Tools development to study interleukin-1 beta in the central nervous system in non-inflammatory condition

L'interleukine-1 beta (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire impliquée dans l'initiation de l'inflammation. Dans les cellules immunitaires, cette cytokine est synthétisée sous la forme d'un précurseur immature (pro-IL-1β) et nécessite un clivage enzymatique pour devenir biologiquement active. Pendant des décennies, il était admis que le rôle de l'IL-1β se limitait à la régulation des processus inflammatoires. Cependant, un nombre croissant d'évidences supportent l'idée, qu'en condition homéostatique, des cellules non-immunitaires du système nerveux central (SNC) peuvent exprimer et/ou être réactives à l'IL-1β. Entre autres, cette cytokine est capable de moduler l'activité synaptique et la plasticité des réseaux à la suite d'une activité neuronale soutenue. Ces effets sont médiés par les récepteurs à l'IL-1, exprimés au niveau des épines dendritiques, qui peuvent interagir physiquement et fonctionnellement avec les récepteurs N-methyl-D-aspartate (NMDA). Basé sur ces observations, nous avons cherché 1/ à caractériser le type cellulaire capable de produire de l'IL-1β en condition homéostatique dans le SNC et 2/ à décrypter les mécanismes cellulaires impliqués dans la maturation et la libération de cette cytokine.Dans cette étude, l'expression de l'IL-1β a été analysée dans l'hippocampe de souris grâce au RNAscope, une technique d'hybridation in situ. L'ARNm de l'IL-1β a été détecté dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe, et plus précisément au niveau du gyrus denté et de l'aire Cornu Ammonis 1 (CA1). En condition homéostatique, environ 40% des neurones de l'aie CA1 expriment en moyenne 0.7 molécules d'ARNm codant pour l'IL-1β. Nous avons également utilisé un biosenseur de BRET permettant de suivre dans le temps et dans l'espace la maturation de l'IL-1β. Exprimé dans les neurones excitateurs de l'hippocampe en culture, cet outil nous a permis de d'identifier qu'une activité neuronale soutenue conduit à la maturation et à la libération de cette cytokine par les neurones. Bien que nos données montrent également que l'IL-1β neuronale est préférentiellement localisée dans les épines dendritiques, la détection des signaux de BRET en microscopie montre que le clivage de cette dernière peut avoir lieu indifféremment dans le corps cellulaire, les dendrites ou les épines dendritiques. La maturation de l'IL-1β est gouvernée par l'activation des récepteurs NMDA et implique les sous-unités GluN2A et GluN2B. Enfin, en couplant la technologie de marquage de proximité par biotinylation à l'aide de l'enzyme APEX2 et une analyse par spectrométrie de masse, nous avons identifié des protéines associées à l'IL-1β dans les neurones en condition basale et après l'activation des récepteurs NMDA. Nos résultats ont identifiés une protéase potentiellement responsable de la maturation de l'IL-1β neuronale et montrent un enrichissement en protéines impliquées dans le transport vésiculaire et les mécanismes d'exocytoses suite à la stimulation NMDA.Ces résultats montrent que les neurones excitateurs de l'hippocampe sont capables de synthétiser, de maturer et de libérer de l'IL-1β en condition non-inflammatoire dans le SNC. L'ensemble des outils développés durant cette thèse permettront de décrypter les mécanismes cellulaires associés aux fonctions de l'IL-1β en conditions physiologiques dans le SNC mais pourront également servir pour mieux caractériser l'implication de cette cytokine dans différents processus physio-pathologiques à travers l'organisme.Interleukin-1 beta (IL-1β) is a pro-inflammatory cytokine involved in the initiation of inflammation. In immune cells, this cytokine is synthesized as an immature precursor (pro-IL-1β) and requires enzymatic cleavage to become biologically active. For decades, it was thought that the role of IL-1β was limited to the regulation of inflammatory processes. However, a growing number of evidence supports the idea that, under homeostatic conditions, non-immune cells of the central nervous system (CNS) can express and/or be reactive to IL-1β. Among other things, this cytokine can modulate synaptic activity and network plasticity following sustained neuronal activity. These effects are mediated by IL-1 receptors, expressed at dendritic spines, which can physically and functionally interact with N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Based on these observations, we sought 1/ to characterize the cell type capable of producing IL-1β under homeostatic conditions in the CNS and 2/ to decipher the cellular mechanisms involved in the maturation and release of this cytokine.In this study, IL-1β expression was analyzed in mouse hippocampus using RNAscope, an in-situ hybridization technique. IL-1β mRNA was detected in hippocampal pyramidal neurons, specifically in the dentate gyrus and Cornu Ammonis 1 (CA1) areas. Under homeostatic conditions, approximately 40% of CA1 neurons express on average 0.7 molecules of mRNA encoding IL-1β. We also used a BRET biosensor to track IL-1β maturation in time and space. Expressed in cultured hippocampal excitatory neurons, this tool allowed us to identify that sustained neuronal activity leads to the maturation and release of this cytokine from neurons. Even if our data also show that neuronal IL-1β is preferentially localized in dendritic spines, the detection of BRET signals by microscopy shows that IL-1β cleavage can also occur indifferently in the cell body, dendrites or dendritic spines. IL-1β maturation is governed by NMDA receptor activation and involves the GluN2A and GluN2B subunits. Finally, by coupling biotinylation proximity labeling technology using the APEX2 enzyme and mass spectrometry analysis, we identified IL-1β-associated proteins in neurons in basal condition and after NMDA receptor activation. Our results identified a protease potentially responsible for neuronal IL-1β maturation and show an enrichment in proteins involved in vesicular transport and exocytosis mechanisms following NMDA stimulation.These results show that hippocampal excitatory neurons can synthesize, mature and release IL-1β under non-inflammatory conditions in the CNS. All the tools developed during this thesis will allow to decipher the cellular mechanisms associated with the functions of IL-1β under physiological conditions in the CNS but can also be used to better characterize the involvement of this cytokine in various physio-pathological processes throughout the organism

