In vitro model for study the interaction between tumor and stromal cells

Aim. To develop a model to study the interaction between tumor and stromal cells in three-dimensional culture. Methods. Cultivation of HeLa cell lines and human dermal fibroblasts in monolayer and three-dimensional culture, immunofluorescent and immunohistochemical analysis. Results. In this work we present an approach based on a direct interaction between the cells of multicellular tumor spheroids and spheroids of fibroblasts. Subsequent immunofluorescence analysis allows to determine an origin of cells in the area of their contact. Conclusions. This model will be useful to study the basic mechanisms of carcinogenesis, and to find targets for anticancer therapy.Мета. Розробити модель для вивчення взаємодії пухлинних і стромальних клітин за умов тривимірної культури. Методи. Культивування клітин лінії HeLa і дермальних фібробластів людини в моношаровий і тривимірній культурі, імунофлуоресцентний та імуногістохімічний аналіз. Результати. Запропоновано підхід, що базується на дослідженні безпосередньої взаємодії клітин багатоклітинних сфероїдів пухлинних клітин і сфероїдів фібробластів. Подальший імунофлуоресцентний аналіз дає можливість визначити походження клітин у зоні їхнього контакту. Висновки. Описана модель буде корисною як для вивчення базових механізмів канцерогенезу, так і за пошуку мішеней для протипухлинної терапії.Цель. Разработать модель для изучения взаимодействия опухолевых и стромальных клеток в условиях трехмерной культуры. Методы. Культивирование клеток линии HeLa и дермальных фибробластов человека в монослойной и трехмерной культуре, иммунофлуоресцентный и иммуногистохимический анализ. Результаты. Предложен подход, базирующийся на исследовании непосредственных взаимодействий клеток многоклеточных сфероидов опухолевых клеток и сфероидов фибробластов. Последующий иммунофлуоресцентный анализ дает возможность определить происхождение клеток в зоне их контакта. Выводы. Описанная модель будет полезна как для изучения базовых механизмов канцерогенеза, так и при поиске мишеней для противоопухолевой терапии

Cross-national aspects of the transformation of organizational culture in a pandemic

The ever-decreasing danger of coronavirus infection is forcing scientists from various fields of science to unite to assess not only the medical and epidemiological consequences of the development of this strange disease, but also social and socio-cultural changes in society. In this regard, it becomes necessary to summarize and understand the resource capabilities of various scientific areas to identify both general and specific aspects of the transformation of organizational culture in the context of the COVID-19 pandemic. That is why the authors considered it relevant to analyze the emerging scientific approaches and methods for diagnosing the degree of influence of the pandemic on social processes. The most important manifestation of the cross-cultural aspects of transformation is their socio-psychological base, which reflects similar forms of behavior of individuals in situations of collective stress. The presented study reflects a multidisciplinary approach to intangible factors in the development of social processes under the pressure of global challenges associated with the development of an unknown disease — COVID-19. A special place is occupied by the case related to the change in the attitude of Russian society to culture and cinema in the context of a pandemic. The results of scientific research include identified trends in the impact of COVID-19 on social and economic processes in all countries affected by the pandemic. The authors identified the national characteristics of organizational cultures in a pandemic. The novelty of the study lies in the formalized concept of the cross-national aspects of the transformation of organizational culture in a pandemic. The conclusions and approaches of the authors can be used in the development of national programs to overcome the consequences of COVID-19, taking into account international experience in the economy, social sphere and culture

GPU-accelerated ray-casting for 3D fiber orientation analysis

Orientation analysis of fibers is widely applied in the fields of medical, material and life sciences. The orientation information allows predicting properties and behavior of materials to validate and guide a fabrication process of materials with controlled fiber orientation. Meanwhile, development of detector systems for high-resolution non-invasive 3D imaging techniques led to a significant increase in the amount of generated data per a sample up to dozens of gigabytes. Though plenty of 3D orientation estimation algorithms were developed in recent years, neither of them can process large datasets in a reasonable amount of time. This fact complicates the further analysis and makes impossible fast feedback to adjust fabrication parameters. In this work, we present a new method for quantifying the 3D orientation of fibers. The GPU implementation of the proposed method surpasses another popular method for 3D orientation analysis regarding accuracy and speed. The validation of both methods was performed on a synthetic dataset with varying parameters of fibers. Moreover, the proposed method was applied to perform orientation analysis of scaffolds with different fibrous micro-architecture studied with the synchrotron μCT imaging setup. Each acquired dataset of size 600x600x450 voxels was analyzed in less 2 minutes using standard PC equipped with a single GPU

