Fusarium-homeet viljassa. Homeen tartunta ja toksiinien muodostuminen sekä sadon toksiiniriskin hallinta

SAFECEREAL-projektissa tutkittiin Fusarium-homeita, erityisesti nk. A-tyypin trikotekeenituottajina tunnettuja F. langsethiae ja F. sporotrichioides –lajeja ja niiden toksiinisynteesin käynnistymiseen vaikuttavia tekijöitä kaurassa ja ohrassa kasvukauden aikana. Projektissa tutkittiin myös Fusarium-sienten säilymistä kasvijätteessä ja talvehtimista. Lisäksi otettiin käyttöön menetelmiä toksiinipitoisuuksien varhaiseen ennakointiin ja niiden seuraamiseen ennen sadonkorjuuta sekä turvallisuuslaadun määrittämiseen sadonkorjuun jälkeen. Tutkimus osoitti, että kesän sääolot vaikuttavat merkittävästi kasvinjätteessä talvehtivien Fusarium-lajien määrään ja lajisuhteisiin. F. culmorum ja F. avenaceum muodostivat pääosan talvehtivista Fusariumsienistä. F. langsethiae oli yleinen sekä ohralla että kauralla kasvukauden aikana, mutta lajista tehtiin ainoastaan yksi havainto talven yli säilytetystä kasvijätteestä. Toinen T-2/HT-2 tuottaja F. sporotrichoides sen sijaan selvisi erinomaisesti talven yli oljessa ja sängessä. Kasvijätteet, myös lohkon esikasvijätteet, muodostavat merkittävän tartuntalähteen, joka voi infektoida uuden kasvuston. Mykotoksiinien muodostumista ohrassa tutkittiin kasvukauden aikana ranskriptioprofilointi- (TRAC) ja kemiallista monijäämämenetelmää käyttäen. Tutkimuksessa havaittiin, että erilaiset kasvukauden olosuhteet vuosina 2010 ja 2011 näkyivät myös Fusarium-sienten kasvussa ja aktiivisuudessa. Lisäksi osoitettiin homeiden erilaiset aktiivisuusprofiilit eri satovuosina. Toksiininmuodostus voi alkaa jo varhaisessa vaiheessa, sillä T-2 ja HT-2-toksiineja havaittiin jo ensimmäisissä kasvukauden aikaisissa näytteissä, jotka otettiin 0-4 päivää tähkälle tulon jälkeen vuosina 2010 ja 2011. Projektissa kehitettiin RNAeristysmenetelmä kasvukauden aikaisille ohran tähkänäytteille. Uudella transkriptioprofilointimenetelmällä ja suunniteltujen spesifisten Fusarium-koettimien avulla pystyttiin ensimmäistä kertaa määrittämään Fusarium-sienten toimintaa monimuotoisessa ekosysteemissä. Tutkimuksessa havaittiin myös, että keskimääräiset T-2 ja HT-2 pitoisuudet käsittelemättömissä näytteissä olivat selvästi korkeampia vuonna 2011 kuin 2010, vaikka kesällä 2011 Fusarium-homeiden qPCR analyysissä havaittu määrä oli pienempi. F. langsethiae-lajin yleisyys (viljelymenetelmällä määritettynä) oli kuitenkin selvästi suurempi 2011 kuin 2010. T-2 ja HT-2 toksiineja havaittiin kauralla hieman enemmän kuin ohralla. Viljalajikkeella ei ollut selkeää vaikutusta toksiinituoton herkkyyteen, vaan tulokset vaihtelivat tutkimusvuosien välillä. Tutkittaessa fungisidikäsittelyn vaikutusta T-2+HT-2 -toksiinien tuottajiin ja toksiininmuodostukseen pelto-olosuhteissa, havaittiin, että peittauksella ei ollut vaikutusta F. langsethiae tartuntaan kauralla, eikä kasvukauden aikana tehty torjuntaruiskutus vaikuttanut yksiselitteisesti Fusarium-sienten kasvuun tai toksiinien tuottoon. Valmiista puiduista ohranäytteistä määritettiin jopa suurempia Fusarium-DNA kokonaismääriä torjuntakäsittelyn jälkeen verrattuna käsittelemättömään ohraan. Fusarium-sienten kvantitointi reaaliaikaisen