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    Adenosine A2A receptor ligand recognition and signaling is blocked by A2B receptors

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    The adenosine receptor (AR) subtypes A2A and A2B are rhodopsin-like Gs protein-coupled receptors whose expression is highly regulated under pathological, e.g. hypoxic, ischemic and inflammatory conditions. Both receptors play important roles in inflammatory and neurodegenerative diseases, are blocked by caffeine, and have now become major drug targets in immuno-oncology. By Förster resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and proximity ligation assays (PLA) we demonstrated A2A-A2BAR heteromeric complex formation. Moreover we observed a dramatically altered pharmacology of the A2AAR when co-expressed with the A2BAR (A2B ≄ A2A) in recombinant as well as in native cells. In the presence of A2BARs, A2A-selective ligands lost high affinity binding to A2AARs and displayed strongly reduced potency in cAMP accumulation and dynamic mass redistribution (DMR) assays. These results have major implications for the use of A2AAR ligands as drugs as they will fail to modulate the receptor in an A2A-A2B heteromer context. Accordingly, A2A-A2BAR heteromers represent novel pharmacological targets

    A<sub>2B</sub>-Adenosin-Rezeptor-Homo- und Heterodimere : Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Studien und pharmakologische Charakterisierung

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    Die Adenosin-Rezeptoren, welche zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) gehören, werden in die vier Subtypen, A1, A2A, A2B und A3 unterteilt. Aufgrund der ubiquitĂ€ren Expression der Adenosin-Rezeptoren und deren vielfĂ€ltigen physiologischen Funktionen im menschlichen Körper, sind sie als Targets fĂŒr die pharmazeutische Wirkstoffentwicklung besonders interessant. Der A2A- und der A2B-Rezeptor sind aufgrund der Homologie in der AminosĂ€uresequenz nahe verwandte Rezeptoren, die sich jedoch in der AffinitĂ€t zum endogenen Agonisten Adenosin stark unterscheiden. WĂ€hrend von dem fĂŒr Adenosin "hoch affinen" A2A-Rezeptor bereits die Röntgenkristallstruktur publiziert wurde, ist der "niedrig affine" A2B-Rezeptor der bisher am wenigsten erforschte Adenosinrezeptor-Subtyp. Weder die Ligand-Bindungsstelle ist genau bekannt, noch gibt es Informationen darĂŒber, ob der Rezeptor als Monomer, Dimer oder Oligomer existiert. Basierend auf einem detaillierten Wissen ĂŒber die Ligand-Bindungsstelle und die Interaktionen von Liganden mit dem Rezeptor könnten neue, spezifische und hoch potente Liganden fĂŒr den Adenosin- A2B-Rezeptor gezielt entwickelt werden. Diese A2B-Rezeptor-Liganden könnten möglicherweise zur Behandlung von inflammatorischen Erkrankungen, Asthma, Diabetes und Krebs eingesetzt werden. Im Falle einer Existenz von Dimeren könnten z.B. bivalente Liganden synthetisiert werden, die spezifisch an Dimere binden und somit ein geringeres Potential an unerwĂŒnschten Arzneimittelwirkungen mit sich bringen. Allerdings besitzen solche Verbindungen eine hohe Molmasse, was ihre BioverfĂŒgbarkeit einschrĂ€nkt. Eine andere Möglichkeit wĂ€re die Hemmung der Dimerisierung durch Inhibition der Protein-Interaktion. Des Weiteren ist es denkbar und sogar wahrscheinlich, dass A2B-Homomere eine andere Pharmakologie besitzen als z.B. A2A- A2B-Heteromere, und diese Unterschiede ließen sich möglicherweise in der Arzneistoffentwicklung nutzen, um spezifischere Wirkungen zu erzielen und Nebenwirkungen zu reduzieren. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Rolle der zweiten extrazellulĂ€ren Schleife (EL2) des Adenosin- A2B-Rezeptors genauer erforscht. Diese könnte, wie bei einigen anderen GPCRs, an der Liganden-Bindung beteiligt sein. Der EL2 des A2B-Rezeptors wurde mittels 'Overlap-Extension'-Methode durch den EL2 des A2A-Rezeptors ersetzt. Die daraus resultierende A2B(EL2-A2A)-Rezeptormutante wurde stabil in CHO-Zellen exprimiert und sowohl in Radioligand-Bindungsstudien als auch in funktionellen cAMP-Akkumulationsexperimenten untersucht. Die Ergebnisse der an der A2B(EL2-A2A)-Rezeptormutante untersuchten Agonisten (Adenosin, NECA, BAY60-6583, CGS-21680) zeigt im Vergleich zum Wildtypen stark angestiegene Maximaleffekte (Efficacy). Außerdem bindet der selektive A2A-Agonist CGS-21680 an die A2B(EL2-A2A)-Rezeptormutante und aktiviert diese, wĂ€hrend der A2B-Rezeptor-Wildtyp nicht mit CGS-21680 interagiert. Alle Ergebnisse zusammengefasst zeigen die wichtige Rolle der zweiten extrazellulĂ€ren Schleife bei der Liganderkennung/Ligandbindung und zusĂ€tzlich einen starken Einfluss auf die Aktivierung des Rezeptors. Höchstwahrscheinlich fördert oder stabilisiert der EL2 die Konformation des Rezeptors, bei der das Gs-Protein an den Rezeptor bindet. Außerdem scheint der EL2 auch an der AffinitĂ€tsdifferenz von Adenosin-Derivaten zwischen dem A2A- und dem A2B-Rezeptor beteiligt zu sein. In Zukunft wĂ€re es von Interesse, zusĂ€tzlich – komplementĂ€r - die A2A(EL2- A2B)-Rezeptormutante zu generieren und zu untersuchen. Interessant wĂ€re hierbei insbesondere das Verhalten des selektiven A2A-Agonisten CGS-21680 und des A2B-Agonisten BAY60-6583. Hierbei können weitere Informationen zur Rolle des EL2 gewonnen werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Homodimerisierung von Adenosin- A2B-Rezeptoren mittels Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET). Die Ergebnisse aus den BRET-Studien sowie VerdrĂ€ngungsexperimenten belegen die Existenz von A2B-Homodimeren. DarĂŒber hinaus scheinen sich, betrachtet man die Signalhöhe, auch Trimere und/oder höhere Oligomere zu bilden. Die AffinitĂ€t der A2B-Rezeptoren zueinander ist um den Faktor 10 höher als die des D2-A2A-Heterodimers (Positivkontrolle). Die A2B-Homodimere bilden sehr stabile Dimere, welche weder durch Zugabe von Agonisten noch durch Antagonisten zu Monomeren zerfallen. Es wird vermutet, dass die Dimere bereits im Endoplasmatischen Retikulum gebildet und dann zur Membran transportiert werden, und sich nicht Ligand-induziert in der Membran bilden. Alles deutet auf eine starke und große InteraktionsflĂ€che zwischen den Rezeptoren hin. In einer frĂŒheren Arbeit wurde beim A2A-Rezeptor die AminosĂ€ure Methionin 193 als wichtig fĂŒr die Protein-Protein-Interaktion postuliert. Die homologe AminosĂ€ure im A2B-Rezeptor, Methionin 198, zeigt jedoch lediglich einen geringen Einfluss auf die BindungsstĂ€rke zwischen den A2B-Homodimeren, jedoch beeinflusst es höhere Oligomerisierungformen negativ, wie durch Untersuchung der Met198Ala-Mutante mittels BRET gezeigt werden konnte. Somit fĂŒhrt Met198 möglicherweise zu weniger Tri- bzw. Tetrameren, zugunsten von mehr Dimeren, die aber dafĂŒr eine geringfĂŒgig höhere AffinitĂ€t zwischen den Proteinen aufzuweisen scheinen. Das erstellte Computermodell schlĂ€gt TM2 und TM6 oder TM7 und TM1 des A2B-Homodimers als InteraktionsflĂ€che zwischen den Rezeptoren vor. ZukĂŒnftig sollte die InteraktionsflĂ€che durch Mutagenesestudien genauer eingegrenzt werden. Entsprechende Mutanten könnten mit BRET, FRET sowie der Röntgenkristallstrukturanalyse untersucht werden. Die Frage, welches VerhĂ€ltnis von A2B-Monomeren zu A2B-Homodimeren innerhalb der Zelle vorliegt wĂ€re ein interessanter Forschungsgegenstand, um zu erkennen welche Form den Grundzustand darstellt. Die Signalwege mĂŒssten genau untersucht werden, da Monomere und Dimere hĂ€ufig unterschiedliche Signalkaskaden durch verschiedene G-Proteine in der Zelle beeinflussen. Von großem Interesse ist die Frage, ob der A2B-Rezeptor auch mit anderen Rezeptoren Dimere