Développement d'outils pour étudier l'interleukine-1 beta dans le système nerveux central en condition non inflammatoire

Interleukin-1 beta (IL-1β) is a pro-inflammatory cytokine involved in the initiation of inflammation. In immune cells, this cytokine is synthesized as an immature precursor (pro-IL-1β) and requires enzymatic cleavage to become biologically active. For decades, it was thought that the role of IL-1β was limited to the regulation of inflammatory processes. However, a growing number of evidence supports the idea that, under homeostatic conditions, non-immune cells of the central nervous system (CNS) can express and/or be reactive to IL-1β. Among other things, this cytokine can modulate synaptic activity and network plasticity following sustained neuronal activity. These effects are mediated by IL-1 receptors, expressed at dendritic spines, which can physically and functionally interact with N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Based on these observations, we sought 1/ to characterize the cell type capable of producing IL-1β under homeostatic conditions in the CNS and 2/ to decipher the cellular mechanisms involved in the maturation and release of this cytokine.In this study, IL-1β expression was analyzed in mouse hippocampus using RNAscope, an in-situ hybridization technique. IL-1β mRNA was detected in hippocampal pyramidal neurons, specifically in the dentate gyrus and Cornu Ammonis 1 (CA1) areas. Under homeostatic conditions, approximately 40% of CA1 neurons express on average 0.7 molecules of mRNA encoding IL-1β. We also used a BRET biosensor to track IL-1β maturation in time and space. Expressed in cultured hippocampal excitatory neurons, this tool allowed us to identify that sustained neuronal activity leads to the maturation and release of this cytokine from neurons. Even if our data also show that neuronal IL-1β is preferentially localized in dendritic spines, the detection of BRET signals by microscopy shows that IL-1β cleavage can also occur indifferently in the cell body, dendrites or dendritic spines. IL-1β maturation is governed by NMDA receptor activation and involves the GluN2A and GluN2B subunits. Finally, by coupling biotinylation proximity labeling technology using the APEX2 enzyme and mass spectrometry analysis, we identified IL-1β-associated proteins in neurons in basal condition and after NMDA receptor activation. Our results identified a protease potentially responsible for neuronal IL-1β maturation and show an enrichment in proteins involved in vesicular transport and exocytosis mechanisms following NMDA stimulation.These results show that hippocampal excitatory neurons can synthesize, mature and release IL-1β under non-inflammatory conditions in the CNS. All the tools developed during this thesis will allow to decipher the cellular mechanisms associated with the functions of IL-1β under physiological conditions in the CNS but can also be used to better characterize the involvement of this cytokine in various physio-pathological processes throughout the organism.L'interleukine-1 beta (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire impliquée dans l'initiation de l'inflammation. Dans les cellules immunitaires, cette cytokine est synthétisée sous la forme d'un précurseur immature (pro-IL-1β) et nécessite un clivage enzymatique pour