Generation and characterization of polyclonal antibodies specific to N-terminal extension of p85 isoform of ribosomal protein S6 kinase 1 (p85 S6K1)

Aim. Generation of polyclonal antibodies specific to the ribosomal protein S6 kinase isoform – p85S6K1 and directed to the N-terminal (1–23 aa) extension of p85S6K1. Methods. Animal immunization with synthetic (1–23 aa) peptide, ELISA, Western blot, Immunoprecipitation, immunofluorescent analysis. Results. Polyclonal antibodies have been generated, which specifically recognize only p85 but not p70 isoform of S6K1 in western blot, immunoprecipitation and immunofluorescence analysis. Conclusions. The obtained antibodies can be recommended for studies on the p85S6K1 and other S6K1 isoforms possessing the N-terminal extension – the identification of binding protein partners, analysis of subcellular localization under different physiological conditions, elucidation of the signal transduction pathways involving different S6K1 isoforms.Мета. Отримати поліклональні антитіла специфічні до p85 ізоформи S6K1 и спрямовані до N-кінцевого (1–23 a.к.) подовження p85S6K1. Методи. Іммунизація тварин синтетичним (1–23 а.к.) пептидом, ІФА, вестерн блот, іммунопреципітація, іммуноцитохимічний аналіз. Результати. Отримано поліклональні антитіла, що розпізнають p85, але не p70 ізоформу S6K1 в вестерн блот анализі, іммунопреципітації і іммуноцитохімичному аналізі. Висновки. Отримані антитіла можуть бути рекомендованими для дослідження p85S6K1 та інших ізоформ S6K1, що мають N- кінцеве подовження – ідентифікації білків-партнерів, аналізу субклітинної локалізації за різних фізіологічних умов, аналізі ролі S6K1 ізоформ в сигнальній трансдукції.Цель. Получить полииклональные антитела специфичные к p85 изоформе S6K1 и направленные против N-концевого (1–23 a.к.) удлинения p85S6K1. Методы. Иммунизация животных синтетическим (1–23 а.к.) пептидом, ИФА, вестерн блот, иммунопреципитация, иммуноцитохимический анализ. Результаты. Получены поликлональные антитела распознающие p85, но не p70 изоформу S6K1 в вестерн блот анализе, иммунопреципитации и иммуноцитохимическом анализе. Выводы. Полученные антитела могут быть рекомендованы для изучения p85S6K1 и других изоформ S6K1 обладающих N-концевым удлинением – идентификации белков партнеров, анализе субклеточной локализации при разных физиологических условиях, анализе роли S6K1 изоформ в сигнальной трансдукции

