Glycosaminoglycans affect the interaction of human plasma kallikrein with plasminogen, factor XII and inhibitors

Human plasma kallikrein, a serine proteinase, plays a key role in intrinsic blood clotting, in the kallikrein-kinin system, and in fibrinolysis. The proteolytic enzymes involved in these processes are usually controlled by specific inhibitors and may be influenced by several factors including glycosaminoglycans, as recently demonstrated by our group. The aim of the present study was to investigate the effect of glycosaminoglycans (30 to 250 µg/ml) on kallikrein activity on plasminogen and factor XII and on the inhibition of kallikrein by the plasma proteins C1-inhibitor and antithrombin. Almost all available glycosaminoglycans (heparin, heparan sulfate, bovine and tuna dermatan sulfate, chondroitin 4- and 6-sulfates) reduced (1.2 to 3.0 times) the catalytic efficiency of kallikrein (in a nanomolar range) on the hydrolysis of plasminogen (0.3 to 1.8 µM) and increased (1.9 to 7.7 times) the enzyme efficiency in factor XII (0.1 to 10 µM) activation. On the other hand, heparin, heparan sulfate, and bovine and tuna dermatan sulfate improved (1.2 to 3.4 times) kallikrein inhibition by antithrombin (1.4 µM), while chondroitin 4- and 6-sulfates reduced it (1.3 times). Heparin and heparan sulfate increased (1.4 times) the enzyme inhibition by the C1-inhibitor (150 nM).Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Departamento de BioquímicaUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Departamento de BiofísicaUNIFESP, EPM, Depto. de BioquímicaUNIFESP, EPM, Depto. de BiofísicaSciEL

Avaliação do curso de Engenharia de das Ciências Agrárias - Opção Engenharia Rural

O presente relatório resulta do trabalho de avaliação ao curso de Engenharia das Ciências Agrárias opção Engenharia Rural levado a cabo pela equipa de Auto-Avaliação da Escola Superior Agrária. Esta equipa, designada pelo conselho científico com a finalidade de proceder a todas as solicitações de avaliação tanto dos cursos como da instituição, é basicamente composta por um coordenador e um elemento de cada unidade departamental. Conforme o curso que se está a avaliar juntam-se à equipa o respectivo coordenador de curso e colaboradores na compilação do relatório. Além destes elementos participaram também neste trabalho um representante dos alunos (designado pela associação de estudantes) e dois funcionários representantes do pessoal administrativo e do pessoal não docente. Em termos metodológicos optou-se pelo seguimento mais ou menos fiel do guião proposto pelo CNAVES, tendo-se recolhido informação de diversos modos: pesquisa documental e bases de dados nos serviços administrativos, inquéritos auto administrados a alunos, docentes e funcionários, inquérito postal aos diplomados e entrevistas directas (por telefone) às entidades empregadoras. Uma vez recolhida e tratada a informação procedeu-se à sua análise crítica tendo como referência os trabalhos de avaliação que até então decorreram relativamente na Escola

