Farmacogenetica delle malattie infiammatorie croniche intestinali pediatriche

2010/2011Le malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI) comprendono due patologie distinte, la malattia di Crohn (MC) e la rettocolite ulcerosa (RCU), che pur essendo diverse dal punto di vista patogenetico, presentano aspetti clinici comuni quali la presenza di infiammazione cronica a diversi livelli del tratto gastrointestinale e l'alternanza tra fasi attive ed inattive della malattia. Queste patologie hanno un picco di incidenza nell’adulto, tuttavia piu' di un terzo dei casi insorge prima dei sedici anni. L'approccio terapeutico e' principalmente diretto al trattamento e controllo dell'infiammazione, attraverso farmaci capaci di indurre e mantenere la remissione della malattia, che tuttavia inducono effetti avversi importanti, particolarmente rilevanti nella popolazione pediatrica. Nonostante l'introduzione in clinica di farmaci biologici altamente efficaci, i glucocorticoidi (GC) continuano a rappresentare la terapia di prima linea per indurre la remissione nel MC e nella RCU in fase di attività moderata o severa. La risposta clinica a questi farmaci è tuttavia estremamente variabile, e al momento non ci sono validi marcatori che permettano di predire quali saranno i pazienti che risponderanno in maniera adeguata e quali al contrario non risponderanno o andranno incontro a effetti collaterali. Dopo un ciclo iniziale con i GC, la terapia viene continuata con altri immunosoppressori, che negli ultimi anni vengono utilizzati sempre più precocemente, proprio per cercare di aumentare l’efficacia e di limitare le complicanze da steroidi. Tra gli immunosoppressori più utilizzati vi sono le tiopurine 6-MP e AZA: quest’ultima è la tiopurina più utilizzata nelle MICI pediatriche. Una prima parte della ricerca si è occupata di studiare retrospettivamente su pazienti pediatrici con MICI la farmacogenetica degli steroidi, con l’obiettivo di identificare marcatori che possano essere utili a predire la risposta clinica a questi farmaci. In parallelo, è stata analizzata la farmacogenetica e farmacocinetica dell’AZA, con lo scopo di ottimizzare il trattamento con questo farmaco in pazienti pediatrici con MICI, permettendo di aggiustare i dosaggi e di evitare trattamenti destinati all’insuccesso. La farmacogenetica degli steroidi è stata studiata su 154 pazienti con MICI che sono stati suddivisi in base alla risposta clinica in responders (84), dipendenti (55) e resistenti (15): è stato dimostrato un effetto significativo del polimorfismo BclI del gene NR3C1 che codifica per il recettore dei GC, e del polimorfismo Leu155His del gene NALP1, proteina coinvolta nell’attivazione della pro-IL-1 a IL-1, sulla risposta ai GC. Questa associazione è stata dimostrata mediante analisi univariate (responders vs non responders p=0.02) e multivariate (responders vs non responders p=0.03) e confermata anche esaminando il modello con l’analisi CART. Quest’analisi conferma il significativo effetto dei polimorfismi BclI e Leu155His sulla risposta ai GC con modalità indipendente, ed indica come altre importanti variabili il sesso e l’età all’esordio della malattia. In conclusione, i risultati ottenuti indicano che fattori genetici (polimorfismi BclI del gene NR3C1 e Leu155His del gene NALP1) e variabili cliniche (età all’esordio e sesso) potrebbero rappresentare degli importanti marker di risposta ai GC in pazienti pediatrici con MICI. Le correlazioni tra farmacocinetica e farmacogenetica dell’AZA sono state studiate in 77 pazienti pediatrici affetti da MICI, in trattamento con farmaci tiopurinici da almeno 3 mesi. I risultati ottenuti confermano un effetto del polimorfismo dell’enzima TPMT sui metaboliti attivi delle tiopurine