria jäljittelevällä pienoismallilla. Tärkeimmät tulokset liittyivät kokeisiin, joissa tutkittiin hapenpuutetta. Kokeissa kävi ilmi, että happirajoitetuissa olosuhteissa muodostuu huomattavia määriä epätavallista aminohappoa norvaliinia, jonka tiedetään korvaavan leusiinia vierasproteiineissa. Norvaliinin muodostumista havaittiin myös pienoismallilla tehdyissä kasvatuksissa, osoittaen että norvaliinia voi mahdollisesti löytyä myös suuren mitan prosesseista. Geeniekspressiomittaukset eivät osoittaneet muutoksia norvaliinin aineenvaihduntareitillä, osoittaen että havaittu norvaliinin muodostuminen tapahtuu aineenvaihdunnallisten muutosten seurauksena. Toinen tässä väitöstutkimuksessa saatu tärkeä tulos oli muurahaishapon kertymisen vähentyminen, kun kasvatusliuokseen lisättiin nikkeliä, seleeniä ja molybdeeniä aktivoimaan muurahaishappoa hajottavaa entsyymikompleksia. Tämän väitöstutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää teollisten prosessien optimoinnissa ja perustana uusille tutkimusaiheille

Web-sovellusten käytettävyyden arviointi heuristiikkojen avulla

Heuristinen evaluointi on menetelmä, jota käytetään ohjelmistojen käytettävyyden arviointiin. Sen tavoitteena on paljastaa mahdollisia käytettävyysongelmia ohjelmistossa. Heuristisessa evaluoinnissa asiantuntijat vertaavat ohjelmistoa tai sen prototyyppiä yleisesti tunnettuihin periaatteisiin eli heuristiikkoihin. Tämä kirjallisuuskatsaus esittelee tunnettuja heuristiikkoja ja niiden soveltamista erityisesti web-sovelluksiin, millaisia omia heuristiikkoja web-sovellusten käytettävyyden arviointiin kuuluu, mitä eroja ja yhtäläisyyksiä niillä on perinteisiin heuristiikkoihin verrattuna ja kuinka nämä heuristiikat ovat kehittyneet perinteisistä heuristiikoista

High cell density media for <it>Escherichia coli </it>are generally designed for aerobic cultivations – consequences for large-scale bioprocesses and shake flask cultures

Abstract Background For the cultivation of Escherichia coli in bioreactors trace element solutions are generally designed for optimal growth under aerobic conditions. They do normally not contain selenium and nickel. Molybdenum is only contained in few of them. These elements are part of the formate hydrogen lyase (FHL) complex which is induced under anaerobic conditions. As it is generally known that oxygen limitation appears in shake flask cultures and locally in large-scale bioreactors, function of the FHL complex may influence the process behaviour. Formate has been described to accumulate in large-scale cultures and may have toxic effects on E. coli. Although the anaerobic metabolism of E. coli is well studied, reference data which estimate the impact of the FHL complex on bioprocesses of E. coli with oxygen limitation have so far not been published, but are important for a better process understanding. Results Two sets of fed-batch cultures with conditions triggering oxygen limitation and formate accumulation were performed. Permanent oxygen limitation which is typical for shake flask cultures was caused in a bioreactor by reduction of the agitation rate. Transient oxygen limitation, which has been described to eventually occur in the feed-zone of large-scale bioreactors, was mimicked in a two-compartment scale-down bioreactor consisting of a stirred tank reactor and a plug flow reactor (PFR) with continuous glucose feeding into the PFR. In both models formate accumulated up to about 20 mM in the culture medium without addition of selenium, molybdenum and nickel. By addition of these trace elements the formate accumulation decreased below the level observed in well-mixed laboratory-scale cultures. Interestingly, addition of the extra trace elements caused accumulation of large amounts of lactate and reduced biomass yield in the simulator with permanent oxygen limitation, but not in the scale-down two-compartment bioreactor. Conclusion The accumulation of formate in oxygen limited cultivations of E. coli can be fully prevented by addition of the trace elements selenium, nickel and molybdenum, necessary for the function of FHL complex. For large-scale cultivations, if glucose gradients are likely, the results from the two-compartment scale-down bioreactor indicate that the addition of the extra trace elements is beneficial. No negative effects on the biomass yield or on any other bioprocess parameters could be observed in cultures with the extra trace elements if the cells were repeatedly exposed to transient oxygen limitation.</p

High cell density media for Escherichia coli are generally designed for aerobic cultivations – consequences for large-scale bioprocesses and shake flask cultures

BACKGROUND: For the cultivation of Escherichia coli in bioreactors trace element solutions are generally designed for optimal growth under aerobic conditions. They do normally not contain selenium and nickel. Molybdenum is only contained in few of them. These elements are part of the formate hydrogen lyase (FHL) complex which is induced under anaerobic conditions. As it is generally known that oxygen limitation appears in shake flask cultures and locally in large-scale bioreactors, function of the FHL complex may influence the process behaviour. Formate has been described to accumulate in large-scale cultures and may have toxic effects on E. coli. Although the anaerobic metabolism of E. coli is well studied, reference data which estimate the impact of the FHL complex on bioprocesses of E. coli with oxygen limitation have so far not been published, but are important for a better process understanding. RESULTS: Two sets of fed-batch cultures with conditions triggering oxygen limitation and formate accumulation were performed. Permanent oxygen limitation which is typical for shake flask cultures was caused in a bioreactor by reduction of the agitation rate. Transient oxygen limitation, which has been described to eventually occur in the feed-zone of large-scale bioreactors, was mimicked in a two-compartment scale-down bioreactor consisting of a stirred tank reactor and a plug flow reactor (PFR) with continuous glucose feeding into the PFR. In both models formate accumulated up to about 20 mM in the culture medium without addition of selenium, molybdenum and nickel. By addition of these trace elements the formate accumulation decreased below the level observed in well-mixed laboratory-scale cultures. Interestingly, addition of the extra trace elements caused accumulation of large amounts of lactate and reduced biomass yield in the simulator with permanent oxygen limitation, but not in the scale-down two-compartment bioreactor. CONCLUSION: The accumulation of formate in oxygen limited cultivations of E. coli can be fully prevented by addition of the trace elements selenium, nickel and molybdenum, necessary for the function of FHL complex. For large-scale cultivations, if glucose gradients are likely, the results from the two-compartment scale-down bioreactor indicate that the addition of the extra trace elements is beneficial. No negative effects on the biomass yield or on any other bioprocess parameters could be observed in cultures with the extra trace elements if the cells were repeatedly exposed to transient oxygen limitation