Optimization of in vitro model for analysis of tumor cell migration dynamics

Migration ability is an important feature of tumor cells. There are several approaches to analyze the dynamics of cancer cell migration in vitro. One of the most perspective and closer to the in vivo conditions is the model of initiation of the cell migration from 3D multicellular spheroids onto growth surface. Aim. Optimization of the model for adequate quantitative characteristics of the tumor cell locomotion during several days. Methods. 2D and 3D MCF-7 cell culture, immunofluorescence analysis, and image analysis using computer software Fiji. Results. Unification of spheroid size allowed avoiding a significant data deviation. The obtained spheroids spread completely for 3 days. The highest migration ratio was observed at the 2nd day. The proliferation level at each of 3-day experiment was the same and did not exceed 3%. The validity of the model was tested after migration inhibition by rapamycin (mTOR signaling inhibitor). Additionally, this model was successfully applied to immunofluorescence analysis, namely investigation of p85S6K1 subcellular localization in moving MCF-7 cells. Conclusions. Double filtration of multicellular spheroids allowed unification of their size, which promotes an adequate interpretation of the migration assay. This model enabled the study of tumor cells migration dynamics and can be further used for the development of anticancer drug.Міграційна здатність є важливою ознакою пухлинних клітин. Існує кілька підходів до аналізу динаміки міграції ракових клітин in vitro. Однією з найбільш перспективних і близьких до умов in vivo є модель ініціювання міграції клітин з тривимірного багатоклітинного сфероїда на ростову поверхню. Мета. Оптимізація моделі для адекватної кількісної оцінки міграції пухлинних клітин. Методи. 2- та 3-вимірна культура клітин лінії MCF-7, імунофлюоресцентний аналіз, аналіз зображень з використанням комп'ютерної програми Фіджі. Результати. Уніфікація розміру сфероїдів дозволила уникнути значного розкиду даних. Отримані сфероїди повністю розпластувались протягом 3 днів. Найвищий показник міграції спостерігався на 2-гу добу розпластування сфероїда. Рівень проліферації клітин за кожну добу 3-денного експерименту був майже однаковим і не перевищував 3%. Валідність моделі була протестована після пригнічення міграційної активності клітин під впливом рапаміцину (інгібітор сигналізації mTOR). Крім того, запропонована модель була успішно застосована для дослідження субклітинної локалізації p85S6K1 в мігруючих клітинах лінії MCF-7 за допомогою імунофлюоресцентного аналізу. Висновки. Подвійне фільтрування багатоклітинних сфероїдів дозволяє уніфікувати їх розміри, що в подальшому сприяє адекватній оцінці міграційного потенціалу клітин. Запропонована модель дозволяє вивчати динаміку міграційних процесів пухлинних клітин і може бути використана для тестування протипухлинних препаратів in vitro.Миграционная способность является важной особенностью опухолевых клеток. Существует несколько подходов для анализа динамики миграции раковых клеток in vitro. Одной из наиболее перспективных и приближенных к условиям in vivo является модель инициации миграции клеток из трехмерных многоклеточных сфероидов на поверхность роста. Цель. Оптимизация модели для адекватных количественных характеристик локомоции опухолевых клеток в течение нескольких дней. Методы. 2D и 3D MCF-7 клеточная культура, иммунофлуоресцентный анализ и анализ изображений с использованием компьютерного программного обеспечения Фиджи. Результаты. Унификация размеров сфероидов позволила избежать значительного отклонения данных. Полученные сфероиды распространились полностью за 3 дня. Самый высокий коэффициент миграции наблюдался на 2-й день. Уровень пролиферации в каждом из 3-дневных экспериментов был одинаковым и не превышал 3%. Достоверность модели была проверена после ингибирования миграции рапамицином (ингибитор передачи сигналов mTOR). Кроме того, эта модель была успешно применена для иммунофлуоресцентного анализа, а именно для исследования субклеточной локализации p85S6K1 в движущихся клетках MCF-7. Выводы. Двойная фильтрация многоклеточных сфероидов позволила унифицировать их размер, что способствует адекватной интерпретации анализа миграции. Эта модель позволила изучить динамику миграции опухолевых клеток и может быть в дальнейшем использована для разработки противоопухолевого препарата

ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation.

Pyroptosis is a lytic form of cell death that is induced by inflammatory caspases upon activation of the canonical or noncanonical inflammasome pathways. These caspases cleave gasdermin D (GSDMD) to generate an N-terminal GSDMD fragment, which executes pyroptosis by forming membrane pores. We found that calcium influx through GSDMD pores serves as a signal for cells to initiate membrane repair by recruiting the endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) machinery to damaged membrane areas, such as the plasma membrane. Inhibition of the ESCRT-III machinery strongly enhances pyroptosis and interleukin-1β release in both human and murine cells after canonical or noncanonical inflammasome activation. These results not only attribute an anti-inflammatory role to membrane repair by the ESCRT-III system but also provide insight into general cellular survival mechanisms during pyroptosis

Human GBP1 binds LPS to initiate assembly of a caspase-4 activating platform on cytosolic bacteria

The human non-canonical inflammasome controls caspase-4 activation and gasdermin-D-dependent pyroptosis in response to cytosolic bacterial lipopolysaccharide (LPS). Since LPS binds and oligomerizes caspase-4, the pathway is thought to proceed without dedicated LPS sensors or an activation platform. Here we report that interferon-induced guanylate-binding proteins (GBPs) are required for non-canonical inflammasome activation by cytosolic Salmonella or upon cytosolic delivery of LPS. GBP1 associates with the surface of cytosolic Salmonella seconds after bacterial escape from their vacuole, initiating the recruitment of GBP2-4 to assemble a GBP coat. The GBP coat then promotes the recruitment of caspase-4 to the bacterial surface and caspase activation, in absence of bacteriolysis. Mechanistically, GBP1 binds LPS with high affinity through electrostatic interactions. Our findings indicate that in human epithelial cells GBP1 acts as a cytosolic LPS sensor and assembles a platform for caspase-4 recruitment and activation at LPS-containing membranes as the first step of non-canonical inflammasome signaling