in accordo con quanto riportato precedentemente in letteratura, confermando l’importante ruolo di questo enzima sul metabolismo dell’AZA. E’ stato inoltre dimostrato un effetto significativo dell’isoforma M dell’enzima GST sui metaboliti dell’AZA: soggetti con delezione del gene presentano una concentrazione più bassa dei metaboliti attivi 6-TGN (p=0.010) ed un rapporto TGN/dose più basso (p=0.0002): l’isoforma M dell’enzima GST è coinvolta nella conversione dell’AZA in 6-MP; nei soggetti deleti meno AZA verrebbe convertita in 6-MP a sua volta pro farmaco del metabolita attivo 6-TGN. Inoltre, le concentrazioni dei metaboliti metilati sono significativamente più alte nei pazienti con un genotipo variante per il polimorfismo C94A del gene ITPA rispetto ai pazienti con genotipo wild type (p=0.046), mentre non è evidente una correlazione con i metaboliti 6-TGN. Studi prospettici dovranno essere realizzati in futuro, per valutare l’efficacia di strategie di dosaggio dell’AZA basate sulla quantificazione dei metaboliti e sull’analisi dei polimorfismi degli enzimi TPMT, GST-M e ITPA per migliorare la risposta al farmaco e ridurre gli effetti avversi. E’ stato inoltre messo a punto un modello sperimentale in vitro su colture primarie di cellule mononucleate, su cui testare l’inibizione della proliferazione indotta da mitogeno sia dei GC che dell’AZA, attraverso il saggio d’incorporazione della timidina triziata. I dati ottenuti con il test in vitro sono stati poi correlati con la presenza di polimorfismi genetici degli enzimi coinvolti nella farmacogenetica di questi farmaci, con l’obiettivo di standardizzare una metodica che dovrebbe permettere di predire la risposta alla terapia prima di iniziare il trattamento. E’ stata osservata una maggiore sensibilità in vitro ai GC nei soggetti mutati per il polimorfismo BclI: questo SNP è risultato infatti essere associato ad una IC50 (concentrazione di farmaco che inibisce il 50% della proliferazione cellulare) più bassa, in confronto ai soggetti non mutati (p=0.0058). Questo risultato è confermato anche considerando l’Imax (l’inibizione della proliferazione cellulare alla concentrazione di farmaco più alta): soggetti con genotipo mutato per BclI presentano un’Imax più alta rispetto ai non mutati (p=0.0078). Sulla base di questi risultati, si conferma il ruolo importante del polimorfismo BclI nella risposta ai GC, già dimostrata nello studio retrospettivo, come marker genetico di risposta ai GC. Lo studio sulla sensibilità dell’AZA sui linfociti di volontari sani, non ha evidenziato correlazioni statististicamente significative tra i polimorfismi degli enzimi coinvolti nel metabolismo dell’AZA, e la sensibilità individuale a questo farmaco in vitro. Questa mancata correlazione, può derivare dal fatto che il metabolismo dell’AZA è principalmente di tipo epatico, e i linfociti probabilmente non rappresentano un buon modello per questo studio: esperimenti futuri riguarderanno l’utilizzo di linee cellulari epatiche, su cui verrà testata l’alterata sensibilità all’AZA e 6-MP, in condizioni di ipersespressione o silenziamento dei geni di nostro interesse, tra cui GST. Nel complesso, questa tesi ha sviluppato un set di valutazioni farmacologiche, integranti dati di farmacocinetica, farmacodinamica e farmacogenomica, da applicare all'ottimizzazione della terapia delle MICI pediatriche con steroidi ed AZA, in modo da aumentarne l'efficacia e ridurrne gli effetti avversi. I markers che sono risultati essere correlati ad un’alterata risposta a questi farmaci potrebbero essere utilizzati dal clinico per selezionare i pazienti responders dai non responders, e per trattare questi ultimi con associazioni di altri immunosoppressori in maniera precoce.XXIV Ciclo197