PCR-menetelmän avulla osoittautui lupaavaksi osoitusmenetelmäksi myös kasvukauden aikaisille näytteille. Sen avulla voitiin kvantitoida Fusarium-sienten biomassan määrää monimuotoisessa mikrobiyhteisössä, missä läsnä on myös useita muita sieniryhmiä.Projektissa kehitettiin DON-toksiinille aikaisemman hankeyhteistyön pohjalta alueellista riskimallia, joka oli koekäytössä 2012-2013. Ennuste toimi varsin hyvin vuoden 2013 olosuhteissa ja sen osoittama riskivoitiin todentaa viljan hometoksiiniseurannan näyteaineiston ja viljakaupan aineiston perusteella. Sen sijaan T-2 ja HT-2- toksiineja ei voitu ennustaa säätiedon perusteella. Projektissa tutkittiin T-2 ja HT-2 -pikatestin soveltuvuutta ennen korjuuta tehtäviin määrityksiin. Pikamenetelmien referenssimenetelminä käytettiin LC-MS- ja GC-MS -tekniikkaan perustuvia kemiallisia menetelmiä. Neogen Veratox- T-2 ja HT-2 –testi soveltui valmiin ohra-, kaura- ja vehnäsadon toksiinimäärityksiin, mutta se ei ollut käyttökelpoinen kasvukauden aikana otetuille, valmistumattomille jyvänäytteille. Alustavien tutkimusten mukaan NIR-tekniikka vaikuttaa lupaavalta viljan hometoksiinien monitorointiin viljan vastaanotossa ja käsittelyssä, mutta kalibraatioaineistoa oli vielä käytettävissä liian vähän. Fusarium-sienten esiintymistä valmiissa ohrasadossa määritettiin monialaiseen kuvantamiseen perustuvan VideometerLab-laitteen avulla (Videometer A/S). Tutkimus osoitti, että sovellus ei ole vielä valmis erottamaan Fusarium-saastuneita jyviä vertailunäytteistä. Videometer laitteella saatu Fusariumkontaminaatiotaso ei korreloinut Fusarium-DNA- tai viljelytulosten kanssa. Kuvantaminen olisi onnistuessaan nopea työkalu viljan laadun varmistukseen. Videometer- laitteen kehitystyö on edelleen käynnissä. Tämä tutkimus vahvisti, että viileä ja sateinen kesä on suotuisa Fusarium-sienten kasvulle. Sateisen kesän 2012 ohran satonäytteistä määritettiin jopa 10-kertaisia Fusarium DNA-pitoisuuksia kesän 2011 näytteisiin verrattuna. Tutkimus toi täysin uutta tietoa mykotoksiinisynteesin käynnistymisestä ja toksiinisynteesiin liittyvien geenien ilmenemisestä pellolla kasvukauden aikana. Tässä projektissa saatiin ensimmäistä kertaa osoitettua Fusarium-sienten aktiivisuuden käynnistymisen kannalta kriittinen ajanjakso, joka on 10-14 päivää tähkälle tulon jälkeen. Tutkimus osoitti myös, että varhain ilmenevä geeni Tri 12 on potentiaalinen biomarkkeri toksiinisynteesin käynnistymiselle. Se koodaa ionipumppua, jota tarvitaan trikotekeenitoksiinien kuljetukseen ulos solusta. Geenin aktivaatio havaittiin 2010 ja 2011 ensimmäisenä, jo 3-7 päivää tähkälle tulon jälkeen, selkeästi ennen sienen normaaliin kasvuun liittyvän Fusarium- elongaatiofaktorin ilmenemistä. T-2 ja HT-2 -toksiineja esiintyi yleisesti kasvukauden aikana vaikka olosuhteet olivat epäsuotuisat Fusarium-sienten kasvulle. Lähes kaikista (98%) kesän 2011 kenttäkokeen tähkänäytteistä määritettiin mitattavia HT-2 jaT-2 pitoisuuksia (9-1310 μk/kg). Tutkimus osoitti selkeästi, että T-2 ja HT-2 -toksiinien riskin ennakointia ei voi käytännössä perustaa pelkkään säätietoon, sillä yhteys laajan alueen sään ja sadossa havaittavien T-2 ja HT-2 -toksiinien välillä on selvästi heikompi kuin deoksinivalenolilla

