Bimodal activation of different neuron classes with the spectrally red-shifted channelrhodopsin chimera C1V1 in Caenorhabditis elegans

The C. elegans nervous system is particularly well suited for optogenetic analyses of circuit function: Essentially all connections have been mapped, and light can be directed at the neuron of interest in the freely moving, transparent animals, while behavior is observed. Thus, different nodes of a neuronal network can be probed for their role in controlling a particular behavior, using different optogenetic tools for photo-activation or –inhibition, which respond to different colors of light. As neurons may act in concert or in opposing ways to affect a behavior, one would further like to excite these neurons concomitantly, yet independent of each other. In addition to the blue-light activated Channelrhodopsin-2 (ChR2), spectrally red-shifted ChR variants have been explored recently. Here, we establish the green-light activated ChR chimera C1V1 (from Chlamydomonas and Volvox ChR1′s) for use in C. elegans. We surveyed a number of red-shifted ChRs, and found that C1V1-ET/ET (E122T; E162T) works most reliable in C. elegans, with 540–580 nm excitation, which leaves ChR2 silent. However, as C1V1-ET/ET is very light sensitive, it still becomes activated when ChR2 is stimulated, even at 400 nm. Thus, we generated a highly efficient blue ChR2, the H134R; T159C double mutant (ChR2-HR/TC). Both proteins can be used in the same animal, in different neurons, to independently control each cell type with light, enabling a further level of complexity in circuit analyses

Structural Studies of Biomolecular Systems with Molecular Dynamics Simulations

In vorliegender Arbeit wurden computerbasierte Simulationen eingesetzt, um verschiedene strukturelle Eigenschaften und Dynamiken von Biomolekülen aufzuklären. Die bearbeiteten Themen resultieren aus Kooperationen innerhalb des Graduiertenkolleges 2039 Molekulare Architekturen für die fluoreszente Bildgebung von Zellen. Dabei wurden sowohl klassische Molekulardynamik (MD)-Simulationen verwendet als auch Simulationen mit Verwendung sogenannter coarse-grained-Ansätze, bei denen mehrere Atome zu größeren Einheiten zusammengefasst werden. Aus dem Gebiet der Peptid-Membran-Wechselwirkungen wurden in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Ulrich (KIT) zwei hydrophobe Peptide aus Typ I Toxin-Antitoxin-Systemen bearbeitet. Im Mittelpunkt von Kapitel 3 steht das stress-induzierte Peptid tisB (29 Aminosäuren) aus E. coli, welches die Formation von Biofilmen bewirkt und den elektrochemischen Gradienten an der Bakterienzellmembran stilllegen kann. Es wurden Studien der Assemblierung des Peptides tisB als paralleles Dimer und Tetramer in der Lipidmembran durchgeführt. Die anschließenden langen Simulationen ausgewählter Strukturen wurden mit experimentell gefundenen Ergebnissen verglichen, wobei das Hervortreten des charge zipper-Motivs als Interaktionsmotiv bestätigt werden konnte. Für das Dimer und das Tetramer konnten erstmals Strukturen für einen möglichen Protonentransfer über die Membran aufgespürt werden. Das Tetramer zeichnet sich durch seinen Aufbau aus zwei antiparallelen tisB-Dimeren aus, welches einen ständigen Wasserfaden über das entstandene polare Interface erlaubt, und erscheint als sehr vielversprechende Ausgangsstruktur für mögliche Protonentransferstudien. In Kapitel 4 sind erste strukturelle Studien zum Peptid bsrG (38 Aminosäuren) aus B. subtilis dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass bsrG als Monomer nicht in Lipidmembranen integriert, aber an die Oberfläche assoziiert ist. Die polaren Aminosäuren sind dabei zum Wasser hin ausgerichtet. Mittels Assemblierungsstudien des Peptides als Dimer in der Lipidmembran konnten stabile parallele und antiparallele Strukturen eluiert werden, die mit experimentellen Ergebnissen übereinstimmen und das Bindungsmotiv des hydrogen bond zipper zeigen. In Zusammenarbeit mit den Arbeitskreisen Wagenknecht, Nienhaus und Schepers (alle KIT) wurden MD-Simulationen zur Aufklärung des unterschiedlichen Verhaltens zweier Doppelstrang-RNA-Konstrukte mit FRET-Farbstoffen (arabino- und ribo-Konfiguration) bei der Effizienz des FRET-Transfers eingesetzt (Kapitel 5). MD-Simulationen konnten aufzeigen, dass dieser Unterschied in der Effizienz auf Grundlage der erhöhten Mobilität der arabino-konfigurierten Farbstoffe zu erklären ist, im Gegensatz zu den sehr stark wechselwirkenden und unbeweglichen ribo-konfigurierten Farbstoffen. Jene Mobilität ermöglicht einen effizienten Energietransfer zwischen den Farbstoffen, der zu FRET führt