VOLUME DE MEIO E NÚMERO DE OÓCITOS PARA FECUNDACÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A origem dos Complexos Cumulus-Oócitos (CCO) bovinos e os diferentes protocolos entre equipes geram variações nos índices de produção in vitro (PIV). O processo pode ser influenciado pelo número de CCO e volume das gotas de maturação, fecundação e cultivo. Neste estudo, avaliou-se a densidade de CCO e o volume de meio de fecundação sobre a PIV com 672 oócitos bovinos. A maturação in vitro (MIV) foi conduzida com 20 CCO em 200µL de TCM-199+rFSHh+10% de soro de vaca em estro (SVE), por 24h, em estufa a 39ºC, 5% CO2 em ar e umidade saturada. Na fecundação (Dia 0 =D0) utilizou-se 5, 10 ou 20 CCO e 2 volumes de meio (1:5 e 1:10), num fatorial 3x2, em 6 repetições. O sêmen foi selecionado por migração ascendente e para a fertilização (1x106 espermatozóides/mL) os gametas foram incubados em Fert-Talp, por 18h. O cultivo foi em grupos de 20 zigotos, em 200µL de fluído sintético do oviduto (SOF) aaci+5%SVE, por 8 dias e as avaliações em D2 (clivagem), D7 (Blastocistos), D9 (Blastocistos expandidos, em eclosão e eclodidos). As taxas de clivagem (80, 85 e 87%), embriões em D9 (23, 27 e 28%) e de eclosão (42, 37 e 48%) foram semelhantes (P>0,05) para 5, 10 ou 20 CCO, respectivamente. Não houve diferença (P>0,05) na clivagem (83 e 85%), embriões em D9 (24 e 28%) e eclosão (41 e 44%) entre as proporções 1:5 e 1:10µL. A produção de blastocistos e taxa de eclosão em D9 não são influenciados pelo número de CCO, nem pela proporção de CCO por volume de meio na fecundação. Volume of medium and number of oocytes for fertilization in the in vitro production of bovine embryos Abstract The origin of the bovine Cumulus Oocytes Complexes (COC) and the different protocols among teems are responsible for the variation rates of the in vitro production (IVP). The process is also influenced by COC number and by the volume of the drop in the maturation, fertilization and culture. In this study, the effect of bovine COC density per drop medium and the fertilization medium volume were evaluated during the bovine IVP using 672 COC. The in vitro maturation was performed with 20 COC in 200µL of TCM-199+rFSHh+10% estrus cow serum (ECS), for 24h in an incubator with 5%CO2 in air, saturated humidity, at 39oC. For the fertilization (Day 0 = D0) 5, 10 or 20 COC and 2 volumes ratio of medium (1:5 and 1:10) were used in a factorial outline 3x2, in 6 replications. Thawed semen was prepared by a swim up process and for the fertilization (1x106 spermatozoa/ ml) the gametes were maintained in Fert-Talp for 18h. Groups of twenty presumed zygotes were cultured in 200µL synthetic oviduct fluid (SOFaaci)+5% ECS, for 8 days. The evaluations were carried out in D2 (cleavage), D7 (blastocysts) and D9 (expanded and hatched blastocyts). The rates of cleavage (80, 85 and 87%), embryos in D9/ D2 (23, 27 and 28%) and hatched blastocstys in D9/D7 (42, 37 and 48%) were similar (P>0.05) for 5, 10 and 20 COC, respectively. No difference was observed in cleavage (83 and 85%), embryos in D9 (24 and 28%) and hatching rates (41 and 44%) for 1:5 and 1:10µL of fertilization medium. Blastocysts production and the hatching rate in D9 were neither influenced by the COC number, nor by the proportion of COC per medium volume used during fertilization

LÍQUIDO FOLICULAR EQÜINO NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS

O desenvolvimento embrionário de oócitos bovinos maturados in vitro (MIV) foi avaliado em meio suplementado com líquido folicular eqüino (Lfe). Foram distribuídos 1045 oócitos em 11 repetições formando três grupos tratamentos (T1, T2, T3) e um controle (C). O meio de maturação utilizado foi o TCM-199 acrescido de piruvato de sódio, hormônio folículo estimulante recombinante (rFSHh) e hormônio luteinizante equino (LHe). Suplementou-se esse meio com 10% de soro de égua em estro para o grupo controle e para T1, T2 e T3, o meio foi suplementado com 5, 10, e 20% de LFe, respectivamente. Os oócitos foram maturados in vitro (MIV) por 24h. A fecundação in vitro (FIV) foi realizada em meio Talp-Fert. A MIV e a FIV foram realizadas em estufa a 39ºC com 5% de CO2 em ar e umidade saturada. Os zigotos foram cultivados em meio SOFaaci, sob óleo mineral no interior de bolsas plásticas gaseificadas. As taxas de clivagem e de blastocistos foram observadas diariamente (D), e em D7, foram superiores (P0,05) às do grupo controle. Em D9, a taxa de blastocistos do T2 foi superior (P0,05). O LFe, na concentração de 10% pode ser utilizado, em substituição ao soro de égua em estro para suplementar o meio de MIV de oócitos bovinos. Equine follicular fluid on in vitro maturation of bovine oocytes Abstract Embryo development of bovine oocytes was evaluated using maturation medium supplemented with equine follicular fluid (eFF). One thousand and forty five (1045) oocytes were distributed in 11 replications forming three treatment groups (T1, T2 e T3) and one Control (C). TCM-199 added with sodium pyruvate, rFSHh and LHe was used as maturation medium. This medium was supplemented with 10% estrous mare serum for Control group, and 5, 10, and 20% eFF, respectively, for T1, T2 e T3 groups. In vitro maturation (IVM) of all groups was performed during 24h. In vitro fertilization (IVF) was performed in TALP-FERT medium. IVM and IVF were carried out in an incubator at 39ºC with 5% CO2 in air and saturated humidity. Zygotes were cultured in SOFaaci medium, under mineral oil in gasified bags. Cleavage and blastocyst rates were daily observed (D), and at D7, were higher (P0.05) for those from control group. At D9, blastocyst rate of T2 was higher (P0.05). The eFF, at a 10% concentration, can replace the use of estrous mare serum to supplement the IVM medium of bovine oocytes

