Improvement of microalgal biomass using physiological and genetic approaches

Microalgae are sustainable biological feedstocks of proteins, carbohydrates, and lipids rich in high-valuable carotenoids and n-3 fatty acids. To facilitate the application of microalgal biomass to food, feed and pharmaceutical markets, microalgal compounds extraction and production needs to be improved. In this thesis, carotenoid extraction was optimised using the euryhaline microalga Tetraselmis striata CTP4, which is known for its mechanical resistant cell covering. Glass bead-assisted disruption using wet biomass and acetone led to the best carotenoid recovery from this species. The same disruption method was afterwards successfully applied to the freshwater species Chlorella vulgaris. Thereafter, the carotenoid and EPA production of the obligate photoautotroph species T. striata was optimised by physiological and genetic approaches. The highest carotenoid content of 8.48 mg g-1 DW was achieved upon a thermal upshift from 20 to 35 °C under high light for only two days. The carotenoid profile contained high amounts of violaxanthin, lutein and β-carotene. However, upon random mutagenesis two norflurazon-resistant T. striata strains were isolated, displaying carotenoid contents of up to 10.2 mg g-1 DW. Comparative gene expression analysis of these mutants and the wildtype (CTP4) revealed the upregulation of several carotenogenesisrelated transcripts in the novel strains. Interestingly, these mutants displayed also fatty acid profiles enriched in EPA. A similar genetic approach applied to C. vulgaris under heterotrophic growth resulted into chlorophyll-deficient mutants with high protein contents of up to 48.7% of DW. Additionally, the norflurazon-resistant strain of C. vulgaris showed a deficiency in carotenoid accumulation. Overall, this study revealed that T. striata is a promising candidate for carotenoids and EPA production. Moreover, the mutants of C. vulgaris broaden the potential of algal biomass for based food products. Furthermore, the study of randomly mutagenized strains provided further insights into the regulation of metabolic pathways, being a powerful tool for strain improvement.As microalgas são uma fonte rica e sustentável de proteínas, glícidos e lípidos, contendo ainda compostos de valor acrescentado, como carotenoides e ácidos gordos essenciais. Comparativamente às fontes tradicionais destes compostos (por exemplo, plantas superiores, frutas e animais), as microalgas apresentam diversas vantagens, uma vez que apresentam maiores produtividades sem necessidade de terreno arável. Além disso, muitas espécies poderem ser cultivadas durante todo o ano com recurso a água salgada ou mesmo residual diminuindo a pressão sobre os recursos de água doce. Apesar destas vantagens e da crescente procura por produtos naturais, apenas algumas espécies de microalgas são exploradas industrialmente para obtenção de compostos de elevado valor, como carotenóides e ácido eicosapentenóico (EPA). Contudo, para facilitar a aplicação da biomassa microalgal no mercado alimentar, rações e produtos farmacêuticos, tanto o processo de extração como de produção destes compostos necessitam ser melhorados. Na presente dissertação, foi otimizada a extração de carotenóides na microalga eurialina Tetraselmis striata CTP4, reconhecida por apresentar uma cobertura celular resistente (teca). Um factor determinante para uma extração de rendimento elevado foi a aplicação de um método de disrupção celular. O método de rutura com a melhor recuperação de carotenóides para esta espécie foi com a utilização de biomassa húmida com recurso a esferas de vidro e acetona como solvente. Embora este método tenha sido desenvolvido para a análise e quantificação de carotenóides à escala laboratorial, o possível aumento de escala do processo para instalações industriais teve relevância na tomada de decisão em relação aos parâmetros da extração, nomeadamente na seleção de solventes, método de disrupção celular e pré-tratamento de biomassa. O mesmo método de disrupção foi posteriormente aplicado à espécie de água doce Chlorella vulgaris, também conhecida por ter uma parede celular de dupla camada. Posteriormente, procedeu-se à otimização da produção de carotenoides para a espécie obrigatória fotoautotrófica T. striata CTP4 usando uma abordagem fisiológica. O objetivo final foi avaliar o uso desta espécie como produtor-triplo, ou seja, capaz de acumular simultaneamente carotenoides, triacilgliceróis (TAGs) e ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa (LC-PUFA). Embora a depleção de azoto tenha demonstrado aumentar o conteúdo lipídico, o fator decisivo para a acumulação de carotenoides nessa espécie foi a reposição de azoto. Nessas condições, o