devenir biologiquement active. Pendant des décennies, il était admis que le rôle de l'IL-1β se limitait à la régulation des processus inflammatoires. Cependant, un nombre croissant d'évidences supportent l'idée, qu'en condition homéostatique, des cellules non-immunitaires du système nerveux central (SNC) peuvent exprimer et/ou être réactives à l'IL-1β. Entre autres, cette cytokine est capable de moduler l'activité synaptique et la plasticité des réseaux à la suite d'une activité neuronale soutenue. Ces effets sont médiés par les récepteurs à l'IL-1, exprimés au niveau des épines dendritiques, qui peuvent interagir physiquement et fonctionnellement avec les récepteurs N-methyl-D-aspartate (NMDA). Basé sur ces observations, nous avons cherché 1/ à caractériser le type cellulaire capable de produire de l'IL-1β en condition homéostatique dans le SNC et 2/ à décrypter les mécanismes cellulaires impliqués dans la maturation et la libération de cette cytokine.Dans cette étude, l'expression de l'IL-1β a été analysée dans l'hippocampe de souris grâce au RNAscope, une technique d'hybridation in situ. L'ARNm de l'IL-1β a été détecté dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe, et plus précisément au niveau du gyrus denté et de l'aire Cornu Ammonis 1 (CA1). En condition homéostatique, environ 40% des neurones de l'aie CA1 expriment en moyenne 0.7 molécules d'ARNm codant pour l'IL-1β. Nous avons également utilisé un biosenseur de BRET permettant de suivre dans le temps et dans l'espace la maturation de l'IL-1β. Exprimé dans les neurones excitateurs de l'hippocampe en culture, cet outil nous a permis de d'identifier qu'une activité neuronale soutenue conduit à la maturation et à la libération de cette cytokine par les neurones. Bien que nos données montrent également que l'IL-1β neuronale est préférentiellement localisée dans les épines dendritiques, la détection des signaux de BRET en microscopie montre que le clivage de cette dernière peut avoir lieu indifféremment dans le corps cellulaire, les dendrites ou les épines dendritiques. La maturation de l'IL-1β est gouvernée par l'activation des récepteurs NMDA et implique les sous-unités GluN2A et GluN2B. Enfin, en couplant la technologie de marquage de proximité par biotinylation à l'aide de l'enzyme APEX2 et une analyse par spectrométrie de masse, nous avons identifié des protéines associées à l'IL-1β dans les neurones en condition basale et après l'activation des récepteurs NMDA. Nos résultats ont identifiés une protéase potentiellement responsable de la maturation de l'IL-1β neuronale et montrent un enrichissement en protéines impliquées dans le transport vésiculaire et les mécanismes d'exocytoses suite à la stimulation NMDA.Ces résultats montrent que les neurones excitateurs de l'hippocampe sont capables de synthétiser, de maturer et de libérer de l'IL-1β en condition non-inflammatoire dans le SNC. L'ensemble des outils développés durant cette thèse permettront de décrypter les mécanismes cellulaires associés aux fonctions de l'IL-1β en conditions physiologiques dans le SNC mais pourront également servir pour mieux caractériser l'implication de cette cytokine dans différents processus physio-pathologiques à travers l'organisme

Développement d'outils pour étudier l'interleukine-1 beta dans le système nerveux central en condition non inflammatoire