Level of Satisfaction of Admitted Patients

 Background: To determine the level of satisfaction of admitted patients in respect of three components of health services (doctors, nurses, facilities) in different wards and its comparison of level of satisfaction between male and female patients.Methods: In this cross sectional study admitted patients (n= 170) were surveyed using close-ended questionnaire. The variables noted were age, gender, type of room or ward, satisfaction with doctors, nurses and health facilities measured using different variables for each. Satisfaction level was graded as satisfied, no comments, not satisfied and was compared between male and female patients.Results: Out of 170 patients 82.53% were satisfied with health facilities. Most satisfying variables were attitude of doctors for which 91% were satisfied with it and timeliness of nurses as 90% patients were satisfied with it. Most unsatisfying variable was free medication availability as 61% were dissatisfied; followed by cleanliness with which 23% were dissatisfied; and thirdly, expertise of nurses, with it 17% were dissatisfied. Overall 15.84% patients were dissatisfied with health services.Conclusion: There was a reasonable degree of satisfaction in admitted patients of Holy Family Hospital with health services provided to them except for free medication and hygien

Kvantitatiivinen PCR-pikamääritysmenetelmä viljojen Fusarium-homeille

Mykotoksiinien määriin viljoissa EU:ssa on tulossa uusia enimmäismäärärajoja vuonna 2006. Sallittu enimmäismäärä viljojen deoksinivalenoli (DON) pitoisuudelle tulee olemaan ohrassa ja vehnässä 1250 ppb, kaurassa 1750 ppb ja lastenruuissa 200 ppb. Niinpä teollisuus tarvitsee uusia luotettavia pikamääritysmenetelmiä suuren mykotoksiiniriskin omaavien viljaerin löytämiseen tutkittavista viljanäytteistä. Työssä testattiin ensin viittä lajispesifistä lajikeparia SYBR Greeniin perustuvalla kvantitatiivisella PCR:llä vuoden 2002 viljanäytteillä, joiden toksiinimäärät tiedetään. Tulokset olivat kuitenkin vain semikvantitatiivisia eivätkä kovin toistettavia määrien suhteen (hajontaa DNA-määrien suhteen ei-spesifisistä monistustuotteista johtuen), joten emme voineet luotettavasti tutkia eri viljanäytteiden DNA-määrien korrelaatiota toksiinimääriin, vaikka PCR-reaktiota optimoitiin eri tavoilla. Sen sijaan TaqMan-alukkeilla ja koettimilla pystyttiin toistettavasti määrittämään Fusarium graminearum (TMFg12), F. poae (TMpoae), F. sporotrichioides/F.langsethiae (TMLAN), F. avenaceum/F.arthrosporioides (TMAV) ja trikotekeeneita tuottavien Fusarium-lajien (TMTRI) DNA:n määrät suomalaisissa viljanäytteissä GeneAmp 5700 ja LightCycler-laitteilla. Kaikkia TaqMan-alukkeita ja koettimia voidaan käyttää epäilyttävien viljanäytteiden karsimiseen pika-analyysissä esim. viljojen esinäytteiden valinnassa viljelijöiltä ennen yhtiöiden ostopäätöstä. Menetelmä sopii erityisesti kauralla (TMFg12) sekä myös ohralla (TMTRI) ja kevätvehnällä (TMFg12 ja TMTRI) suuria deoksinivalenoli (DON) pitoisuuksia sisältävien näytteiden löytämiseen, ohralla (TMpoae) ja kauralla (TMpoae) suuria nivalenoli (NIV) pitoisuuksia sisältävien viljanäytteiden löytämiseen sekä ohralla (TMAV) suuriamoniliformiini (MON) ja enniatiini (ENN) pitoisuuksia sisältävien näytteiden löytämiseen. Lisäksi menetelmästä on hyötyä (TMLAN) etsittäessä suuria HT2 ja T2pitoisuuksia sisältäviä kauranäytteitä. F. langsethiaen/F. sporotrichioideksen ja F. poaen samanaikainen tunnistaminen sekoitetuista puhdasviljelmistä ja viljanäytteistä onnistui ABI Prism 7700 -laitteella ja antoi erikseen tehtyjen monistusten kanssa yhtäpitävät tulokset. MON- ja ENN-pitoisuudet korreloivat myös vuoden 2002 ohranäytteiden yhdistettyjen F.avenaceum/F.arthrosporioides/F.tricinctum-pitoisuuksienkanssa. Myös DON-pitoisuudet korreloivat suuntaaantavasti yhdistettyjen F.culmorum/F.graminearum-isolaattipitoisuuksien kanssa. Työ perustuu Pikafus-Tekes-projektin loppuraporttiin ja siitä valmisteilla oleviin julkaisuihin