Ion Selectivity and Competition in Channelrhodopsins

AbstractChannelrhodopsins are light-gated ion channels of green algae. They are widely used for the analysis of neuronal networks using light in the emerging field of optogenetics. Under steady-state light conditions, the two open states, O1 and O2, mediate the photocurrents with different ion conductance and selectivity. To understand the conducting process as well as its optogenetic applications, it is important to study ion binding and transport of this promiscuous cation channel. Here, we present an enzyme kinetic algorithm that allowed us to calculate the ion composition of the initial and steady-state photocurrents for multication media. The approach is based on current-voltage relations determined for the individual ions H+, Na+, Ca2+, and Mg2+. We identify and quantify the widely different competition of the ions in wild-type channelrhodopsin-2 and two high-performing channelrhodopsin variants CatCh+ and C1V1. Both variants show enhanced Ca2+ conductance, but only CatCh+ displays high steady-state Ca2+ currents at neutral pH due to reduced H+ competition and low inactivation. We demonstrate that for optogenetic applications, one should always take into account that the variable equilibria of the two open states depend on light intensity, voltage, and the ionic composition of the medium

Aspekte der mechanochemisch induzierten Suzuki-Miyaura-Reaktion

Bei der Durchführung des Standardansatzes der Suzuki-Miyaura-Reaktion ohne Katalysator (Blindversuche) zeigt sich, dass die C-C-Kupplungsreaktion ohne Katalysator nicht abläuft. Ein möglicher „Palladium-Memory-Effekt“ des Mahlmaterials führt trotz bei Abwesenheit des Katalysators zu äußerst geringen Ausbeuten an Zielprodukt 4-Acetylbiphenyl. Das KF-Al2O3-System (2) mit einer KF-Beladung von 32 Ma% hat sich hinsichtlich der Suzuki-Miyaura-Reaktion als am besten geeignetes „solid reagent system“ erwiesen. Die Beladung an KF ergibt sich aus der Vergleichbarkeit mit dem käuflich erworbenen System (KF-Al2O3 (4)). Für die Variation der Arylhalogenide in der Suzuki-Miyaura-Reaktion mit Phenylboronsäure, KF-Al2O3 (2) [32 Ma%], Palladiumacetat unter den gewählten Reaktionsbedingungen lässt sich folgende Reaktivitätsordnung der Arylhalogenide aufstellen: Br > I >> Cl. Die statistische Auswertung der Parametervariationen mit 4-Bromacetophenon als Edukt ergab folgende Reihenfolge der untersuchten Variablen: Umdrehungszahl > Mahldauer > Mahlkugelgröße > Mahlkugelanzahl > Mahlmaterial (SS = ZZ > AA > SA). Mit diesen Ergebnissen als Grundlage wurde für das Edukt 4-Bromtoluol ein 3 x 3 x 2 x 4-Faktorplan erstellt, abgearbeitet und ausgewertet. Es ergab sich folgende Reihenfolge bzgl. des positiven Einflusses der untersuchten Variablen: Umdrehungszahl > Mahldauer > Mahlkugelgröße = Mahlkugelanzahl > Mahlmaterial (SS = ZZ > AA > SA). Somit lässt sich unter den gewählten Reaktionsbedingungen für die Suzuki-Miyaura-Reaktion eine Orientierung der Parameteroptima erstellen. Werden mittels mechanochemischer Behandlung (RF 1) nur geringe Umsätze erzielt, führt eine nachgeschaltete Bestrahlung im Mikrowellenfeld (RF 2) zur Ausbeutesteigerung. Allerdings ist dieser positive Effekt mit einem erhöhten Energieverbrauch verbunden. Werden mittels mechanochemischer Behandlung bereits relativ hohe Umsätze erzielt, führt eine nachgeschaltete Bestrahlung im Mikrowellenfeld nur zu geringen Ausbeutesteigerungen. Die mechanochemische Behandlung kann als relativ energieeffiziente Methode betrachtet werden (< 4 kWh/mol)