Interleukin-1 beta (IL-1β) is a pro-inflammatory cytokine involved in the initiation of inflammation. In immune cells, this cytokine is synthesized as an immature precursor (pro-IL-1β) and requires enzymatic cleavage to become biologically active. For decades, it was thought that the role of IL-1β was limited to the regulation of inflammatory processes. However, a growing number of evidence supports the idea that, under homeostatic conditions, non-immune cells of the central nervous system (CNS) can express and/or be reactive to IL-1β. Among other things, this cytokine can modulate synaptic activity and network plasticity following sustained neuronal activity. These effects are mediated by IL-1 receptors, expressed at dendritic spines, which can physically and functionally interact with N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Based on these observations, we sought 1/ to characterize the cell type capable of producing IL-1β under homeostatic conditions in the CNS and 2/ to decipher the cellular mechanisms involved in the maturation and release of this cytokine.In this study, IL-1β expression was analyzed in mouse hippocampus using RNAscope, an in-situ hybridization technique. IL-1β mRNA was detected in hippocampal pyramidal neurons, specifically in the dentate gyrus and Cornu Ammonis 1 (CA1) areas. Under homeostatic conditions, approximately 40% of CA1 neurons express on average 0.7 molecules of mRNA encoding IL-1β. We also used a BRET biosensor to track IL-1β maturation in time and space. Expressed in cultured hippocampal excitatory neurons, this tool allowed us to identify that sustained neuronal activity leads to the maturation and release of this cytokine from neurons. Even if our data also show that neuronal IL-1β is preferentially localized in dendritic spines, the detection of BRET signals by microscopy shows that IL-1β cleavage can also occur indifferently in the cell body, dendrites or dendritic spines. IL-1β maturation is governed by NMDA receptor activation and involves the GluN2A and GluN2B subunits. Finally, by coupling biotinylation proximity labeling technology using the APEX2 enzyme and mass spectrometry analysis, we identified IL-1β-associated proteins in neurons in basal condition and after NMDA receptor activation. Our results identified a protease potentially responsible for neuronal IL-1β maturation and show an enrichment in proteins involved in vesicular transport and exocytosis mechanisms following NMDA stimulation.These results show that hippocampal excitatory neurons can synthesize, mature and release IL-1β under non-inflammatory conditions in the CNS. All the tools developed during this thesis will allow to decipher the cellular mechanisms associated with the functions of IL-1β under physiological conditions in the CNS but can also be used to better characterize the involvement of this cytokine in various physio-pathological processes throughout the organism.L'interleukine-1 beta (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire impliquée dans l'initiation de l'inflammation. Dans les cellules immunitaires, cette cytokine est synthétisée sous la forme d'un précurseur immature (pro-IL-1β) et nécessite un clivage enzymatique pour devenir biologiquement active. Pendant des décennies, il était admis que le rôle de l'IL-1β se limitait à la régulation des processus inflammatoires. Cependant, un nombre croissant d'évidences supportent l'idée, qu'en condition homéostatique, des cellules non-immunitaires du système nerveux central (SNC) peuvent exprimer et/ou être réactives à l'IL-1β. Entre autres, cette cytokine est capable de moduler l'activité synaptique et la plasticité des réseaux à la suite d'une activité neuronale soutenue. Ces effets sont médiés par les récepteurs à l'IL-1, exprimés au niveau des épines dendritiques, qui peuvent interagir physiquement et fonctionnellement avec les récepteurs N-methyl-D-aspartate (NMDA). Basé sur ces observations, nous avons cherché 1/ à caractériser le type cellulaire capable de produire de l'IL-1β en condition homéostatique dans le SNC et 2/ à décrypter les mécanismes cellulaires impliqués dans la maturation et la libération de cette cytokine.Dans cette étude, l'expression de l'IL-1β a été analysée dans l'hippocampe de souris grâce au RNAscope, une technique d'hybridation in situ. L'ARNm de l'IL-1β a été détecté dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe, et plus précisément au niveau du gyrus denté et de l'aire Cornu Ammonis 1 (CA1). En condition homéostatique, environ 40% des neurones de l'aie CA1 expriment en moyenne 0.7 molécules d'ARNm codant pour l'IL-1β. Nous avons également utilisé un biosenseur de BRET permettant de suivre dans le temps et dans l'espace la maturation de l'IL-1β. Exprimé dans les neurones excitateurs de l'hippocampe en culture, cet outil nous a permis de d'identifier qu'une activité neuronale soutenue conduit à la maturation et à la libération de cette cytokine par les neurones. Bien que nos données montrent également que l'IL-1β neuronale est préférentiellement localisée dans les épines dendritiques, la détection des signaux de BRET en microscopie montre que le clivage de cette dernière peut avoir lieu indifféremment dans le corps cellulaire, les dendrites ou les épines dendritiques. La maturation de l'IL-1β est gouvernée par l'activation des récepteurs NMDA et implique les sous-unités GluN2A et GluN2B. Enfin, en couplant la technologie de marquage de proximité par biotinylation à l'aide de l'enzyme APEX2 et une analyse par spectrométrie de masse, nous avons identifié des protéines associées à l'IL-1β dans les neurones en condition basale et après l'activation des récepteurs NMDA. Nos résultats ont identifiés une protéase potentiellement responsable de la maturation de l'IL-1β neuronale et montrent un enrichissement en protéines impliquées dans le transport vésiculaire et les mécanismes d'exocytoses suite à la stimulation NMDA.Ces résultats montrent que les neurones excitateurs de l'hippocampe sont capables de synthétiser, de maturer et de libérer de l'IL-1β en condition non-inflammatoire dans le SNC. L'ensemble des outils développés durant cette thèse permettront de décrypter les mécanismes cellulaires associés aux fonctions de l'IL-1β en conditions physiologiques dans le SNC mais pourront également servir pour mieux caractériser l'implication de cette cytokine dans différents processus physio-pathologiques à travers l'organisme