Oluen ylikuohuntaa aiheuttavien Fusarium-hydrofobiinien osoittaminen ja karakterisointi

Gushing is a phenomenon in which beer spontaneously, without agitation, vigorously foams out from its container immediately on opening. Gushing has a marked negative effect on the overall image of beer. Numerous factors causing and contributing to gushing have been reported. Two types of gushing can be distinguished based on the origin of gushing-inducing substances. Non-malt related gushing, i.e. secondary gushing, is due to faults in the beer production process or to incorrect treatment of packaged beer. Primary gushing is induced by fungal metabolites, so-called gushing factors, which are present in malt or in other cereal raw materials of beer. Particularly species of the genus Fusarium have been linked to primary gushing. Although gushing factors produced by fungi have been studied for decades, none of them have hitherto been fully characterised. The hypothesis of this dissertation was that small fungal proteins called hydrophobins are one of the gushing factors inducing primary gushing. Hydrophobins are secreted, highly surface active, moderately hydrophobic proteins produced by filamentous fungi. Hydrophobins play key roles in the development and in the interactions of fungi with their environment and other organisms, particularly plants. The aim of this thesis was to isolate and characterise hydrophobins from gushing active fungi, especially from Fusarium species, and to demonstrate that these hydrophobins are able to induce gushing in beer. Currently, there is no practical, reliable and commercially available method for the prediction of beer gushing from large numbers of samples. The main goal of the work was to develop a test for detection of gushing potential of barley and malt by analysing the hydrophobin levels in samples. Moreover, the occurrence and fate of hydrophobins at different stages of the beer production chain were studied. This study revealed numerous effects of Fusarium fungi on the quality of barley grown under Finnish field conditions and of the corresponding malt. In particular, Fusarium infection increased the gushing potential of malt. The results of the study indicated that the extent of the impacts is species-dependent, F. graminearum having more severe detrimental effects on barley and malt quality than F. culmorum and particularly F. poae. We demonstrated that hydrophobins isolated from strains of the genera Fusarium, Nigrospora and Trichoderma induced beer gushing when added to bottled beer. Hydrophobin concentrations at the ppm level were sufficient for gushing induction. The gushing-inducing capabilities of the isolated hydrophobins varied probably due to their structural differences. We generated profile hidden Markov models for the different hydrophobin classes and searched the F. graminearum genome database for predicted proteins with these models. The search revealed five putative hydrophobin genes belonging to both the hydrophobin classes I and II. The best matching sequences and the corresponding genes were isolated from F. graminearum as well as from the related species F. culmorum and F. poae by PCR and were characterized by sequencing. One each of the putative F. graminearum and F. poae hydrophobin genes were expressed in the heterologous host Trichoderma reesei. The proteins corresponding to the genes were purified and identified as hydrophobins and named GzHYD5 and FpHYD5, respectively. Concentrations of 0.003 ppm of these hydrophobins were observed to induce vigorous beer gushing. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for determination of hydrophobin levels in barley and malt. A connection was found between the hydrophobin level and the gushing potential of malt, suggesting that the developed hydrophobin ELISA can be used for prediction of the gushing risk in malt. Fusarium fungi were observed to produce hydrophobins during the growing period of barley in the field as well as during the malting process, especially during the steeping and germination steps. A small portion of hydrophobins originating from Fusarium-infected malt was shown to pass through the brewing process, ending up in the final beer where they induced gushing when present in sufficiently high levels. Addition of a selected antagonistic starter culture, the yeast strain Pichia anomala VTT C-04565, into the steeping water of barley was shown to suppress hydrophobin production in malting, which in turn decreased the gushing potential of the corresponding malt.Oluen ylikuohunta on ilmiö, jossa olut spontaanisti ja hallitsemattomasti vaahtoaa ulos pulloa avattaessa. Ylikuohunta jaetaan primääriin ja sekundääriin ylikuohuntaan. Sekundääriä ylikuohuntaa aiheuttavat erilaiset oluenvalmistuksen prosessitekniset ongelmat tai valmiin oluen virheellinen käsittely. Primäärin ylikuohunnan saavat aikaan homeiden tuottamat ylikuohuntatekijät, joita saattaa esiintyä maltaassa tai muissa oluen viljapohjaisissa raaka-aineissa. Yleisimmin primääriä ylikuohuntaa aiheuttavat Fusarium-homeet. Homeiden tuottamia ylikuohuntatekijöitä on tutkittu vuosikymmenien ajan, mutta niitä ei ole onnistuttu tarkasti identifioimaan. Tämän tutkimuksen hypoteesina oli, että pienet pinta-aktiiviset homeproteiinit, hydrofobiinit, ovat oluen primääriä ylikuohuntaa aiheuttavia ylikuohuntatekijöitä. Hydrofobiineilla on tunnetusti useita merkittäviä tehtäviä homeiden kasvussa ja kehityksessä. Tutkimuksen tavoitteena oli eristää ja karakterisoida hydrofobiineja ylikuohuntaa aiheuttavista homeista, etenkin Fusarium-suvun lajeista, sekä osoittaa, että nämä hydrofobiinit aiheuttavat oluen ylikuohuntaa. Lisäksi tavoitteena oli kehittää luotettava ja teollisuuden laadunvalvontaan soveltuva menetelmä ylikuohuntataipumuksen määrittämiseksi ohrasta ja maltaasta. Tutkimuksen tarkoituksena oli hankkia tietoa hydrofobiinien käyttäytymisestä ja kulkeutumisesta "ohrasta olueksi" -tuotantoketjussa. Peltokokeet osoittivat, että myös Suomen oloissa Fusarium-homeet kykenivät lisääntymään haitallisesti, mikä heikensi ohran ja siitä valmistetun maltaan laatua. Etenkin ylikuohuntataipumus lisääntyi. Tutkimuksessa havaittiin eroja siinä, miten haitallisesti eri Fusarium-lajit vaikuttivat laatuparametreihin; F. graminearum heikensi laatua voimakkaammin kuin F. culmorum ja etenkin F. poae. Tutkimus osoitti, että hydrofobiinit saavat aikaan ylikuohuntaa olueen lisättyinä. Fusarium-, Nigrospora- ja Trichoderma-suvun homeista eristetyt hydrofobiinit aiheuttivat oluen ylikuohuntaa jo hyvin pieninä pitoisuuksina (< 1 ppm). Eristettyjen hydrofobiinien ylikuohunta-aktiivisuudet erosivat toisistaan todennäköisesti rakenne-erojen seurauksena. Käytimme tunnettujen hydrofobiinien aminohapposekvensseistä luomiamme todennäköisyysmalleja (profile HMMs) etsiessämme hydrofobiinien kaltaisia aminohapposekvenssejä Fusarium graminearum -homeen julkisesta genomitietopankista. Löysimme viisi hydrofobiinikandidaattia, joista valitsimme yhden todennäköisimmän jatkotutkimuksiin. Eristimme ja karakterisoimme tätä hydrofobiinia vastaavat geenit F. graminearum -kannan lisäksi F. culmorum- ja F. poae -kannoista. Eristetyt F. graminearum- ja F. poae -hydrofobiinigeenit siirrettiin Trichoderma reesei -tuottokantaan. Tuoteut ja puhdistetut proteiinit tunnistettiin hydrofobiineiksi ja nimettiin GzHYD5 (F. graminearum) ja FpHYD5 (F. poae). Molemmat hydrofobiinit aiheuttivat oluen ylikuohuntaa pitoisuutena 0,003 ppm. Hydrofobiinivasta-aineisiin perustuva immunologinen ELISA-testi kehitettiin hydrofobiinitasojen määrittämiseen ohra- ja mallasnäytteistä. Testin tulosten todettiin indikoivan maltaan ylikuohuntataipumusta. Testin avulla tutkittiin hydrofobiinitasoja "ohrasta olueksi" -tuotantoketjussa. Fusarium-homeiden todettiin tuottavan hydrofobiineja ohraan kasvukauden aikana pellolla sekä mallastuksessa, etenkin liotuksen ja idätyksen aikana. Pieni osa maltaan sisältämistä hydrofobiineista kulkeutui oluenvalmistusprosessin läpi päätyen valmiiseen olueen. Lisäämällä mallastuksen luontaiseen mikrobiyhteisöön kuuluvaa Pichia anomala VTT C-04565 -hiivaa ohran liotusveteen saatiin vähennettyä hydrofobiinien muodostumista mallastuksen aikana ja samalla valmiin maltaan ylikuohuntapotentiaalia

Säilörehujen homeet ja niiden aiheuttamat riskit

Seminaarin järjestäjät: MTT; Suomen Nurmiyhdistysvo