Role of Oxidative Stress Mediated by Glutathione-S-transferase in Thiopurines' Toxic Effects

Azathioprine (AZA), 6-mercaptopurine (6-MP), and 6-thioguanine (6-TG) are antimetabolite drugs, widely used as immunosuppressants and anticancer agents. Despite their proven efficacy, a high incidence of toxic effects in patients during standard-dose therapy is recorded. The aim of this study is to explain, from a mechanistic point of view, the clinical evidence showing a significant role of glutathione-S-transferase (GST)-M1 genotype on AZA toxicity in inflammatory bowel disease patients. To this aim, the human nontumor IHH and HCEC cell lines were chosen as predictive models of the hepatic and intestinal tissues, respectively. AZA, but not 6-MP and 6-TG, induced a concentration-dependent superoxide anion production that seemed dependent on GSH depletion. N-Acetylcysteine reduced the AZA antiproliferative effect in both cell lines, and GST-M1 overexpression increased both superoxide anion production and cytotoxicity, especially in transfected HCEC cells. In this study, an in vitro model to study thiopurines' metabolism has been set up and helped us to demonstrate, for the first time, a clear role of GST-M1 in modulating AZA cytotoxicity, with a close dependency on superoxide anion production. These results provide the molecular basis to shed light on the clinical evidence suggesting a role of GST-M1 genotype in influencing the toxic effects of AZA treatment

Long Noncoding RNA GAS5: A Novel Marker Involved in Glucocorticoid Response

Glucocorticoids (GCs) exert their effects through regulation of gene expression after activation in the cytoplasm of the glucocorticoid receptor (GR) encoded by NR3C1 gene. A negative feedback mechanism resulting in GR autoregulation has been demonstrated through the binding of the activated receptor to intragenic sequences called GRE-like elements, contained in GR gene. The long noncoding RNA growth arrest-specific transcript 5 (GAS5) interacts with the activated GR suppressing its transcriptional activity. The aim of this study was to evaluate the possible role of GAS5 and NR3C1 gene expression in the antiproliferative effect of methylprednisolone in peripheral blood mononuclear cells and to correlate the expression with individual sensitivity to GCs. Subjects being poor responders to GCs presented higher levels of GAS5 and NR3C1 in comparison with good responders. We suggest that abnormal levels of GAS5 may alter GC effectiveness, probably interfering with the mechanism of GR autoregulation

Glucocorticoid pharmacogenetics in pediatric idiopathic nephrotic syndrome

Idiopathic nephrotic syndrome represents the most common type of primary glomerular disease in children: glucocorticoids (GCs) are the first-line therapy, even if considerable interindividual differences in thepir efficacy and side effects have been reported. Immunosuppressive and anti-inflammatory effects of these drugs are mainly due to the GC-mediated transcription regulation of pro- and anti-inflammatory genes. This mechanism of action is the result of a complex multistep pathway that involves the glucocorticoid receptor and several other proteins, encoded by polymorphic genes. Aim of this review is to highlight the current knowledge on genetic variants that could affect GC response, particularly focusing on children with idiopathic nephrotic syndrome

Reti di imprese nell'industria orafa italiana: il caso del distretto campano

L’industria orafa ha una lunga tradizione ed un ruolo importante per l’economia italiana. Il settore è organizzato secondo la configurazione produttiva del distretto industriale. Con riferimento al distretto orafo campano, il presente lavoro ha il duplice obiettivo di individuare i fattori che spingono le imprese ad associarsi nel Tarì, il principale consorzio del distretto, ed i benefici che ne derivano. L’analisi empirica indica che le imprese aderenti al Tarì hanno una maggiore dimensione e una maggiore incidenza dei costi sul totale della produzione rispetto alle altre imprese. Il principale beneficio dalla partecipazione al consorzio invece riguarda la riduzione dei costi di produzione, con particolare riferimento ai costi per i servizi. Non emergono invece vantaggi in termini di crescita del fatturato. Alcune indicazioni per i policy makers regionali attivi nel settore orafo sono discusse nelle conclusioni

Speed of spending and government decentralization: Evidence from Italy

This paper investigates whether government decentralization affects the duration of public projects in Italy. Considering a large sample of 415,378 projects managed by different levels of government and co-funded by European funds within the 2007-13 programming period, we found strong differences between areas. In the South and in some Central regions, project duration was higher for the lowest level of government and lower at more centralized levels. This suggests that decentralization there reduced the speed of public spending and therefore spending efficiency. In the North and in most Central regions, the results were mixed. These regional differences were driven by the quality of local institutions