LÍQUIDO FOLICULAR FRESCO OU CONGELADO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A manutenção dos complexos cumulus-oócitos (CCO) em líquido folicular (LF) antes da sua maturação, além de visar a capacitação, viabiliza o transporte até o laboratório por ser de baixo custo, de fácil aquisição e o congelamento do LF permite seu armazenamento para futura utilização. Neste experimento avaliou-se o efeito do congelamento do LF obtido de folículos de 2-8mm e de folículos >8mm, sobre a taxa de produção embrionária. Oócitos foram aspirados de folículos de 2 a 8mm de ovários provenientes de abatedouro. No grupo controle (n=295) os CCO foram maturados por 24h. Nos tratamentos GF (n=297) e GC (n=282), os CCO foram mantidos por 6h a 30ºC em LF fresco ou congelado, respectivamente, de folículos >8mm. Já no tratamento PF(n=278) e PC (n=281), os CCO foram mantidos em LF fresco ou congelado, respectivamente, de folículos de 2-8mm. Posteriormente, os CCO dos tratamentos GF, GC, PF e PC foram maturados por 18h. Não houve efeito negativo do congelamento do líquido folicular e nem do tamanho dos folículos sobre as taxas de clivagem e produção embrionária em D7 e D9 (P>0,05). No entanto, o congelamento do LF de folículos de 2 a 8mm resultou em redução da taxa de eclosão e do número de células dos blastocistos. A manutenção de oócitos bovinos por 6h a 30ºC, antes da maturação, pode ser efetuada em líquido folicular de folículos >8mm, fresco ou congelado. Fresh or frozen follicular fluid in vitro bovine embryo production Abstract In addition to the capacitation, the maintenance of cumulus-oocyte complex (COC) in follicular fluid (FF) before maturation, allows the transport to the laboratory, being a practical and less expensive media. The FF can be stored after freezing to future use. Oocytes aspirated from bovine slaughterhouse ovaries, were used to evaluate the effect of maintaining the oocytes in fresh or frozen bovine FF (from 2-8mm and >8mm follicles) on the blastocyst rate. In the control group (n=259) the COC were matured for 24h. On treatments GF (n=297) and GC (n=282) the COC were held for 6h at 30°C in fresh or frozen FF from >8mm follicles, respectively. In treatments PF (n=278) and PC (n=281) the COC were held in fresh or frozen FF from 2-8mm follicles, respectively. Later, the COC from GF, GC, PF and PC were matured for 18h. The freezing process as well as the follicle size had no effect on the cleavage, D7 or D9 blastocyst rates (P>0,05). Nevertheless, the frozen FF from 2-8mm follicles resulted in a reduced hatching rate and lower ICM cells. Fresh or frozen follicular fluid of >8mm follicles could be used for a 6h transport of bovine oocytes before maturation for 18h