Exosomes: messengers and mediators of tumor-stromal interactions

Intercellular communication is one of the most important factors involved in the maintenance of tissue homeostasis. The alteration of intercellular interaction correlates with a lot of human diseases including cancerogenesis. There are several types of such interconnection. First of all, it is a direct cell-cell contact, as it takes place in epithelium. The disturbance of this communication is expressed as a loss of cell-cell, cell-matrix contacts, disturbances of cell polarity etc. Another way of intercellular interaction involves mutual influence via paracrine factors produced by corresponding cells. However, there is another kind of information exchange between the cells, namely microvesicular transportation. It was revealed that the exosomes take part in intercellular communication in normal tissues as well as in malignant neoplasia. The present review provides the recent information on the formation of exosomes, their composition and especially the exosome participation in tumor-stromal interactions.Міжклітинні комунікації є одним з найважливіших факторів, які беруть участь у підтримці тканинного гомеостазу. Порушення міжклітинних взаємодій корелює з великою кількістю захворювань, серед яких канцерогенез. Існує кілька типів міжклітинних взаємодій. Насамперед, це безпосередній контакт клітина–клітина, що характерно для епітелія. Збій такої міжклітинної взаємодії має наслідком втрату міжклітинних контактів, контактів клітина–матрикс, порушення клітинної полярності і т. д. Інший спосіб міжклітинної взаємодії полягає у взаємному впливові, опосередкованому паракринними чинниками, які продукуються відповідними клітинами. Однак є ще один тип обміну інформаці- єю між клітинами, а саме – мікровезикулярний транспорт. Встановлено, що мікровезикули екзосом беруть участь у взаємодії клітин у нормальних тканинах, а також у злоякісних новоутвореннях. Представлений огляд надає сучасну інформацію щодо формування екзосом, їхнього складу і, особливо, їхньої причетності до пухлино-стромальних взаємодій.Межклеточные коммуникации являются одним из наиболее важных факторов, участвующих в поддержании тканевого гомеостаза. Нарушение межклеточных взаимодействий коррелирует с большим количеством заболеваний, включая канцерогенез. Существует несколько типов межклеточных взаимодействий. Прежде всего, это непосредственный контакт клетка–клетка, что характерно для эпителия. Сбой такого межклеточного взаимодействия выражается в потере межклеточных контактов, контактов клетка–матрикс, в нарушении клеточной полярности и т. д. Другой способ межклеточного взаимодействия заключается во взаимовлиянии, опосредованном паракринными факторами, продуцируемыми соответствующими клетками. Однако существует еще один тип обмена информацией между клетками, а именно – микровезикулярный транспорт. Установлено, что микровезикулы экзосом участвуют во взаимодействии клеток в нормальных тканях, а также в злокачественных новообразованиях. Настоящий обзор предоставляет современную информацию о формировании экзосом, их составе и, особенно, об их причастности к опухолево-стромальным взаимодействиям

3D biodegradable scaffolds of polycaprolactone with silicate-containing hydroxyapatite microparticles for bone tissue engineering: high-resolution tomography and in vitro study

To date, special interest has been paid to composite scaffolds based on polymers enriched with hydroxyapatite (HA). However, the role of HA containing different trace elements such as silicate in the structure of a polymer scaffold has not yet been fully explored. Here, we report the potential use of silicate-containing hydroxyapatite (SiHA) microparticles and microparticle aggregates in the predominant range from 2.23 to 12.40 µm in combination with polycaprolactone (PCL) as a hybrid scaffold with randomly oriented and well-aligned microfibers for regeneration of bone tissue. Chemical and mechanical properties of the developed 3D scaffolds were investigated with XRD, FTIR, EDX and tensile testing. Furthermore, the internal structure and surface morphology of the scaffolds were analyzed using synchrotron X-ray µCT and SEM. Upon culturing human mesenchymal stem cells (hMSC) on PCL-SiHA scaffolds, we found that both SiHA inclusion and microfiber orientation affected cell adhesion. The best hMSCs viability was revealed at 10 day for the PCL-SiHA scaffolds with well-aligned structure (~82%). It is expected that novel hybrid scaffolds of PCL will improve tissue ingrowth in vivo due to hydrophilic SiHA microparticles in combination with randomly oriented and well-aligned PCL microfibers, which mimic the structure of extracellular matrix of bone tissue