Procedures for Culturing and Genetically Manipulating Murine Hippocampal Postnatal Neurons

International audienceNeuronal hippocampal cultures are simple and valuable models for studying neuronal function. While embryonic cultures are widely used for different applications, mouse postnatal cultures are still challenging, lack reproducibility and/or exhibit inappropriate neuronal activity. Yet, postnatal cultures have major advantages such as allowing genotyping of pups before culture and reducing the number of experimental animals. Herein we describe a simple and fast protocol for culturing and genetically manipulating hippocampal neurons from P0 to P3 mice. This protocol provides reproducible cultures exhibiting a consistent neuronal development, normal excitatory over inhibitory neuronal ratio and a physiological neuronal activity. We also describe simple and efficient procedures for genetic manipulation of neurons using transfection reagent or lentiviral particles. Overall, this method provides a detailed and validated protocol allowing to explore cellular mechanisms and neuronal activity in postnatal hippocampal neurons in culture

Data_Sheet_1_The Shank3Venus/Venus knock in mouse enables isoform-specific functional studies of Shank3a.pdf

BackgroundShank3 is a scaffolding protein essential for the organization and function of the glutamatergic postsynapse. Monogenic mutations in SHANK3 gene are among the leading genetic causes of Autism Spectrum Disorders (ASD). The multiplicity of Shank3 isoforms seems to generate as much functional diversity and yet, there are no tools to study endogenous Shank3 proteins in an isoform-specific manner.MethodsIn this study, we created a novel transgenic mouse line, the Shank3Venus/Venus knock in mouse, which allows to monitor the endogenous expression of the major Shank3 isoform in the brain, the full-length Shank3a isoform.ResultsWe show that the endogenous Venus-Shank3a protein is localized in spines and is mainly expressed in the striatum, hippocampus and cortex of the developing and adult brain. We show that Shank3Venus/+ and Shank3Venus/Venus mice have no behavioral deficiency. We further crossed Shank3Venus/Venus mice with Shank3ΔC/ΔC mice, a model of ASD, to track the Venus-tagged wild-type copy of Shank3a in physiological (Shank3Venus/+) and pathological (Shank3Venus/ΔC) conditions. We report a developmental delay in brain expression of the Venus-Shank3a isoform in Shank3Venus/ΔC mice, compared to Shank3Venus/+ control mice.ConclusionAltogether, our results show that the Shank3Venus/Venus mouse line is a powerful tool to study endogenous Shank3a expression, in physiological conditions and in ASD.</p

Restoring glutamate receptosome dynamics at synapses rescues autism-like deficits in Shank3-deficient mice

International audienceShank3 monogenic mutations lead to autism spectrum disorders (ASD). Shank3 is part of the glutamate receptosome that physically links ionotropic NMDA receptors to metabotropic mGlu5 receptors through interactions with scaffolding proteins PSD95-GKAP-Shank3-Homer. A main physiological function of the glutamate receptosome is to control NMDA synaptic function that is required for plasticity induction. Intact glutamate receptosome supports glutamate receptors activation and plasticity induction, while glutamate receptosome disruption blocks receptors activity, preventing the induction of subsequent plasticity. Despite possible impact on metaplasticity and cognitive behaviors, scaffold interaction dynamics and their consequences are poorly defined. Here, we used mGlu5-Homer interaction as a biosensor of glutamate receptosome integrity to report changes in synapse availability for plasticity induction. Combining BRET imaging and electrophysiology, we show that a transient neuronal depolarization inducing NMDA-dependent plasticity disrupts glutamate receptosome in a long-lasting manner at synapses and activates signaling pathways required for the expression of the initiated neuronal plasticity, such as ERK and mTOR pathways. Glutamate receptosome disruption also decreases the NMDA/AMPA ratio, freezing the sensitivity of the synapse to subsequent changes of neuronal activity. These data show the importance of a fine-tuning of protein-protein interactions within glutamate receptosome, driven by changes of neuronal activity, to control plasticity. In a mouse model of ASD, a truncated mutant form of Shank3 prevents the integrity of the glutamate receptosome. These mice display altered plasticity, anxiety-like, and stereotyped behaviors. Interestingly, repairing the integrity of glutamate receptosome and its sensitivity to the neuronal activity rescued synaptic transmission, plasticity, and some behavioral traits of Shank3∆C mice. Altogether, our findings characterize mechanisms by which Shank3 mutations cause ASD and highlight scaffold dynamics as new therapeutic target