LÍQUIDO FOLICULAR FRESCO OU CONGELADO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A manutenção dos complexos cumulus-oócitos (CCO) em líquido folicular (LF) antes da sua maturação, além de visar a capacitação, viabiliza o transporte até o laboratório por ser de baixo custo, de fácil aquisição e o congelamento do LF permite seu armazenamento para futura utilização. Neste experimento avaliou-se o efeito do congelamento do LF obtido de folículos de 2-8mm e de folículos >8mm, sobre a taxa de produção embrionária. Oócitos foram aspirados de folículos de 2 a 8mm de ovários provenientes de abatedouro. No grupo controle (n=295) os CCO foram maturados por 24h. Nos tratamentos GF (n=297) e GC (n=282), os CCO foram mantidos por 6h a 30ºC em LF fresco ou congelado, respectivamente, de folículos >8mm. Já no tratamento PF(n=278) e PC (n=281), os CCO foram mantidos em LF fresco ou congelado, respectivamente, de folículos de 2-8mm. Posteriormente, os CCO dos tratamentos GF, GC, PF e PC foram maturados por 18h. Não houve efeito negativo do congelamento do líquido folicular e nem do tamanho dos folículos sobre as taxas de clivagem e produção embrionária em D7 e D9 (P>0,05). No entanto, o congelamento do LF de folículos de 2 a 8mm resultou em redução da taxa de eclosão e do número de células dos blastocistos. A manutenção de oócitos bovinos por 6h a 30ºC, antes da maturação, pode ser efetuada em líquido folicular de folículos >8mm, fresco ou congelado. Fresh or frozen follicular fluid in vitro bovine embryo production Abstract In addition to the capacitation, the maintenance of cumulus-oocyte complex (COC) in follicular fluid (FF) before maturation, allows the transport to the laboratory, being a practical and less expensive media. The FF can be stored after freezing to future use. Oocytes aspirated from bovine slaughterhouse ovaries, were used to evaluate the effect of maintaining the oocytes in fresh or frozen bovine FF (from 2-8mm and >8mm follicles) on the blastocyst rate. In the control group (n=259) the COC were matured for 24h. On treatments GF (n=297) and GC (n=282) the COC were held for 6h at 30°C in fresh or frozen FF from >8mm follicles, respectively. In treatments PF (n=278) and PC (n=281) the COC were held in fresh or frozen FF from 2-8mm follicles, respectively. Later, the COC from GF, GC, PF and PC were matured for 18h. The freezing process as well as the follicle size had no effect on the cleavage, D7 or D9 blastocyst rates (P>0,05). Nevertheless, the frozen FF from 2-8mm follicles resulted in a reduced hatching rate and lower ICM cells. Fresh or frozen follicular fluid of >8mm follicles could be used for a 6h transport of bovine oocytes before maturation for 18h

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS EM MEIO SUPLEMENTADO COM FONTES PROTÉICAS DEFINIDAS E INDEFINIDAS

Quinhentos e trinta e três (n=533) complexos cumulus-oócitos (CCO) bovinos foram utilizados para comparar a suplementação dos meios de maturação e cultivo com diferentes fontes protéicas: soro de égua em estro (SEE; n=150) e soro de vaca em estro (SVE; n=123), álcool polivinílico (PVA; n=128) e albumina sérica bovina (BSA; n=132). Os grupos de CCO foram distribuídos aletoriamente e maturados in vitro por 24h em TCM199 com 10% de SEE, 10% SVE, 0,1% PVA e 0,6% BSA em estufa de cultivo com 5% de CO2, a 39ºC e umidade saturada. A fecundação foi realizada durante 18h, em meio FERT-TALP em estufa de cultivo. Os embriões foram cultivados por 8 dias em meio synthetic oviduct fluid (SOFaaci) com 5% SEE, 5% SVE, 0,1% PVA e 0,6% BSA em estufa de cultivo a 39ºC, sendo mantidos em bolsas gaseificadas com 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. A produção de embriões no D7 nos tratamentos SEE (33/142; 23%) e SVE (34/103; 33%) foi superior (