Einflussfaktoren beim Schutz vor Wissensverlust durch leaving experts – Eine Untersuchung zum Wissenstransfer in Unternehmen

Gegenstand der hier vorgestellten Arbeit ist der unternehmensinterne Wissenstransfer und seine Einflussfaktoren. Im Hinblick auf den bereits einsetzenden demografischen Wandel in Deutschland gewinnt die Suche nach Mitteln und Lösungen zur Wissensbe-wahrung und Wissensweitergabe in vielen Unternehmen immer mehr an Bedeutung. Abhängig von der Art des Wissens, ob beispielsweise explizit oder implizit, existieren für dieses Teilgebiet des Wissensmanagements unterschiedliche Ansätze, die in einigen Unternehmen bereits zum Einsatz kommen und in dieser Arbeit näher erläutert werden. Dazu zählen beispielsweise Senior-Expert-Programme oder auch der Einsatz von Web 2.0-Techniken. Neben den Grundlagen zum Wissensmanagement und dem Wissenstransfer selbst, liegt der Fokus dieser Arbeit jedoch vor allem auf dessen Ein-flussfaktoren. Um eine Gewichtung dieser Faktoren zu erzielen, wurde deren Relevanz mit Hilfe einer empirischen Untersuchung, der zwei Zielgruppen zugrunde liegen, ermit-telt. Aus Unternehmensperspektive, die die Zielgruppe der Wissenstransfer-Initiatoren abbilden, spielen bei der Wissensteilung vor allem Konkurrenzgedanken unter Mitar-beitern und ein offenes und vertrauensvolles Klima eine entscheidende Rolle. Aus Sicht der Arbeitnehmer, als Wissenstransfer-Anwender, sind die bedeutendsten Faktoren zum einen ebenfalls das Unternehmensklima zum anderen jedoch der Einsatz von Zeit bei der Wissensübergabe. Trotz dieses Unterschiedes ist als Ergebnis dieser Untersu-chung, festzuhalten, dass soziale Aspekte beim Wissenstransfer mehr Einfluss auf dessen Erfolg haben, als technische und ressourcenbezogene Faktoren.Subject of the present bachelor thesis is the internal knowledge transfer in companies and its influencing factors. The search for means and solutions for the retention and transfer of knowledge becomes, in view of the incipient demographic change in Ger-many, increasingly important in many companies. Depending on the type of knowledge, for example explicit or implicit knowledge, there are different approaches which are already used in practice. These include for example senior expert programs or the use of web 2.0 technology. In addition to the basics of knowledge management the focus of this thesis is on the influencing factors of knowledge transfer. To achieve an evaluation of these factors, their relevance was determined by conducting an empirical study based on two target groups. From the perspective of companies, as the initiators of knowledge transfer, rivalry among employees and an open and trusting climate play significant roles. From the perspective of employees, as the users of knowledge transfer, the most important factors are the corporate climate and the use of time during the knowledge transfer. Despite this difference one remarkable result of this study is that social aspects of knowledge transfer have more influence on its success than technical and resource factors

Light and pH-induced Changes in Structure and Accessibility of Transmembrane Helix B and Its Immediate Environment in Channelrhodopsin-2

A variant of the cation channel channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii (CrChR2) was selectively labeled at position Cys-79 at the end of the first cytoplasmic loop and the beginning of transmembrane helix B with the fluorescent dye fluorescein (acetamidofluorescein). We utilized (i) time- resolved fluorescence anisotropy experiments to monitor the structural dynamics at the cytoplasmic surface close to the inner gate in the dark and after illumination in the open channel state and (ii) time-resolved fluorescence quenching experiments to observe the solvent accessibility of helix B at pH 6.0 and 7.4. The light-induced increase in final anisotropy for acetamidofluorescein bound to the channel variant with a prolonged conducting state clearly shows that the formation of the open channel state is associated with a large conformational change at the cytoplasmic surface, consistent with an outward tilt of helix B. Furthermore, results from solute accessibility studies of the cytoplasmic end of helix B suggest a pH-dependent structural heterogeneity that appears below pH 7. At pH 7.4 conformational homogeneity was observed, whereas at pH 6.0 two protein fractions exist, including one in which residue 79 is buried. This inaccessible fraction amounts to 66% in nanodiscs and 82% in micelles. Knowledge about pH-dependent structural heterogeneity may be important for CrChR2 applications in optogenetics