bilden kann. Dies wurde im dritten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht, in dem die Existenz von A2A- A2B-Heterodimeren nachgewiesen werden konnte. Sowohl BRET-Experimente als auch VerdrĂ€ngungsexperimente belegen deutlich die Existenz von Adenosin-A2A- A2B-Heterodimeren. Aufgrund der Höhe des Signals erscheinen höhere Oligomere eher unwahrscheinlich. Die AffinitĂ€t des A2A-Rezeptors zum A2B-Rezeptor erscheint zwar doppelt so hoch zu sein wie beim A2A-D2-Heterodimer, aber um den Faktor 5 geringer als beim A2B-Homodimer. Auch das A2A- A2B-Heterodimer ist sehr stabil und ließ sich durch keinen der getesteten Liganden beeinflussen. Mit Hilfe der Konfokalen Mikroskopie konnten die Rezeptoren in der Zellmembran lokalisiert werden. Nach den Voraussagen des Computermodells soll die InteraktionsflĂ€che des A2A- A2B-Heterodimers am wahrscheinlichsten durch die TM4 des A2B-Rezeptors und die TM5 des A2A-Rezeptors gebildet werden. ZukĂŒnftig könnten, neben den oben erwĂ€hnten ForschungsansĂ€tzen, die Gewebe bzw. Zelltypen (Lunge, BlutgefĂ€sse, Herz, Gehirn) in denen sowohl der A2A- als auch der A2B-Rezeptor gemeinsam exprimiert sind, auf Heteromere hin untersucht werden, um deren biologische Relevanz zu klĂ€ren. Möglicherweise beeinflusst ein Rezeptor den anderen positiv oder negativ in Bezug auf die Ligandbindung und/oder die FunktionalitĂ€t. Der vierte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Oligomeriserung der Adenosin-Rezeptoren in Oozyten mit Hilfe der SDS- und der Blauen Nativen-PAGE-Methode. Das Ergebnis zeigt, dass A2A- A2B-Rezeptoren nur Dimere und keine höheren Oligomere bilden. FĂŒr den Nachweis von A2B-Homooligomeren reichte die Expression der Rezeptoren in den Oozyten nicht aus. ZukĂŒnftig könnte versucht werden, entweder die Expression der A2B-Rezeptoren durch Zugabe geeigneter Substanzen zu erhöhen, oder es könnte eine andere, höher exprimierende Zelllinie fĂŒr die A2B-Rezeptor-Expression genutzt werden. Bei den Oligomeren sollte weiter untersucht werden, wie viele G-Proteine an den Rezeptorkomplex assoziiert sind, und welche Signalwege nachfolgend aktiviert werden

    BAY60-6583 Acts as a Partial Agonist at Adenosine A 2B

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    The human factor: results of a small-angle scattering data analysis Round Robin

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    23 pages, 10 figures. For the original information sent to RR participants, see https://zenodo.org/record/7506365 . For the anonymized results and Jupyter notebook for analysis, see https://zenodo.org/record/7509710A Round Robin study has been carried out to estimate the impact of the human element in small-angle scattering data analysis. Four corrected datasets were provided to participants ready for analysis. All datasets were measured on samples containing spherical scatterers, with two datasets in dilute dispersions, and two from powders. Most of the 46 participants correctly identified the number of populations in the dilute dispersions, with half of the population mean entries within 1.5% and half of the population width entries within 40%, respectively. Due to the added complexity of the structure factor, much fewer people submitted answers on the powder datasets. For those that did, half of the entries for the means and widths were within 44% and 86% respectively. This Round Robin experiment highlights several causes for the discrepancies, for which solutions are proposed

    Keep Your Head in the Clouds and Your Feet on the Ground: A Multifocal Review of Leadership–Followership Self-Regulatory Focus

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    Bibliography

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    Literaturverzeichnis

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