teor mais elevado de carotenoides (8,48 ± 0,47 mg g -1 Peso Seco) foi obtido com imposição de luz elevada, 170 μmol m-2 s-1, e uma mudança térmica de 20°C para 35°C, durante dois dias. No perfil de pigmentos, detetaram-se violaxantina, luteína e β-caroteno com valores máximos de 1,64 ± 0,08; 3,17 ± 0,18 e 3,21 ± 0,18 mg g-1 PS, respetivamente. A luteína foi identificada nas células de T. striata CTP4 em crescimento ativo como um pigmento fulcral na obtenção de luz e na fotoproteção. Além disso, verificou-se que o composto EPA se encontrava aumentado em células cultivadas em condições mesofílicas comparativamente às células sujeitas a stress, sendo responsável por 3,83 ± 0,21% do total de ácidos gordos. Resumindo, na espécie em estudo, o EPA e os pigmentos usados na captação de luz, como a violaxantina e o β-caroteno, acumulam-se quando sujeitas a cultivos de intensidades de luz e temperaturas mais baixas. Contrariamente, os corpos lipídicos, provavelmente compostos por TAGs, e os pigmentos fotoprotetores tal como a luteína, zeaxantina e β-caroteno, aumentam em condições consideradas de stress. Paralelamente, foi melhorado o conteúdo em carotenoides para a estirpe T. striata CTP4, recorrendo ao método de mutagénese aleatória e combinado com a seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) e crescimento em norflurazon. Foram isolados dois mutantes resistentes ao norflurazon, ED5 e B11, com valores mais elevados de carotenoides com resultados 1,5 vezes superiores ao do controlo, com conteúdos máximos de 10,2 ± 0,4 mg g-1 PS. Devido à resistência desses mutantes ao herbicida norflurazon, esperava-se um efeito visível na expressão do gene que codifica a fitoeno-dessaturase. De facto, verificou-se que os níveis de transcrição de outros genes envolvidos na via biossintética dos carotenóides encontram-se significativamente afetados em ambos os mutantes, independentemente das condições de crescimento. Mais especificamente, em condições de stress, os níveis de transcrição dos genes PSY e PDS, que codificam a fitoeno sintase e a fitoeno dessaturase encontram-se aumentados em 1,9 e 2,0 vezes, respetivamente, em células ED5 quando comparadas com o tipo selvagem (WT). Nas mesmas condições, os níveis de transcrição de PSY e PDS também sofreram uma regulação positiva no mutante B11. O conteúdo de clorofila em ambos os mutantes foi até 60% inferior ao do WT, sugerindo um aumento da sensibilidade destas células à luz. É de destacar, também, que os perfis de ácidos gordos desses mutantes mostraram um aumento em EPA em comparação com o WT, atingindo níveis até 8,7% do total de ácidos gordos. As mudanças observadas em diferentes classes de metabólitos sugerem, assim, que as mutações geradas têm um efeito pleiotrópico no metabolismo geral das células. Uma abordagem genética semelhante à aplicada à T. striata CTP4 foi usada para melhorar a biomassa da espécie de C. vulgaris em crescimento heterotrófico. Após mutagénese química, uma estirpe amarela (MT01) e uma branca (MT02) foram isoladas representando uma diminuição de 80% e 99% no conteúdo total de clorofila e em comparação com a espécie selvagem. A cor amarela do MT01, no escuro, deveu-se principalmente à presença de luteína e na estirpe MT02 de C. vulgaris foi detetada uma deficiência na acumulação de carotenoides, com identificação de apenas o carotenoide incolor fitoeno. Notavelmente, ambos os mutantes MT01 e MT02 registaram um teor de proteína 30% e 60% superior ao WT, atingindo 39,5% e 48,7% PS, respetivamente. Os resultados sugerem que a anulação parcial da biossíntese de pigmentos é um fator que pode promover o incremento dos teores de proteína nesta espécie. Tal está provavelmente relacionado com a alteração da regulação de compostos usados para o armazenamento de azoto através, por exemplo, de um desvio para proteína de compostos azotados usados na biossíntese de clorofila. Em geral, este estudo revelou que estirpes melhoradas de T. striata CTP4 são promissoras para a produção de carotenoides e outros compostos considerados de alto valor, com aplicações nas indústrias nutra- e farmacêutica. No entanto, a redução da intensidade de cor verde e aumento do teor de proteína dos mutantes de C. vulgaris amplificam o potencial dos produtos alimentares à base de algas, como ingrediente análogos da carne. Curiosamente, o sucesso de qualquer mutagénese aleatória é altamente dependente da genética da espécie e do procedimento de seleção, pelo que esta tese fornece evidências adicionais que o desenvolvimento por meios genéticos de estirpes de microalgas biotecnologicamente relevantes é uma ferramenta muito poderosa tanto para reunir conhecimento para o melhoramento de estirpes, como para tornar produtos à base de microalgas economicamente sustentáveis

Improved production of lutein and β-carotene by thermal and light intensity upshifts in the marine microalga Tetraselmis sp. CTP4

The industrial microalga Tetraselmis sp. CTP4 is a promising candidate for aquaculture feed, novel food, cosmeceutical and nutraceutical due to its balanced biochemical profile. To further upgrade its biomass value, carotenogenesis was investigated by testing four environmental factors, namely temperature, light intensity, salinity and nutrient availability over different growth stages. The most important factor for carotenoid induction in this species is a sufficient supply of nitrates leading to an exponential growth of the cells. Furthermore, high temperatures of over 30 degrees C compared to lower temperatures (10 and 20 degrees C) induced the accumulation of carotenoids in this species. Remarkably, the two different branches of carotenoid synthesis were regulated depending on different light intensities. Contents of beta-carotene were 3-fold higher under low light intensities (33 mu mol m(-2) s(-1)) while lutein contents increased 1.5-fold under higher light intensities (170 and 280 mu mol m(-2) s(-1)). Nevertheless, highest contents of carotenoids (8.48 +/- 0.47 mg g(-1) DW) were found upon a thermal upshift from 20 degrees C to 35 degrees C after only two days at a light intensity of 170 mu mol m(-2) s(-1). Under these conditions, high contents of both lutein and beta-carotene were reached accounting for 3.17 +/- 0.18 and 3.21 +/- 0.18 mg g(-1) DW, respectively. This study indicates that Tetraselmis sp. CTP4 could be a sustainable source of lutein and beta-carotene at locations where a robust, euryhaline, thermotolerant microalgal strain is required.Funding Agency Portuguese Foundation for Science and Technology UID/Multi/04326/2019 SFRH/BD/115325/2016 SFRH/BD/140143/2018 SFRH/BD/105541/2014 0055 ALGARED+ 05 INTERREG V-A -Espana Portugal project national Portuguese funding PPBI-POCI-01-0145-FEDER-22122 Nord Universityinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Biomass valorization via pyrolysis in microalgae-based wastewater treatment: challenges and opportunities for a circular bioeconomy

Microalgae-based wastewater treatment technology is a sustainable and environmentally friendly alternative to conventional treatment systems. The biomass produced during microalgae-based wastewater treatment can be valorized via pyrolysis to generate multiple valuable products, such as biochar, bio-oil, and pyrolytic gas. This study summarizes the potential of pyrolysis for valorizing microalgal biomass produced from wastewater treatment. It shows how pyrolysis can provide a variety of valuable products, the composition of which is influenced by the type of microalgae used, the operating conditions of the pyrolysis process, and the presence of contaminants in the biomass. It also highlights the main challenges to be addressed before pyrolysis can be adopted to valorize microalgae biomass. These challenges include the high energy requirements of pyrolysis, the need for further research to optimize the process, and the potential for pyrolysis to produce harmful emissions. Despite this, pyrolysis appears as a promising technology with potential to contribute to the sustainable development of a circular economy. Future research should address these challenges and develop more efficient and environmentally friendly pyrolysis processes.Cyan2Bio, PID2021-126564OB-C32;info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Isolation, identification and biotechnological applications of a novel, robust, free-living Chlorococcum (Oophila) amblystomatis strain isolated from a local pond

Bioprospection of novel autochthonous strains is key to the successful industrial-scale production of microalgal biomass. A novel Chlorococcum strain was recently isolated from a pond inside the industrial production facility of Allmicroalgae (Leiria, Portugal). Phylogenetic analysis based on 18S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) gene sequences suggests that this isolate is a novel, free-living Oophila amblystomatis strain. However, as our phylogenetic data strongly suggests that the aforementioned taxon belongs to the genus Chlorococcum, it is here proposed to rename this species as Chlorococcum amblystomatis. In order to characterize the biotechnological potential of this novel isolate, growth performance and biochemical composition were evaluated from the pilot (2.5-m3) to industrial (10-m3) scale. The highest maximum areal productivity (36.56 g m2 day1) was reached in a 10-m3 tubular photobioreactor (PBR), as compared to that obtained in a 2.5-m3 PBR (26.75 g m2 day1). Chlorococcum amblystomatis displayed high protein content (48%–56% dry weight (DW)) and moderate levels of total lipids (18%–31% DW), carbohydrates (6%–18% DW) and ashes (9%–16% DW). Furthermore, the lipid profile was dominated by polyunsaturated fatty acids (PUFAs). The highest pigment contents were obtained in the 2.5-m3 PBR, where total chlorophylls accounted for 40.24 mg g1 DW, followed by lutein with 5.37 mg g1 DW. Overall, this free-living Chlorococcum amblystomatis strain shows great potential for nutritional applications, coupling a promising growth performance with a high protein content as well as relevant amounts of PUFAs, chlorophyll, and carotenoids.FCT: UIDB/04326/2020, UIDB/04292/2020. Projects EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121 and BIODATA.PT ALG-01-0145-FEDER-02223.info:eu-repo/semantics/publishedVersio